19 3.3.2. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu - Dùng muỗng vô trùng lấy phần giữa cục phân (khoảng 10 -12 g) mà bò, heo vừa mới thải ra, cho vào túi nylon vô trùng, buộc kỹ, bảo quản 4 - 8 0 C và chuyển về phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt. Phân tiêu chảy có thể được lấy bằng cách dùng tăm bông, cho vào môi trường chuyên chở Carry Blair, chuyển về phòng thí nghiệm. - Quét bề mặt thịt bò bằng gạc hoặc tăm bông vô trùng, cho vào ống nghiệm chứa sẵn nước pepton đệm. 3.3.2. Nuôi cấy và phân lập E. coli 3.3.2.1. Môi trường nuôi cấy  Môi trường tăng sinh Do số lượng E.coli nhóm STEC, đặc biệt là E. coli gây bệnh hiện diện trong thực phẩm rất ít, cho nên trước khi phân lập chúng tôi sử dụng môi trường tăng sinh pepton đệm có bổ sung kháng sinh cefixime (0,0125mg/L) và vancomycin (8mg/L) (FDA, 2002) để ức chế các vi khuẩn gram dương và vi khuẩn sống hoại sinh khác.  Môi trường phân lập Để xác định môi trường nào cho kết quả tốt khi phân lập E. coli nhóm STEC mang gen độc lực, chúng tôi sử dụng 3 loại môi trường MAC, SMAC và CT - SMAC. Môi trường phân lập là môi trường MacConkey (MAC), Sorbitol MacConkey (SMAC), và Sorbitol MacConkey (CT - SMAC) có bổ sung kháng sinh cefixime (0,05mg/L) và tellurite (2,5mg/L) (FDA, 2002). Khoảng 90% E. coli đều lên men đường lactose, trên môi trường MAC, E. coli điển hình có khuẩn lạc màu đỏ hồng. Trên môi trường SMAC và CT - SMAC, E. coli không lên men đường sorbitol nên cho khuẩn lạc màu trắng, những dòng E. coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu hồng. Việc tầm soát E. coli nhóm STEC trên phân, bệnh phẩm trên thạch SMAC, CT - SMAC là công cụ ban đầu phát hiện serotype O157 thuộc nhóm STEC. 3.3.2.2. Qui trình phân lập, định tính (1) Nuôi cấy và phân lập E. coli hiện diện trong phân với số lượng lớn, nên phân heo hoặc bò sau khi thu thập và chuyển về phòng thí nghiệm được tiến hành ria trực tiếp trên môi trường thạch 20 đĩa MAC và SMAC, ủ 37 0 C trong 18 - 24giờ, chọn và thu khuẩn lạc điển hình, giữ gốc. Li trích DNA rồi thực hiện multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực. Riêng đối với mẫu bề mặt thịt, do lượng E. coli hiện diện trên bề mặt thịt thường thấp so với mẫu phân, ngoài ra những dòng E. coli gây bệnh hiện diện trong phân, thực phẩm với tần số thấp hơn nhiều so với nhóm E. coli STEC không thuộc O157 (Paton và Paton, 1998). Đây chính là trở ngại cho việc phát hiện E. coli O157:H7, nên việc phết và ria trực tiếp trên môi trường MAC, SMAC thường gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, để cải thiện khả năng phát hiện STEC có mang gen độc lực từ thịt, sử dụng môi trường pepton đệm có bổ sung vancomycin và cefixime (PVC) nhằm hạn chế sự cạnh tranh phát triển của những vi khuẩn khác để STEC có cơ hội tăng sinh tốt hơn. Sau khi ủ 37 0 C trong 24h, canh khuẩn này được cấy ria trở lại trên môi trường thạch CT - SMAC để chọn lọc chuyên biệt nhóm STEC. (2) Chọn khuẩn lạc E. coli Trên từng loại môi trường MAC, SMAC, CT - SMAC, chọn ngẫu nhiên 6 – 10 khuẩn lạc rời rạc đại diện cho mỗi nhóm hình thái: o Khuẩn lạc hồng trên môi trường MAC được kí hiệu HM. o Khuẩn lạc hồng hoặc trắng trên môi trường SMAC được kí hiệu lần lượt là HS hoặc TS. o Khuẩn lạc trắng hoặc hồng trên môi trường CT - SMAC kí hiệu lần lượt là TCT hoặc HCT. Dùng que cấy chạm nhẹ trên từng khuẩn lạc rời rạc rồi chuyển vào từng ống NA riêng biệt để giữ gốc riêng lẻ. Thu phần khuẩn lạc còn lại của mỗi nhóm, gom chung vào 1 eppendorf chứa sẵn 0,4 – 0,5 ml nước cất khử ion vô trùng. (3) Thử sinh hóa Sử dụng nghiệm pháp IMViC (FAO, 1992) cho từng khuẩn lạc riêng lẻ thuộc nhóm đó để xác định E. coli . 3.3.3. Li trích DNA Theo Cebula và ctv (1995), kết hợp với ý kiến của Cerna (2003) và Botteldoorn (2003), việc ly trích DNA được thực hiện như sau: thu khoảng 6 -10 khuẩn lạc E. coli trên môi trường thạch (MAC hoặc SMAC hoặc CT - SMAC hoặc NA) cho vào eppendorf đựng sẵn 0,4 - 0,5 ml nước cất hai lần vô trùng, đun sôi 10 phút, lấy ra và chuyển vào tủ âm -70 0 C giữ trong 10 phút. Sau khi rã đông hoàn toàn, ly tâm 13000 vòng trong 3 21 phút. Để yên và hút phần dung dịch ở phía trên làm DNA khuôn mẫu (DNA xét nghiệm). Sơ đồ 3.1. Qui trình phân lập, định tính và phát hiện gen độc lực E. coli Chọn 6 - 10 khuẩn lạc đỏ hồng Thu tất cả phần còn lại của những khuẩn lạc đã chọn theo từng nhóm riêng và mỗi nhóm cho vào mỗi eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5 ml H 2 O cất khử ion 2 lần CT - SMAC (37 o C/24h) MAC (37 o C/24h) Phân Thịt Mẫu Chọn 6 - 10 khuẩn lạc theo từng nhóm riêng: trắng hoặc đỏ hồng hoặc cả hai SMAC (37 o C/24h) (-) Ly trích DNA riêng theo từng ống NA Loại bỏ ống NA đã giữ gốc Multiplex- PCR Ly trích DNA (DNA nhóm khuẩn lạc) Multiplex - PCR (+) ) Thử IMViC (+/-;+;-;-) C ấy từng khuẩn lạc đ ư ợc chọn v ào t ừng ống thạch nghi êng NA (37 o C/2 4h) Pepton (vancomycin, cefixime) (37 o C/24h) 22 3.3.4. Qui trình multiplex – PCR (1) Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong multiplex – PCR Bảng 3.1 Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng multiplex - PCR Mồi (primer) Trình tự oligonucleotide (5’3’) Kích cỡ DNA được khuếch đại (bp) Eae – F Eae – R ATTACCATCCACACAGACGGT ACAGCGTGGTTGGATCAACCT 397 EhxA – F EhxA –R GTTTATTCTGGGGCAGGCTC CTTCACGTCACCATACATAT 158 Stx1 - F Stx1 - R CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG CACCAGACAATGTAACCGCTG 348 Stx2 - F Stx2 - R ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG GCGTCATCGTATACACAGGAGC 584 Uid - F Uid - R GCGAAAACTGTGGAATTGGG TGATGCTCCATCACTTCCTG 252 (Feng và Monday, 2000) (2) Các thành phần của phản ứng PCR: (Feng và Monday, 2000) Mỗi phản ứng là 25 l, gồm các thành phần sau: PCR buffer 1,1X; MgCl 2 3mM; mỗi dNTP 200 M; mỗi loại primer 7,5 pmol; Taq 2,5 l; DNA 2 l; và nước cất vừa đủ 25 l. (3) Chu kỳ nhiệt (Feng và Monday, 2000) - Tiền biến tính 95 0 C/5 phút - Biến tính 94 0 C/1 phút - Ủ bắt cặp 61 0 C/1 phút 25 chu kỳ - Kéo dài 72 0 C/1 phút - Kéo dài chuỗi 72 0 C/7 phút 23 3.3.5. Điện di, đọc kết quả Lấy 10 l sản phẩm PCR cùng với 2 l loading dye được điện di trên gel agarose 1,6% trong TBE. Thang chuẩn (ladder) cũng được điện di đồng thời. Thời gian điện di 30 – 35 phút ở 90 V và 250 mA. Sau khi điện di, gel được ngâm trong dung dịch ethidium bromide khoảng 30 phút. Sau đó rửa sạch bằng nước và chụp hình gel với tia UV bằng máy chụp gel (phần mềm Quality One 2000, Bio-Rad). Các sản phẩm PCR được xác định bằng cách so với các băng của đối chứng dương và thang ladder 100 bp. 24 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bò tiêu chảy Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trong từng nhóm khuẩn lạc phân lập được từ phân bò tiêu chảy được ghi nhận ở bảng 4.1. Trong 10 mẫu phân bò tiêu chảy có 5/10 mẫu (50%) phát hiện E. coli mang gen độc lực thuộc nhóm stx. Gen ehxA được phát hiện với tỉ lệ cao nhất (100%); kế đến là stx2 (4/10 mẫu – 40%), stx1 (1/10 mẫu – 10%); và không phát hiện được gen uid và eae. Như vậy, phân bò tiêu chảy là nguồn lưu cữu STEC mang gen stx2. Theo Paton và Paton (1998) đã nhận định rằng những dòng STEC mang stx2 thì thường liên kết bệnh nặng hơn so với những dòng STEC chỉ mang stx1. Do kinh phí hạn chế, mỗi loại môi trường phân lập chúng tôi chỉ chọn 2 khuẩn lạc riêng lẻ nhưng có kiểu hình giống nhau để xác định gen độc lực (li trích DNA từ gốc khuẩn lạc riêng lẻ đã nhân và giữ gốc trên thạch NA), kết quả được trình bày ở bảng 4.2. Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy: (1) Ở mẫu số 1, chọn 2 khuẩn lạc hồng rời rạc (khuẩn lạc được đánh số thứ tự số 6 – HM6 và khuẩn lạc số 8 – HM8 trong nhóm khuẩn lạc HM) trên thạch MAC, multiplex - PCR đều phát hiện được gen stx2. Tương tự, 2 khuẩn lạc hồng trên thạch SMAC và 2 khuẩn lạc trắng trên thạch SMAC cũng đều mang gen stx2. Tương tự, đối với gen ehxA đều hiện diện cho mỗi khuẩn lạc riêng lẻ này. (2) Ở mẫu số 2, chọn 2 khuẩn lạc hồng rời rạc trên thạch MAC, multiplex - PCR đều phát hiện được gen ehxA nhưng không phát hiện được gen stx. Tương tự, 2 khuẩn lạc trắng trên thạch SMAC chỉ phát hiện một mẫu mang gen ehxA lẫn stx2. (3) Đối với mẫu phân số 3, chọn 2 khuẩn lạc hồng rời rạc trên môi trường MAC, 2 khuẩn lạc trắng trên SMAC, multiplex – PCR phát hiện 100% E. coli mang gen ehxA nhưng không có gen stx. Tóm lại, nhóm khuẩn lạc (gồm 6 – 10 khuẩn lạc) có mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ đều mang gen độc lực đó. Cho nên chọn từng khuẩn lạc để nghiên cứu là công việc cần thiết để xác định serotype của mỗi khuẩn lạc phân lập 25 được. Nếu mục tiêu này không được đề cập thì việc thu hết các loại khuẩn lạc với các kiểu hình khác nhau để phát hiện sự hiện diện các gen độc lực của E. coli trong mẫu khảo sát là bước đi thích hợp. Bảng 4.1 Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trong từng nhóm khuẩn lạc (HM, TS, và HS) ở phân bò tiêu chảy Mẫu Loại khuẩn lạc, môi trường Gen độc lực eae ehxA stx1 stx2 uid 1 HM _ + _ + _ HS _ + _ + _ TS _ + _ + _ 2 HM _ + _ + _ HS _ + _ _ _ TS _ + _ + _ 3 HM _ + _ + _ HS _ + _ _ _ TS _ + _ + _ 4 HM _ + _ _ _ HS _ + _ _ _ HCT _ _ _ _ _ 5 HM _ + _ _ _ HS _ + _ _ _ 6 HM _ + _ _ _ HS _ + _ + _ 7 HCT _ + _ _ _ 8 HCT _ + + _ _ 9 HM _ + _ _ _ TS _ + _ _ _ 10 HM _ + _ _ _ HS _ + _ _ _ TS _ + _ _ _ 26 Bảng 4.2 Kết quả phát hiện gen độc lực E. coli từng khuẩn lạc riêng lẻ ở phân bò tiêu chảy Mẫu Loại khuẩn lạc, môi trường Gen độc lực eae ehxA stx1 stx2 uid 1 HM6 _ + _ + _ HM8 _ + _ + _ HS4 _ + _ + _ HS6 _ + _ + _ TS4 _ + _ + _ TS5 _ + _ + _ 2 HM1 _ + _ _ _ HM3 _ + _ _ _ TS1 _ _ _ _ _ TS2 _ + _ + _ 3 HM1 _ + _ _ _ HM3 _ + _ _ _ TS3 _ + _ _ _ TS7 _ + _ _ _ 4.2. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân heo con cai sữa tiêu chảy Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli từ 9 mẫu phân heo cai sữa tiêu chảy được trình bày ở bảng 4.3. Bảng 4.3 cho ta thấy có 4/9 mẫu (44,4%) mang gen stx, trong đó có ¼ mẫu mang gen stx1 (25%) và ¾ mẫu mang gen stx2 (75%), không có mẫu nào mang gen uid và eae, 9/9 mẫu (100%) mang gen ehxA. Blanco và ctv (1997) kết luận rằng gen stx1 thường hiện diện tỉ lệ thấp trên heo. Có 6/25 (24%) nhóm khuẩn lạc được phân lập từ 9 mẫu phân heo cai sữa tiêu chảy, cùng lúc mang 2 gen độc lực (ehxA và stx1 hoặc ehxA và stx2). Điều này sẽ làm tăng khả năng gây bệnh của E. coli đối với heo. Người ở mọi lứa tuổi đều có thể bị nhiễm STEC với những serotype khác nhau (Beutin và ctv, 1995). 27 Bảng 4.3 Kết quả phát hiện gen độc lực của nhóm khuẩn lạc đại diện cho E. coli trong phân heo cai sữa tiêu chảy Mẫu Loại khuẩn lạc, môi trường Gen độc lực eae ehxA stx1 stx2 uid 1 HM _ + _ _ _ HS _ + _ _ _ TS _ + _ _ _ 2 HM _ + _ _ _ HS _ + + _ _ TS _ + _ _ _ 3 HS _ + _ _ _ TS _ + _ _ _ 4 HM _ + _ _ _ HS _ + _ _ _ TS _ + _ + _ 5 HS _ + _ + _ TS _ + _ + _ 6 HM _ + _ + _ HS _ + _ _ _ TS _ + _ + _ 7 HM _ _ _ _ _ HS _ + _ _ _ TS _ + _ _ _ 8 HM _ _ _ _ _ HS _ + _ _ _ TS _ + _ _ _ 9 HM _ _ _ _ _ HS _ + _ _ _ TS _ + _ _ _ . (37 o C/2 4h) Pepton (vancomycin, cefixime) (37 o C/24h) 22 3. 3.4. Qui trình multiplex – PCR (1) Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong multiplex – PCR Bảng 3. 1 Trình tự các đoạn mồi sử. (50%) phát hiện E. coli mang gen độc lực thuộc nhóm stx. Gen ehxA được phát hiện với tỉ lệ cao nhất (100%); kế đến là stx2 (4/10 mẫu – 40%), stx1 (1/10 mẫu – 10%); và không phát hiện được gen uid. (25%) và ¾ mẫu mang gen stx2 (75%), không có mẫu nào mang gen uid và eae, 9/9 mẫu (100%) mang gen ehxA. Blanco và ctv (1997) kết luận rằng gen stx1 thường hiện diện tỉ lệ thấp trên heo. Có