28 4.3. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bê tiêu chảy Ban đầu, đề tài chỉ tiến hành cấy ria trực tiếp mẫu phân heo hoặc bò lên hai loại môi trường MAC và SMAC để thu các nhóm khuẩn lạc và phát hiện gen. Hướng phân lập E. coli có sử dụng PVC và CT - SMAC chỉ để áp dụng đối với mẫu bề mặt thịt. Tuy nhiên, qua thực tế khảo sát (9 mẫu phân heo tiêu chảy và 10 mẫu phân bò tiêu chảy) cho thấy tần số phát hiện E. coli mang gen stx1 hiện diện với tỉ lệ thấp (10% ở bò tiêu chảy và 11,1% ở phân heo cai sữa tiêu chảy), và chưa có mẫu phân heo hay bò tiêu chảy nào được tìm thấy eae và uid. Theo Paton và Paton (1998) thì E. coli STEC dòng O157 ít hơn 1% trong quần thể E. coli. Mặt khác, ngoài E. coli, trong phân còn có sự hiện diện của nhiều loài vi khuẩn khác như Salmonella, Shigella, Campylobacter, Staphylococcus aureus, Proteus Vì vậy, để tăng khả năng phát hiện những dòng E. coli STEC mang gen gây độc từ phân bê tiêu chảy, chúng tôi tiến hành phân lập theo hướng có sử dụng môi trường tăng sinh chọn lọc và môi trường thạch chọn lọc chuyên biệt CT - SMAC. Kết quả phát hiện gen độc lực được ghi nhận cụ thể ở bảng 4.4. Trong 8 mẫu phân bê tiêu chảy, có 8/8 mẫu (100%) phát hiện được E. coli mang ít nhất 1 gen độc lực, có mẫu phát hiện E. coli mang 2 -3 gen độc lực. Gen ehxA được phát hiện với tỉ lệ cao nhất (8/8 mẫu – 100%), kế đến là gen stx 1 (7/8 mẫu – 87,5%), gen stx2 (1/8 mẫu – 12,5%) . Trong khi đó, không phát hiện được gen uid trong bất kì mẫu nào. Smith và Scotland (1988) và Gyles (1992) cho rằng nhiều loại gia súc mang STEC không có biểu hiện triệu chứng, một vài dòng STEC có khả năng gây tiêu chảy cho bò, đặc biệt là bê. Và 7/8 (87,5%) mẫu đều hiện diện cả gen ehxA và stx. Theo Barrett và ctv (1992), độc tố Stx là điều kiện cần chứ chưa phải là điều kiện đủ để gây bệnh tiêu chảy trên vật nuôi. Do đó, sự xuất hiện đồng thời các gen ehxA và stx có thể góp phần giải thích lý do tiêu chảy trên bê. Feng và Monday (2000) cho biết có trên 100 loại serotype STEC khác nhau có thể sản sinh các loại độc tố Stx1, Stx2, và nhiều biến chủng của Stx2. Trong đó, Stx1 và Stx2 là 2 độc tố chủ yếu gây ra bệnh ở người. 29 Bảng 4.4 Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trong từng nhóm khuẩn lạc ở phân bê tiêu chảy Mẫu Loại khuẩn lạc, môi trường Gen độc lực eae ehxA stx1 stx2 uid 1 HM _ + _ _ _ TS _ + _ _ _ 2 HM _ _ _ _ _ HS _ + _ _ _ HCT _ _ + _ _ 3 HM _ _ _ _ _ HS _ + + _ _ TCT _ _ _ _ _ 4 HM _ + _ _ _ HS _ + + _ _ HCT _ _ + _ _ 5 HM _ _ _ _ _ HS _ + + _ _ TCT _ _ _ _ _ 6 HM _ + _ _ _ HS _ + + _ _ HCT _ _ + _ _ 7 HCT _ + + + _ 8 HM _ + + _ _ HS _ + + _ _ 4.4. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ bề mặt thịt bò Trong quá trình giết mổ, E. coli từ phân dễ dàng vấy nhiễm lên nền sàn, dụng cụ giết mổ, nước sử dụng, phương tiện vận chuyển Do đó, nếu qui trình giết mổ gia súc, vận chuyển và phân phối thịt không tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiện vệ sinh thì nguy cơ vấy nhiễm E. coli từ phân vào thịt dễ dàng xảy ra. Phân gia súc là nguồn chủ yếu chứa E. coli O157:H7, và thịt heo cũng có thể là một nguồn lây nhiễm (Doyle, 1991). Theo Levine (1987), STEC là những tác nhân gây bệnh cho người, người trở 30 nên cảm nhiễm do ăn phải thức ăn bị nhiễm STEC trong do tiếp xúc trực tiếp với STEC từ động vật (Renwick và ctv, 1993). Người bị nhiễm STEC có thể tiêu chảy trong trầm trọng hơn như HC và HUS (Karmali, 1989). Và để bước đầu tầm soát các gen độc lực của E. coli STEC trong thực phẩm, chúng tôi tiến hành khảo sát bề mặt thịt bò, vì hầu hết các trường hợp ngộ độc thực phẩm là do người ăn phải thịt bò trong các sản phẩm có nguồn gốc từ thịt bò bị nhiễm E. coli nhóm STEC (Keskimaki, 2001). Kết quả phát hiện các gen độc lực của 9 mẫu E. coli phân lập từ thịt bò được ghi nhận ở bảng 4.5. Trong 9 mẫu bề mặt thịt bò khảo sát, không có mẫu nào phát hiện được E. coli có mang gen độc lực. Nếu nói về khía cạnh ngộ độc thực phẩm thì kết quả này thật sự đáng mừng. Điều này hoàn toàn hợp với luật pháp không cho phép STEC hiện diện trong thực phẩm (Paton và Paton, 1998). Tuy nhiên, nguyên nhân của sự vắng mặt những dòng E. coli mang gen độc lực được phân lập từ thịt bò có thể do:  Số mẫu khảo sát còn ít nên chưa đủ để phát hiện các gen độc lực.  Khuẩn lạc trắng trên môi trường CT - SMAC có thể không phải là khuẩn lạc điển hình của E. coli O157:H7. Theo Fujisawa và ctv (2002), trên môi trường CT - SMAC, vi khuẩn hiếu khí Pseudomonas spp. cũng có khuẩn lạc không màu, cũng không lên men sorbitol.  Mẫu âm tính thật sự. Bảng 4.5 Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trên bề mặt thịt bò Mẫu Loại khuẩn lạc, môi trường Gen độc lực eae ehxA stx1 stx2 uid 1 TCT _ _ _ _ _ 2 TCT _ _ _ _ _ 3 TCT _ _ _ _ _ 4 TCT _ _ _ _ _ 5 TCT _ _ _ _ _ 6 TCT _ _ _ _ _ 7 TCT _ _ _ _ _ 8 TCT _ _ _ _ _ 9 TCT _ _ _ _ _ 31 4.5. Tổng kết kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trên các mẫu khảo sát có nguồn gốc từ bò và heo Tóm lại, trong khảo sát này, 2 đối tượng gia súc được chọn khảo sát là bò và heo. Ở bò, chúng tôi khảo sát trên ba loại mẫu: phân bê tiêu chảy, phân bò tiêu chảy và bề mặt thịt bò vì như Beutin và ctv (1995) đã nhận định rằng những dòng STEC thường hiện diện trong phân của loài nhai lại. Trên heo, phân heo cai sữa tiêu chảy được tập trung khảo sát vì tính nhạy cảm của lứa tuổi này với nhóm STEC. Khảo sát 36 mẫu, gồm 8 mẫu phân bê tiêu chảy, 10 mẫu phân bò tiêu chảy, 9 mẫu phân heo tiêu chảy và 9 mẫu bề mặt thịt bò, kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli từ các mẫu khảo sát trên được tổng hợp ở bảng 4.6. Như vậy, trong 36 mẫu khảo sát có 16 mẫu phát hiện E. coli mang gen độc lực của nhóm STEC, chiếm tỉ lệ 44,4%. Gen ehxA được phát hiện với tỉ lệ rất cao (75%). Hầu hết các dòng STEC O157 và các dòng STEC không thuộc O157 đều sản sinh độc tố gây dung huyết EhxA (Paton và Paton, 1998). Theo Stephan và Hoelzle (2000), STEC mà không mang gen ehxA thì độc lực sẽ giảm và thậm chí không độc đối với người. Tần số hiện diện gen stx1 và stx2 lần lượt là 9/36 mẫu (25%) và 8/36 mẫu (22,2%). Không phát hiện được gen eae và uid trong các mẫu khảo sát. Điều này có thể được giải thích do các primer Eae chỉ gắn vào đoạn gen eae chuyên biệt tạo dạng protein -intimin (Feng và Monday, 2000). Protein này có chủ yếu ở các serotype O157:H7 và O55:H7 mà thôi. Các serotype này hiện diện rất ít trong mẫu phân cũng như thực phẩm. Beutin và ctv (1995) đã nghiên cứu và kết luận rằng chỉ có 3/208 (1,4%) khuẩn lạc STEC có nguồn gốc từ phân của động vật dương tính với eae. Theo Wang và ctv (2002), gen ehxA có khả năng gây bệnh cao hơn. Vả lại, theo Jerse và ctv (1990), intimin do gen eae mã hóa là điều kiện cần chứ không phải là điều kiện đủ để gây sự tổn thương kiểu A/E. Tóm lại, tuy đã phát hiện một số E. coli thuộc nhóm STEC nhưng vẫn chưa phát hiện bất kì dòng E. coli O157:H7. Bởi vì, những vụ bộc phát bệnh do STEC không nhất thiết gây ra bởi một dòng đơn thuần và có lẽ cần một phức hệ VSV (Paton và Paton, 1998). 32 Bảng 4.6 Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli nhóm STEC trên 36 mẫu khảo sát Nguồn gốc N (+) Gen độc lực eae ehxA stx1 stx2 uid Phân bò tiêu chảy 10 (%) 5 50,0 0 0,0 10 100,0 1 10,0 4 40,0 0 0,0 Phân heo cai sữa tiêu chảy 9 (%) 4 44,4 0 0,0 9 100,0 1 11,1 3 33,3 0 0,0 Phân bê tiêu chảy 8 (%) 7 87,5 0 0,0 8 100,0 7 87,5 1 12,5 0 0,0 Bề mặt thịt bò 9 (%) 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Tổng cộng 36 16 0 27 9 8 0 (%) 44,4 0 75 25 22,2 0 N: số lượng mẫu khảo sát (+): số lượng mẫu phát hiện có mang gen độc lực của E. coli nhóm STEC 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 eae ehxA stx1 stx2 uid Gen độc lực Tỉ lệ (%) Phân bê tiêu chảy Phân bò tiêu chảy Phân heo cai sữa tiêu chảy Thịt bò Biểu đồ 4.1 Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli trên 36 mẫu khảo sát 33 Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR T1: mẫu thịt số 1; P.B1: mẫu phân bò tiêu chảy số 1; Ladder: thang chuẩn; P.b7: mẫu phân bê tiêu chảy số 7; EDL933: đối chứng dương; P.h1: mẫu phân heo cai sữa tiêu chảy số 1. 34 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ những kết quả thu nhận được trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi rút ra những kết luận sau: (1) E. coli trên môi trường thạch MAC chỉ xuất hiện 1 loại khuẩn lạc hồng (HM), trên môi trường thạch SMAC xuất hiện 2 loại khuẩn lạc trắng (TS) và hồng (HS), trên môi trường thạch CT - SMAC cũng xuất hiện 2 loại khuẩn lạc trắng (TCT) và hồng (HCT). (2) Nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ có mang gen độc lực đó. (3) 100% mẫu phân tiêu chảy đều có E. coli mang gen dung huyết ehxA. Tần số phát hiện gen stx của E. coli phân lập được trong mẫu phân bò, heo và bê tiêu chảy lần lượt là: 50%; 44,4% và 100%. (4) 9 mẫu bề mặt thịt bò chưa phát hiện được gen độc lực của E. coli. (5) Chưa phát hiện được gen uid và eae trong 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, bê và heo; và 9 mẫu bề mặt thịt. 5.2. Tồn tại và đề nghị  Tồn tại Do điều kiện thời gian và kinh phí có hạn, đề tài còn có một số tồn tại sau: (1) Chưa phát hiện và phân lập được serotype E. coli O157:H7. (2) Chưa tổ chức khảo sát được việc phát hiện các gen độc lực của E. coli trên các môi trường phân lập MAC, SMAC, CT - SMAC.  Đề nghị (1) Có thể ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện gen độc lực của những dòng E. coli gây bệnh trong chẩn đoán bệnh và kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm, đặc biệt trong các trường hợp xảy ra dịch bệnh. (2) Tăng số lượng mẫu khảo sát, định serotype các khuẩn lạc riêng lẻ bằng kháng huyết thanh chuẩn. (3) Thay đổi môi trường tăng sinh để tăng khả năng phát hiện E. coli O157:H7. Chẳng hạn thay môi trường pepton đệm bổ sung cefixime và vancomycin bằng môi 35 trường LST (Lauryl sulfate tryptose) bổ sung cefixime (0,0125mg/L) và tellurite (0,625mg/L) được ủ ở 42 0 C trong 24 giờ (Dogan và ctv, 2003). 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN TIẾNG VIỆT 1. Bộ môn vi sinh – Khoa Y - Đại học Y Dược TP.HCM, 1996. Vi khuẩn học. Trang 123 – 130. 2. Trần Thị Dân, 2001. Lưu ý về PCR. Tài liệu giảng dạy Trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. 3. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục TP. HCM. 301trang. 4. Lê Thị Mai Khanh, 2004. Phát hiện một số gen độc lực của Escherichia coli phân lập được từ phân và thịt bò, heo bằng kỹ thuật multiplex - PCR. Luận văn Thạc sỹ Nông nghiệp Trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. PHẦN TIẾNG NƯỚC NGOÀI 5. Barrett T. J., Kaper L. P., Jerse A. E., and Wachsmuth I. K., 1992. Virulence factors in Shiga-like toxin producing Escherichia coli isolated from humans and cattle. J. Infect. Dis. 165: 970 - 980. 6. Bauer M. E., and Welch R. A., 1996. Characterization of an RTX toxin from enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Infect. Immun. 64: 167 - 175. 7. Beutin L., Montenegro M. A., Orskov I., Orskov F., Prada J., Zimmermann S., and Stephan R., 1989. Close association of verotoxin (Shiga-like toxin) production with enterohemolysin production in strains of Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 27: 2559 - 2564. 8. Beutin L., Geier D., Zimmermann S., and Karch H., 1995. Virulence markers of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli strains originating from healthy domestic animals of different species. J. Clin. Microbiol. 33: 631- 635. 9. Blanco M., Blanco J. E., Gonzalez E. A., Mora A., Jansen W., Gomez T. A. T., Zerbini L. F., Yano T., de Castro A. F. P., and Blanco J., 1997. Note: Genes coding for enterotoxins and verotoxins in porcine Escherichia coli strains belonging to different O:K:H serotypes: relationship with phenotype. J. Clin. Microbiol. 35: 2958 - 2963. 10. Botteldoorn N., Heyndrick M., Rijpens N., Herman L., 2003. Detection and characterization of verotoxigenic Escherichia coli by a VTEC/EHEC multiplex PCR in porcine faeces and pig carcass swabs. Research in Microbiology. 154: 97-104. . l : 50%; 44 ,4% và 100%. (4) 9 mẫu bề mặt thịt bò chưa phát hiện được gen độc lực của E. coli. (5) Chưa phát hiện được gen uid và eae trong 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, bê và heo; và 9 mẫu. 1997. Note: Genes coding for enterotoxins and verotoxins in porcine Escherichia coli strains belonging to different O:K:H serotypes: relationship with phenotype. J. Clin. Microbiol. 3 5: 2958. việc phát hiện các gen độc lực của E. coli trên các môi trường phân lập MAC, SMAC, CT - SMAC.  Đề nghị (1) Có thể ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện gen độc lực của những dòng E.