LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Văn Rực, Phó trưởng bộ môn Y sinh học – Di truyền, Đại học Y Hà Nội, người thầy trực tiếp hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ngô Giang Liên người đã tận tình góp ý cũng như động viên, cổ vũ tinh thần cho tôi trong quá trình làm luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các kỹ thuật viên tại Bộ môn Y sinh học – Di truyền, Đại học Y Hà Nội đã chỉ bảo, động viên, tạo điều kiện tốt và giúp đỡ tôi hoàn thành bản luận văn này. Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Tế bào – Mô phôi, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi hoàn thành bản luận văn này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình và bạn bè những người đã luôn động viên, khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập để tôi hoàn thành được bản luận văn này. Hà Nội, tháng 11 năm 2011 Tác giả DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BrdU: Bromodeoxyuridin ISCN: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature PHA: Phytohemagglutinin cs : Cộng sự NST: Nhiễm sắc thể MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3 1.1. Lược sử nghiên cứu về nhiễm sắc thể người 3 1.2. Tiêu chuẩn và qui định quốc tế về đặc điểm bộ nhiễm sắc thể người. 5 1.2.1. Tiêu chuẩn để xếp loại nhiễm sắc thể trong lập karyotype. 5 1.2.2. Phân loại nhiễm sắc thể 5 1.2.3. Các rối loạn về bộ nhiễm sắc thể người 6 1.2.3.1. Rối loạn số lượng 6 1.2.3.2. Rối loạn cấu trúc nhiễm sắc thể 8 1.3. Tình hình nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể ở những cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh trên thế giới 12 1.3.1. Tần số rối loạn nhiễm sắc thể trong những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh 12 1.3.2. Tần số rối loạn nhiễm sắc thể giữa người bố hoặc người mẹ ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh 14 1.3.3. Tần số các kiểu chuyển đoạn nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai và sinh con bị dị tật 15 1.3.3.1. Tần số giữa chuyển đoạn tương hỗ và chuyển đoạn hòa hợp tâm . 16 1.3.3.2. Tần số các kiểu rối loạn khác ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. 19 1.4. Tình hình nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh ở Việt Nam 20 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. Đối tượng nghiên cứu. 23 2.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 23 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu. 23 2.2.1. Lập hồ sơ bệnh án di truyền 23 2.2.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi để thu hoạch cụm kỳ giữa, phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotype. 24 2.2.2.1. Nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi theo phương pháp của Hungerford D.A. (1965). 24 2.2.2.2. Thu hoạch tế bào 24 2.2.2.3. Phương pháp nhuộm băng theo Seabright M (1971) . 25 2.2.2.4. Phương pháp phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotype: theo tiêu chuẩn ISCN (2005) . 26 2.2.3. Xử lý số liệu 27 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 3.1. Tuổi của các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh . 28 3.2. Nghề nghiệp của các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh 30 3.3. Biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh 32 3.4. Biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể giữa người vợ và người chồng ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. 35 3.5. Các biểu hiện về rối loạn nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. 36 3.6. Các kiểu chuyển đoạn nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh 42 3.6.1. Sự chuyển đoạn tương hỗ giữa các nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng mang nhiễm sắc thể chuyển đoạn 45 3.6.2. Sự phân bố các kiểu chuyển đoạn hòa hợp tâm giữa các nhóm 48 3.7. Sự phân bố các kiểu rối loạn về số lượng nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Tiếng Việt 59 Tiếng Anh 60 Tiếng Pháp 66 DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Sự phân bố theo tuổi của các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. 28 Bảng 2. Sự phân bố về nghề nghiệp ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. 31 Bảng 3. Bảng thống kê tỷ lệ rối loạn NST ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh của một số tác giả. 34 Bảng 4. Sự phân bố các kiểu rối loạn cấu trúc NST ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. 37 Bảng 5. Sự phân bố các kiểu chuyển đoạn NST. 42 Bảng 6. Bảng thống kê tỷ lệ chuyển đoạn NST ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. 43 Bảng 7. Sự phân bố các kiểu karyotype về sự chuyển đoạn tương hỗ. 45 Bảng 8. Sự phân bố các kiểu chuyển đoạn hòa hợp tâm giữa các nhóm. 48 Bảng 9. Sự phân bố các kiểu chuyển đoạn giữa các NST trong các nhóm 50 Bảng 10. Sự phân bố các rối loạn xảy ra ở cặp NST giới tính ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. 55 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Sơ đồ hình thành giao tử và hợp tử ở người mang chuyển đoạn tương hỗ giữa NST số 3 và NST số 21. 9 Hình 2. Sơ đồ hình thành giao tử và hợp tử của người mang chuyển đoạn hòa hợp tâm t(14q;21q). 10 Hình 3. Sơ đồ hình thành giao tử và hợp tử của người mang chuyển đoạn hòa hợp tâm t(21q;21q). 11 Hình 4. Tỷ lệ rối loạn NST ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. 32 Hình 5. Tỷ lệ rối loạn NST giữa người vợ và người chồng ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. 35 Hình 6. Karyotype của bệnh nhân Nguyễn T Thu Tr. 46 ,XX del(18)(q21) 39 Hình 7. Karyotype của bệnh nhân Nguyễn Thanh T. 46,XX,inv(9)(p13q13) 41 Hình 8. Karyotype của bệnh nhân Lê Đức T. 46,XY,t(1;5)(q44;q15) 47 Hình 9: Karyotype của bệnh nhân Đặng Thị Anh D. 45,XX,t(13q;14q) 52 Hình 10. Karyotype của bệnh nhân Đinh Thị Kim D. 45,XX,t(14q;21q) 53 Hình 11. Karyotype của bệnh nhân Nguyễn T Thanh T. 45,XX,t(21q;21q) 54 Hình 12. Karyotype của bệnh nhân Trương Thị Ng. 47,XXX/46,XX 57 1 MỞ ĐẦU Năm 1956 Tijo và Levan là người đầu tiên đã nuôi cấy tế bào thai người và gây sốc nhược trương để làm cho các NST (NST) dàn đều trên tiêu bản đã phát hiện chính xác số lượng NST của người là 46 chiếc gồm 23 cặp, trong đó 22 cặp NST thường và 1 cặp NST giới tính (ở người nữ là XX, ở người nam là XY). Từ đó đến nay, NST của người luôn là đề tài nghiên cứu của các nhà di truyền học trên nhiều đối tượng và các bệnh lý lâm sàng khác nhau. Những năm gần đây các phương pháp nuôi cấy mô và các kỹ thuật nhuộm tiêu bản ngày càng phát triển và được cải tiến không ngừng, đặc biệt là kỹ thuật nhuộm băng G (GTG) đã cho phép các nhà di truyền học phát hiện được chính xác từng chiếc NST và những rối loạn cấu trúc của NST như mất đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn, đảo đoạn… Ở những cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh có thể do nhiều nguyên nhân như nhiễm trùng, hocmon, các bệnh mãn tính, bất thường tử cung, bất thường NST… Đặc biệt đối với thai sảy sớm (dưới 3 tháng trong thời kỳ mang thai) thì phôi thai mang bất thường NST đóng vai trò chủ yếu [11]. Trường hợp này nguyên nhân có thể do bố hoặc mẹ mang rối loạn NST cân bằng dẫn đến không phân ly NST ở các cặp NST nào đó tạo nên những giao tử bất thường và nguy cơ mang thai bất thường cao có thể chết trong thời kỳ bào thai hoặc sinh ra những đứa trẻ dị tật bẩm sinh. Ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh ra con bị dị tật bẩm sinh sẽ tạo gánh nặng về tâm lý và kinh tế cho bệnh nhân, gia đình bệnh nhân và xã hội. Xét nghiệm và phân tích NST ở những cặp vợ chồng này nhằm tìm ra nguyên nhân gây sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh đồng thời đưa ra lời khuyên di truyền góp phần chăm sóc sức khỏe sinh sản ở cộng đồng và xã hội. 2 Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu NST và những báo cáo về những cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh mang rối loạn NST cân bằng như chuyển đoạn, lặp đoạn, đảo đoạn… Ở Việt Nam trong những năm gần đây đã có nhiều phòng xét nghiệm di truyền tế bào như Viện nhi Trung ương, Viện Sản Trung ương, phòng Di truyền tế bào bệnh viện Từ Dũ, bộ môn Y Sinh học – Di truyền trường Đại học Y Hà Nội làm xét nghiệm và phân tích NST ở những cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh góp phần trong chẩn đoán và đưa ra những lời khuyên di truyền. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân tích bộ nhiễm sắc thể (karyotype) ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh” nhằm mục tiêu: Phát hiện các trường hợp rối loạn NST ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. 3 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. Lược sử nghiên cứu về nhiễm sắc thể người Bộ NST người là đối tượng chính trong các nghiên cứu tế bào di truyền học loài người. Các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu NST người từ cuối thế kỷ XIX và được đánh dấu bằng công trình mở đầu của Walther Flemming (1882) [26]. Ông đã quan sát NST của người ở các kỳ phân bào trên tiêu bản tươi, cắt mảnh lấy từ tinh hoàn. Trong thời gian đó, NST của người là vấn đề được các nhà di truyền học quan tâm, nghiên cứu và cũng là đề tài được đem ra tranh luận nhiều lần. Tuy nhiên ở thời kỳ ấy do những hạn chế về kỹ thuật làm tiêu bản, mẫu vật không đáp ứng và không phù hợp cho việc nghiên cứu chi tiết NST. Ở người, số lượng NST nhiều, kích thước nhỏ và thường tập trung thành từng đám, với những kỹ thuật cắt mảnh, cố định và nhuộm thông thường, các nhà di truyền tế bào chưa thể đếm chính xác nên đã cho rằng trong nhân của tế bào người có 48 NST, gồm 23 cặp NST thường và 1 cặp NST giới tính (Winiwarter. V, 1912; Painter, T.S, 1923; Levitsky, G.A, 1924) [48,58,75]. Những năm thuộc thập kỉ 50 của thế kỉ XX có những phát hiện quan trọng khai sinh ra chuyên ngành di truyền tế bào người, bằng việc xử lý tế bào bằng sốc nhược trương của Hsu, T.C (1952), Ford, C.E và Hamerton, J.L (1956) tiền xử lý tế bào nuôi cấy bằng colchicine để tích lũy nhiều cụm kì giữa. Công trình của Tjio, J.H và Levan (1956) kết hợp xử lý nhược trương và colchicine đã công bố nghiên cứu xác định lại bộ NST 2n của người là 46 NST chứ không phải là 48 NST và công trình này đã được Ford và Hamerton khẳng định [28]. Từ năm 1956 có nhiều phòng thí nghiệm tế bào di truyền được xây dựng để nghiên cứu NST. Các công trình đầu tiên công bố các rối loạn NST liên quan với bệnh là công trình của Lejeune (1958-1959) về hội chứng Down do thừa một NST 21 dạng trisomi 21, hội chứng Turner do tế bào cơ thể chỉ có 45 NST dạng 45,X 4 thiếu một NST giới tính X (Ford, 1959), hội chứng Klinefelter ở nam với 47 NST trong đó có ba NST giới XXY (Jacobs và Strong, 1959) [40]. Từ năm 1956 đến năm 1960 là thời kỳ còn khó khăn của nghiên cứu tế bào di truyền học người các nghiên cứu đều mới chỉ phân biệt được các rối loạn số lượng và rối loạn cấu trúc lớn gây bất thường ở người do mới chỉ sử dụng phương pháp nhuộm bình thường bằng Giemsa, nhuộm đồng đều các NST. Năm 1960, Moorhead và cs công bố phương pháp làm tiêu bản NST từ lympho bào nuôi cấy ngắn hạn với việc dùng PHA (phytohemagglutinin) để kích thích phân bào[53]. Năm 1960, Nowell và Hungerford đã mô tả NST Philadelphia (mất đoạn nhánh dài của NST 22) trong bệnh bạch cầu thể tủy mãn tính (Chronic myeloid leukemia) [57]. Năm 1963, hội chứng mèo kêu, một hội chứng do bị mất đoạn nhánh ngắn của NST số 5 (5p - ), lần đầu tiền được phát hiện bởi Lejeune và cs [74]. Từ năm 1968 đến năm 1970, là sự ra đời của các kỹ thuật nhuộm băng cho phép các nhà di truyền học đánh giá chính xác tới từng chiếc NST trong bộ NST và phát hiện rối loạn cấu trúc NST. Từ sau 1970 trở đi, lần lượt với các kỹ thuật nhuộm băng Q, băng G, băng R, băng C, băng T, N và nhuộm băng có độ phân giải cao NST, dùng BrdU (Bromodeoxyuridin) gắn vào ADN trên NST và nhuộm phân biệt chromatit chị em đã mở ra thời kỳ phát triển mạnh mẽ của tế bào di truyền học người ứng dụng các kỹ thuật băng để phát hiện các bất thường tinh tế đặc trưng trên từng NST ứng với các bệnh, tật, các hội chứng trong lâm sàng. Từ năm 1980 đặc biệt là sau năm 1985 là thời kỳ phát triển mạnh mẽ, vượt bậc của di truyền tế bào lâm sàng và di truyền phân tử ứng dụng trong nghiên cứu bộ gen loài người. Trong di truyền tế bào lâm sàng thì việc nghiên cứu NST chủ yếu vẫn áp dụng các phương pháp nhuộm băng NST. [...]... thai liên ti p và sinh con b d t t b m sinh Trong t ng s 350 c p v ch ng có ti n s s y thai liên ti p và sinh con b d t t b m sinh ã ư c xét nghi m, phân tích NST và l p karyotype bao g m: cán b viên ch c (CBVC), công nhân, làm ru ng, b ngh nghi p c a các c p v ch ng ư c trình bày Nguy n Văn R c phân tích i, lao ng t do S phân b v b ng 2 c i m karyotype c a nh ng c p v ch ng s y thai liên ti p và sinh. .. thai liên ti p và sinh con b d t t b m sinh Nguy n Văn R c [6] ã phân tích NST ngư i v có tu i th p nh t là 23, cao nh t là 39 và trung bình là 29,79 ± 2,6; tu i c a ngư i ch ng th p nh t là 25, cao nh t là 50 và trung bình là 33,36 ± 4,2 Nhìn chung theo th ng kê c a nhi u tác gi trên th gi i và Vi t Nam thì c p v ch ng s y thai liên ti p và sinh con b d t t b m sinh tu i c a các u n m trong tu i sinh. .. và cs ã phân tích NST c a 210 c p v ch ng có ti n s khó khăn v sinh Các tác gi cũng a tìm th y 19 (chi m t l 4,52%) th kh m v i r i lo n NST X và Y [51] 1.4 Tình hình nghiên c u b nhi m s c th nh ng c p v ch ng s y thai liên ti p và sinh con b d t t b m sinh Vi t Nam Năm 2002 Nguy n Văn R c và cs s d ng phương pháp nhu m băng G ã phân tích NST k t qu 30 c p v ch ng s y thai liên ti p và sinh con b d... v ch ng s y thai liên ti p và sinh con b d t t b m sinh Năm 1981 Claude Stoll ã phân tích NST c a 122 c p v ch ng có ti n s s y thai liên ti p t ba l n tr lên S d ng phương pháp nhu m băng R các tác gi ã phát hi n 5 ngư i n và 1 ngư i nam mang chuy n o n NST t(2;17), t(5;9), t(11;12),t(17;22) và t(13q14q) [20] Năm 1983 A.Lippman-Hand ã phân tích NST c a 177 c p v ch ng có ti n s s y thai liên ti p t... Khoa s n b nh vi n B ch Mai… ã g i truy n, trư ng n b môn Y sinh h c – Di i h c Y Hà N i yêu c u xét nghi m NST, phân tích và l p karyotype, chúng tôi thu ư c k t qu như sau: 3.1 Tu i c a các c p v ch ng s y thai liên ti p và sinh con b d t t b m sinh T ng s 350 c p v ch ng (700 trư ng h p) có ti n s s y thai liên ti p và sinh con b d t t b m sinh Trong ó: - Tu i c a ngư i v th p nh t là 19 tu i, cao... Fryns và cs (1984) ã phân tích NST trong 1068 c p v i ti n s s y thai liên ti p và sinh ra con b d t t b m sinh Các tác gi ã phát hi n trong s nh ng ngư i mang NST chuy n o n thì chuy n o n hòa h p tâm x y ra nam còn chuy n o n tương h thì ngư c l i x y ra nam cao hơn n cao hơn n [41] Phân tích NST c a 391 c p v ch ng sinh con m c b nh Down Stoll.C và cs (1998) ã phát hi n ư c 7 c p b m (5 ngư i m và. .. ng 1 S phân b theo tu i c a các c p v ch ng s y thai liên ti p và sinh con b d t t b m sinh V Tu i Ch ng S lư ng (n) T l (%) S lư ng (n) T l (%) ≤ 20 6 1,71 0 0 20 – 30 237 67,72 145 41,43 30 – 40 107 30,57 172 49,14 > 40 0 0 33 9,43 T ng 350 100 350 100 Trong m t s nghiên c u c a các tác gi trư c trên th gi i khi phân tích karyotype nh ng c p v ch ng s y thai liên ti p và sinh con b d t t b m sinh 28... th các c p v ch ng s y thai và sinh con b d t t Chuy n o n NST ư c ghi nh n là ki u r i lo n c u trúc NST hay g p nh t nh ng c p v ch ng có ti n s s y thai liên ti p giai o n s m và sinh con b d t t b m sinh [64] Phân tích NST trên 136 c p v ch ng v i ti n s s y thai 2 l n tr lên U Diedrich và cs (1983) ã ch ra r ng chuy n o n c a NST s 1,7 ho c 22 thì có nhi u kh năng d n n s y thai Trong khi ó chuy... hai nhánh và cách u tâm, i hình thái o o n quanh tâm không i x ng: hai ch u nhau, NST có c u trúc l i và thay 1.3 Tình hình nghiên c u b nhi m s c th t hai nhánh, kho ng cách i hình thái nh ng c p v ch ng có ti n s s y thai liên ti p và sinh con b d t t b m sinh trên th gi i 1.3.1 T n s r i lo n nhi m s c th trong nh ng c p v ch ng s y thai liên ti p và sinh con b d t t b m sinh U Diedrich và cs (1983)... chuy n o n tương h và chuy n o n hòa h p tâm Năm 1984 J.P Fryns và cs ã báo cáo k t qu phân tích NST trong 1068 c p v i ti n s s y thai liên ti p và sinh ra con b d t t b m sinh Có 33 trư ng h p mang chuy n o n tương h (chi m t l 3,09%) và 20 trư ng h p mang chuy n o n hòa h p tâm (chi m t l 1,87%) [41] Mauro Campana và cs (năm 1986) nghiên c u 5445 c p v ch ng có s y thai t nhiên liên ti p K t qu 5% . loạn nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. 36 3.6. Các kiểu chuyển đoạn nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật. ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. 32 Hình 5. Tỷ lệ rối loạn NST giữa người vợ và người chồng ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị. sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh 32 3.4. Biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể giữa người vợ và người chồng ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh.