40 540 bp sản phẩm PCR 1000 bp 500 bp 100 bp Sản phẩm phụ của phản ứng PCR đơn vị 5,8S) và các gen mã hóa cho tiểu đơn vị lớn rRNA. Vùng ITS rất hữu ích cho những nghiên cứu về đặc điểm phân tử của nấm (Bridge P.D. và Arora. D.K., 2000). Cặp primer ITS A và ITS B được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của sinh vật eukaryote có khả năng khuếch đại vùng DNA có khả năng biến đổi nằm giữa đầu 3’ của rDNA 18S và đầu 5’ của rDNA 28S, vùng này bao gồm cả gen rDNA 5,8S được nằm chồng qua bởi hai vùng ITS (ITS 1 và ITS 2) (Silva và cộng sự, 1998). Những primer này khuếch đại hữu hiệu một đoạn DNA duy nhất từ DNA hệ gen của nấm. Kích thước của đoạn DNA khuếch đại được là 540 bp (hình 4.7). Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR một số mẫu nấm C. cassiicola. Ghi chú: L1: DNA ladder L2: MT/C/5. L3: RRIV 2 L4: RRIV4 L5: AC 88 L6: LH 83/152 Phản ứng PCR được thực hiện theo quy trình của Silva và các cộng sự (1998). Hình 4.7 cho thấy, sử dụng quy trình trên đã cho phép khuếch đại được vùng ITS mong muốn. Tuy nhiên, kết quả điện di trên gel agarose cũng cho thấy ngoài sản phẩm chính còn có các sản phẩm phụ không mong muốn. Sản phẩm PCR có sản phẩm phụ có thể là do một số nguyên nhân như primer quá nhiều, thời gian của bước kéo dài kéo dài hơn mức cần thiết, lượng DNA khuôn mẫu sử dụng nhiều cũng làm xuất hiện sản 41 phẩm phụ, và phản ứng có quá nhiều chu kỳ. Trong điều kiện cho phép chúng tôi đã thay đổi lượng primer sử dụng và đã thu nhận được sản phẩm PCR đặc hiệu hơn như hình 4.8. Tuy nhiên, ngoài yếu tố primer chúng tôi cũng đã kiểm tra các yếu tố khác có ảnh hưởng như thế nào đến sự khuếch đại một đoạn DNA trong vùng ITS của nấm C. cassiicola. Kết quả cho thấy các yếu tố khác không tạo ra sự ảnh hưởng đáng kể nào lên sản phẩm PCR tạo thành và chúng tôi không đưa ra thảo luận ở đây. Hình 4.8: Sản phẩm PCR thu nhận đƣợc sau khi giảm lƣợng primer dùng trong phản ứng PCR. L1: MT/C/5. L2: RRIV 2 L3: RRIV4 L4: AC 88 L5: LH 83/152 L6: LH 82/008 L7: LH 83/152. Sản phẩm PCR của 7 mẫu phân lập được kiểm tra kích thước và so sánh với các đối chứng dương khác (sử dụng quy trình tương tự để khuếch đại vùng ITS của nấm Beauveria bassiana và Metarhizum anisopliae) (hình 4.9). Qua hình 4.9, chúng tôi nhận thấy, phản ứng PCR với cặp primer ITS A và ITS B cũng có khả năng khuếch đại được vùng ITS của nấm Beauveria bassiana và Metarhizum anisopliae. Điều này là hợp lý vì cặp primer này được thiết kế cho vùng bảo tồn ITS, và hầu hết các nấm đều có vùng này. Theo chúng tôi, nếu sử dụng kỹ thuật này để chẩn đoán bệnh rụng lá Corynespora do nấm C. cassiicola gây ra dựa trên sản phẩm khuếch đại của vùng ITS 1, ITS 2 bằng cặp primer ITS A và ITS B là không hiệu quả, vì sản phẩm PCR thu được có kích 42 thước giống nhau (540 bp) ở các loài nấm khác, điều này không cho phép nhận dạng nấm C. cassiicola dựa trên sản phẩm khuếch đại của vùng ITS1, ITS2. Hình 4.9: Kiểm tra kích thƣớc sản phẩm PCR của nấm C. cassiicola và so sánh với sản phẩm PCR của nấm Beauveria bassiana và Metarhizum anisopliae . L1: DNA ladder L2: MT/C/5 L3: RRIV2 L4: RRIV4 L5: AC 88 L6: RO/CM/10 L7: LH 82/152 L8: LH 82/008 L9: Beauveria bassiana L10: Metarhizum anisopliae L11: Đối chứng âm Ghi chú: Hai nguồn nấm Beauveria bassiana và Metarhizum anisopliae do Bộ môn BVTV – Khoa Nông Học, Đại học Nông Lâm TP.HCM cung cấp. Kết quả này cũng cho thấy cần phải tìm ra một vị trí khác trên DNA hệ gen đặc trưng hơn cho C. cassiicola, để việc chẩn đoán bệnh do C. cassiicola gây ra nhanh chóng và chính xác hơn. Việc nghiên cứu về gen mã hóa cho protein độc tố cassiicoline có thể giúp giải quyết được vấn đề này. Đây có thể là hướng đi sẽ được nhiều phòng thí nghiệm lựa chọn trong tương lai. 4.4 Phân tích đa dạng vùng ITS của nấm C. cassiicola RFLP là một kỹ thuật mới được ứng dụng rộng rãi trong phân tích đa dạng di truyền. Trong kỹ thuật này chủ yếu ứng dụng các enzyme cắt giới hạn nhằm phân cắt một đoạn DNA hoặc cả hệ gen của một sinh vật nào đó. Nếu hai sinh vật có sự giống nhau về mặt di truyền khi phân cắt bằng RE sẽ tạo thành những đoạn DNA có kích thước giống nhau, số đoạn DNA tạo thành cũng giống nhau. Phương pháp RFLP 500 bp 540 bp 43 nguyên bản đòi hỏi phải trải qua giai đoạn Southern blot. Do vậy, trong phân tích đa dạng di truyền của các loài nấm, đặc biệt là phân tích đa dạng di truyền trong cùng loài, phương pháp RFLP – PCR được ứng dụng phổ biến hơn. Kỹ thuật này có nghĩa là sử dụng các RE để phân cắt sản phẩm PCR một đoạn gen hay một đoạn DNA nào đó, không trải qua giai đoạn southern blot. Sau khi phân cắt bằng các RE, sản phẩm sẽ được phân tích bằng cách điện di trên gel để xem xét có hay không có sự đa hình kích thước của các đoạn DNA tạo thành. Kỹ thuật này đơn giản hơn kỹ thuật RFLP thông thường. Hiện nay, RFLP – PCR được ứng dụng nhiều trong phân loại, nhất là phân loại ở mức độ dưới loài (đã ứng dụng thành công đối với nấm Verticilium, Rhizoctonia và Fusarium) (Bridge P.D. và Arora. D.K., 2000). Do sản phẩm PCR tương đối đặc hiệu nên được sử dụng trực tiếp vào phân tích RFLP mà không cần phải tinh sạch. Sản phẩm PCR của nấm C. cassiicola được phân cắt riêng rẽ bằng các enzyme cắt giới hạn CfoI, EcoRI, MspI, HaeIII, RsaI, Sau3AI. Sản phẩm tạo thành được phân tích bằng cách điện di trên gel agarose. Chúng tôi nhận thấy mỗi enzyme đều tạo ra các sản phẩm giống nhau ở tất cả các mẫu khảo sát (hình 4.10, hình 4.11, hình 4.12, hình 4.13, hình 4.14, hình 4.15). Hình 4.10: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme EcoRI. L1: DNA ladder L5: AC 88 L2: MT/C/5 L6: RO/CM/10 L3: RRIV2 L7: LH 82/152 L4: RRIV4 L8: LH 82/008 300 bp 200 bp 44 Hình 4.11: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme MspI. Ghi chú: L1: DNA ladder L2: MT/C/5 L3: RRIV2 L4: RRIV4 L5: AC 88 L6: RO/CM/10 L7: LH 82/152 L8: LH 82/008 Hình 4.12: Phân cắt sản phẩm PCR bởi enzyme CfoI. Ghi chú L1: DNA ladder L2: MT/C/5 L3: RRIV2 L4: RRIV4 L5: AC 88 L6: RO/CM/10 L7: LH 82/152 L8: LH 82/008 300 bp 100 bp Sản phẩm PCR cắt không hoàn toàn 400 bp 100 bp 45 Hình 4.13: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme RsaI. Ghi chú: L1: DNA ladder L2: MT/C/5 L3: RRIV2 L4: RRIV4 L5: AC 88 L6: RO/CM/10 L7: LH 82/152 L8: LH 82/008 L9: sản phẩm PCR trƣớc khi cắt. Hình 4.14: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme HaeIII. L1: DNA ladder L2: MT/C/5 L3: RRIV2 L4: RRIV4 L5: AC 88 L6: RO/CM/10 L7: LH 82/152 L8: LH 82/008 400 bp 100 bp 400 bp 100 bp Hình 4.15: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme Sau3AI. Ghi chú: L1: DNA ladder L2: MT/C/5 L3: RRIV2 L4: RRIV4 L5: AC 88 L6: RO/CM/10 L7: LH 82/152 L8: LH 82/008 L9: Sản phẩm PCR khi chƣa cắt 300 bp 100 bp Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi cắt bằng enzyme EcoRI, chúng tôi thu được hai đoạn DNA có kích thước khoảng 240 bp và 300 bp. Sự phân cắt bằng enzyme HaeIII tạo thành hai đoạn DNA có kích thước khoảng 390 bp và 160 bp. Những kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trước đây của Silva và cộng sự (1998), Safiah và cộng sự (2003). Sự phân cắt bằng RE khi điện di trên gel agarose cho phép ước lượng kích thước của những đoạn DNA tạo thành dựa vào thang DNA chuẩn. Tuy nhiên, chúng tôi không thể so sánh những kết quả mà chúng tôi thu nhận được khi cắt sản phẩm PCR bằng những enzyme khác với những kết quả nghiên cứu trước đây trên thế giới do không có số liệu và những nghiên cứu ở mức độ phân tử của nấm C. cassiicola hiện nay chưa nhiều. Trong thí nghiệm của chúng tôi, hầu hết các RE được sử dụng chỉ tìm thấy một vị trí cắt ngoại trừ enzyme CfoI có thể có đến 3 vị trí cắt khác nhau. Kết quả điện di cho thấy, khi cắt bằng CfoI chỉ thu nhận được 2 đoạn DNA, một đoạn có kích thước khoảng 300 bp, một đoạn có kích thước khoảng 100 bp. Điều đó có nghĩa là ngoài 2 đoạn DNA đó còn có những đoạn DNA khác không thể quan sát được, có thể do nguyên nhân sau: lượng DNA quá ít, nhuộm bằng ethidium bromide không cho phép nhận biết sự có mặt của đoạn DNA này. Ngoài enzyme CfoI, khi phân cắt bằng enzyme Sau3AI, các đoạn DNA vừa tạo thành có tổng kích thước không bằng kích thước của sản phẩm PCR, điều này được giải thích tương tự như trường hợp xảy ra với enzyme CfoI. Mặc dù các mẫu phân tích có biểu hiện triệu chứng khác nhau trên lá cao su, nhưng khi phân tích đa hình vùng ITS bằng các enzyme cắt giới hạn không nhận thấy bất cứ sự khác biệt nào ở vị trí cắt của các enzyme đã sử dụng. Các mẫu thu nhận ở 2 khu vực khác nhau cũng cho kết quả giống nhau khi phân cắt bằng các enzyme cắt giới hạn. Tuy nhiên, số lượng mẫu phân tích còn ít nên chưa thể đánh giá có hay không có sự đa dạng di truyền trong quần thể nấm C. cassiicola trên các dvt cao su ở Việt Nam. Mặt khác, có thể những mẫu trên có thể có sự khác biệt trong trình tự nucleotide, nhưng những khác biệt này không xảy ra ngay vị trí cắt của các enzyme cắt, phân tích bằng các enzyme cắt không phát hiện được sự sai khác. Kết quả phân tích vùng ITS bằng 6 RE đều không phát hiện bất cứ sự khác biệt nào. Các mẫu nấm mà chúng tôi phân tích có thể cùng thuộc một chủng nấm C. cassiicola và đây có thể là chủng nấm C. cassiicola duy nhất gây bệnh trên cây cao su ở Việt Nam hiện nay. Tuy nhiên, để có thể đi đến những kết luận chính xác hơn cần phải nghiên cứu trên số lượng lớn các mẫu nấm C. cassiicola. PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su hiện nay có biểu hiện triệu chứng bệnh rất khác nhau, mức độ bệnh tùy theo tính mẫn cảm của từng dvt cao su khác nhau. Việc này làm cho việc kiểm soát tình hình bệnh trở nên khó khăn. Việc nghiên cứu về tác nhân gây bệnh C. cassiicola phần nào giúp cho chiến lược quản lý tình hình bệnh trở nên dễ dàng hơn. Qua nghiên cứu về một số mẫu bệnh do tác nhân C. cassiicola gây ra chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau. Quy trình thực hiện phản ứng PCR nhằm khuếch đại vùng ITS của nấm C. cassiicola đã được ứng dụng ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới có thể được sử dụng để nghiên cứu nấm C. cassiicola ở Việt Nam. Việc ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su với cặp primer ITS A và ITS B là không hiệu quả do kích thước của đoạn DNA khuếch đại được không đặc hiệu so với các nấm khác. Phân tích sản phẩm khuếch đại vùng ITS của các mẫu nấm trên các dvt cao su khác nhau, có triệu chứng bệnh khác nhau bằng các enzyme cắt giới hạn không nhận thấy bất cứ sự khác biệt nào ở kích thước của đoạn DNA tạo thành. Các mẫu nấm là giống nhau khi phân tích RFLP sản phẩm PCR vùng ITS. Các mẫu nấm nghiên cứu có thể cùng thuộc một chủng và đây có thể là chủng C. cassiicola duy nhất gây bệnh cho cây cao su ở Việt Nam hiện nay. 5.2. Đề nghị Những dvt cao su mới lai tạo ở Việt Nam biểu hiện mức độ bệnh rất khác nhau (Nguyễn Ngọc Mai, 2005). Những nghiên cứu khác trên thế giới cho thấy giữa các dòng nấm C. cassiicola trên cây cao su có sự phân hóa di truyền (Safia và cộng sự, 2003 ). Do vậy, chúng tôi đưa ra một số đề xuất sau. Tăng số lượng mẫu kiểm tra để kết quả phân tích mang tính khái quát hơn. Cần có những nghiên cứu cụ thể hơn về đặc điểm sinh trưởng, phát triển cũng như tính độc của nấm C. cassiicola trên cây cao su kết hợp với ứng dụng kỹ thuật RAPD – PCR để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm C. cassiicola trên cây cao su ở Việt Nam, đồng thời xác định mối quan hệ giữa tính kháng của các dvt cao su lai tạo trong nước với những khác biệt về di truyền của nấm C. cassiicola. Điều này sẽ có lợi cho công tác tạo giống kháng và công tác quản lý bệnh. Tiến tới giải trình tự vùng ITS để xác định mức độ biến dị trong vùng ITS của nấm C. cassiicola Việt Nam so với các dòng nấm C. cassiicola khác đã giải trình tự trên thế giới, xác định vị trí phân loại C. cassiicola Việt Nam trong cây phân loại nấm C. cassiicola. Để hướng tới tạo giống cao su kháng bệnh rụng lá Corynespora cần nghiên cứu đa hình gen kháng C. cassiicola trên cây cao su, việc này giúp chọn nhanh dvt có khả năng kháng C. cassiicola và cũng là cơ sở để thực hiện lai tạo những dvt mới có khả năng kháng bệnh. . cũng như tính độc của nấm C. cassiicola trên cây cao su kết hợp với ứng dụng kỹ thuật RAPD – PCR để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm C. cassiicola trên cây cao su ở Việt Nam, đồng thời. 4.1 1: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme MspI. Ghi ch : L 1: DNA ladder L 2: MT/C/5 L 3: RRIV2 L 4: RRIV4 L 5: AC 88 L 6: RO/CM/10 L 7: LH 82/152 L 8: LH 82/008 Hình 4.1 2: Phân cắt sản phẩm PCR. Hình 4.1 3: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme RsaI. Ghi ch : L 1: DNA ladder L 2: MT/C/5 L 3: RRIV2 L 4: RRIV4 L 5: AC 88 L 6: RO/CM/10 L 7: LH 82/152 L 8: LH 82/008 L 9: sản phẩm PCR trƣớc