21 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập mẫu Chúng tôi đã phân lập được 20 dòng nấm R. solani từ các mẫu thực vật bệnh và sử dụng 20 dòng nấm này để nghiên cứu. Bảng 3. Danh sách các dòng nấm Rhizoctonia solani được sử dụng trong nghiên cứu. Stt Tên dòng nấm Kí chủ Nơi lấy mẫu 1 CX-8 Cải xanh Tp. HCM 2 SR-650 Sầu riêng Bình Dương 3 L-74 Lúa Trà Vinh 4 XL-76 Xà lách An Giang 5 BV-62-03 Bông vải Bình Thuận 6 L-67 Lúa Đồng Tháp 7 RM-61 Rau muống Đồng Nai 8 CB-63 Cải Bắp Lâm Đồng 9 LB-73 Lục bình Tiền Giang 10 L-71-04 Lúa Cần Thơ 11 L-71-05 Lúa Cần Thơ 12 LB-70 Lục bình Vĩnh Long 13 L-67-04 Lúa Đồng Tháp 14 B-61 Bắp Đồng Nai 15 L-61 Lúa Đồng Nai 16 L-73 Lúa Tiền Giang 17 L-74 Lúa Trà Vinh 18 CP-50-02 Cà phê Dắc Lắc 19 ĐX-61 Đậu xanh Đồng Nai 20 CLV-72 Cỏ lồng vực Long An 22 4.2. Li trích DNA Theo qui trình li trích của Lee và Taylor (1990), chúng tôi thu được DNA tổng số của nấm R. solani. Qui trình này không sử dụng RNase nên không loại bỏ được RNA. DNA tổng số được kiểm tra chất lượng bằng cách điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả diện di cho thấy DNA tổng số của các dòng nấm R. solani có xuất hiện và rõ nhưng chạy thành vệt dài (hình 5). Điều này cho thấy DNA tổng số li trích theo qui trình này còn chứa nhiều tạp chất, chưa được sạch. Hình 5. Ảnh điện di DNA tổng số của các dòngnấm R. solani li trích theo qui trình của Lee và Taylor chưa xử lí RNAse. Để phản ứng PCR dược tối ưu thì sản phẩm DNA li trích cần phải tương đối sạch các tạp chất. Khi DNA khuôn còn lẫn protein, hiệu quả của phản ứng PCR giảm tỉ lệ thuận với độ tinh sạch của DNA khuôn (Khuất Hữu Thanh, 2003). Vì vậy, để có DNA khuôn tinh sạch hơn, chúng tôi đã cải tiến qui trình của Lee và Taylor bằng cách lặp lại khâu khử bỏ protein và các thành phần không mong muốn khác trong mẫu phân tích. Cụ thể là sau bước 6 của qui trình Lee và Taylor chúng tôi thêm các bước sau: Từ bước 1 – 6 giống qui trình Lee và Taylor.  Bước 7 : cho thêm 400µl hỗn hợp dung dịch chloroform:isoamyl (24:1).  Bước 8: li tâm 14000g/15phút. DNA tổng số 23  Bước 9: hút lấy 200µl dung dịch nổi chuyển sang eppendorf mới.  Các bước còn lại giống qui trình Lee và Taylor. Với qui trình tách chiết này, DNA tổng số nhận được sau khi điện di trên agarose 0,8%, kết quả cho thấy : DNA tổng số theo qui trình này ít kéo thành vệt dài hơn, chứng tỏ DNA tổng số tương đối sạch hơn, thích hợp cho phản ứng PCR hơn (hình 6). Vì vậy, chúng tôi sử dụng qui trình Lee và Taylor cải tiến để tách chiết DNA tổng số của các dòng nấm R. Solani. DNA tổng số thu được từ qui trình tách chiết này sẽ được sử dụng để làm khuôn cho phản ứng PCR tiếp theo. Hình 6 . Ảnh diện di DNA tổng số của các dòng nấm R. Solani li trích theo qui trinh của Lee và Taylor cải tiến, chưa xử lí RNAse. Khi dùng để khuếch đại vùng mục tiêu từ DNA bằng phản ứng PCR, lượng DNA được sử dụng thường khoảng từ 10 – 100ng cho một phản ứng. Nếu lượng DNA sử dụng quá ít thì sẽ không đủ số lượng khuôn DNA cho quá trình tổng hợp. Kết quả là sản phẩm PCR rất ít không đủ số lượng mong muốn. Còn nếu số lượng DNA khuôn qú nhiều thì sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ không mong muốn (Khuất Hữu Thanh, 2003). Nhưng DNA tổng số li trích được có hàm lượng rất lớn. Vì vậy, cần pha loãng chúng trước khi thực hiện phản ứng PCR. DNA tổng số 24 Chúng tôi dựa vào kết quả đo OD để pha loãng DNA tổng số đến mức thích hợp (hình 7). Hình 7. Ảnh diện di DNA tồng số sau khi pha loãng chuẩn bị cho phản ứng PCR 4.3. Kết quả khuếch đại vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. Solani với hai primer ITS4 và ITS5 Sử dụng 2 primer ITS4 và ITS5 do White và ctv (1991) thiết kế cho vùng ITS của rDNA (gồm ITS1-5,8S-ITS2), sản phẩm sản phẩm khuếch đại được dự kiến có kích thước khoảng 700bp. Chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR được thực hiện với 10 – 100ng DNA, 1X DNA polymerase buffer, 1,5 mM MgCl 2 , 1µM cho mỗi primer ITS4 và ITS5, 1U Taq DNA polymerase (hình 8). DNA tổng số pha loãng 25 Hình 8. Ảnh điện di sản phẩm PCR với nồng độ primer là 1µM (1pmol/µl) Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy có 1 băng (band) chính kích thước 700bp và 1 băng phụ kích thước khoảng 100bp. Sự tồn tại của băng phụ là do dư nhiều primer trong thành phần phản ứng PCR. Lượng primer dư này sẽ tự polymer với nhau tạo thành băng phụ trên kết quả điện di. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện lại phản ứng PCR với lượng primer giảm xuống còn 0,4µM các thành phần khác trong phản ứng không thay đổi. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% cho thấy như ở hình 9. Sản phẩm PCR Băng phụ 700bp 26 Hình 9. Ảnh điện di sản phẩm PCR có nồng độ primer là 0,4µM (0,4pmol/µl). Sản phẩm PCR có nồng độ primer 0,4µM (0,4pmol/µl) không còn thấy sản phẩm phụ nữa. Như vậy, với thành phần phản ứng PCR là 10 – 100ng DNA, 1X DNA polymerase buffer, 1,5 mM MgCl 2 , 0,4µM cho mỗi primer ITS4 và ITS5, 1U Taq DNA polymerase, vùng rDNA-ITS đã được khuếch đại thành công. Sản phẩm có kích thước khoảng 700bp. 4.4 Đọc trình tự trực tiếp đoạn rDNA-ITS với 2 primer ITS1 và ITS4 Trong điều kiện giới hạn của đề tài, chúng tôi chỉ tiến hành đọc trình tự của 2 dòng nấm BV-62-03 và SR-650. Trước khi tiến hành đọc trình tự, sản phẩm PCR được làm tinh bằng kit Quantum Prep Freeze “N Squeeze DNA gel Extraction Spin Column của Bio- rad để tinh sạch. Qui trình tinh sạch sản phẩm gồm có các bước chính như sau:  Cắt phần gel có mang vạch DNA đích.  Băm nhỏ băng DNA đó thành từng lát nhỏ và cho vào lọc của kit và cho lọc này vào eppendorf.  Ủ cả eppendorf này ở -20 0 C trong 5 phút.  Li tâm 13000 vòng trong 3 phút ở nhiệt độ phòng.  Thu phần dịch DNA ở dưới eppendorf. Sản phẩm PCR 700bp 27 Sản phẩm PCR đã làm tinh được đọc trình tự với 2 primer ITS1 và ITS4 (White và ctv, 1991) bằng máy đọc trình tự DNA ABI 3100 của hãng Applied Biosystem theo qui trình mô tả ở mục 3.2.6 Kết quả cho thấy với cả 2 dòng BV-62-03 và SR-650, trình tự thu được phần lớnchỉ xuất hiện chữ N nên không thể xác định được trình tự (hình 10,11). Với kết quả này, chúng tôi cho rằng sản phẩm PCR đã tinh sạch này không thích hợp cho việc đọc trình tự. Do qui trình tinh sạch này chỉ li tâm nên có thể chưa loại bỏ được hoàn toàn chất loading dye trong quá trình điện di và ethidium bromide trong quá trình nhuộm. Hai loại hóa chất này có thể ngăn cản sự tổng hợp chuỗi đơn DNA trong quá trình chạy chu kì. Mặt khác, ethidium bromide cũng có thể phát sáng nhất định nên làm nhiễu sóng trong quá trình phân tích trình tự. Như vậy, kit tinh sạch của Bio-rad mà chúng tôi đã sử dụng để tinh sạch DNA có thể là không phù hợp cho quá trình đọc trình tự. Vì vậy, chúng tôi thử sử dụng một kit khác để làm tinh sạch mẫu. Chúng tôi sử dụng kit “GFX PCR DNA and Gel Band Purication” của công ty Amersham để tinh sạch. Qui trình tinh sạch gồm các bước chính sau:  Cắt band DNA từ gel sau khi điện di, băm gel thành từng lát nhỏ.  Cho gel vào eppendorf.  Thêm 10μl capture buffer vào cho mỗi 10mg gel.  Ủ trong nhiệt độ 60 0 C trong 15 phút cho đến khi gel tan hết.  Sau khi gel tan hết thì li tâm lạnh thu mẫu.  Chuyển mẫu đã thu được vào cột GFX , ủ nhiệt độ phòng trong 1 phút.  Li tâm 10000 vòng 30giây.  Bỏ nước dưới eppendorf, đặt cột GFX vào eppendorf khác.  Thêm 500μl wash buffer và li tâm 30 giây.  Chuyển cột GFX vào tip khác.  Thêm 50 μl elution buffer, nhỏ từ từ trên cột.  Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng 1 phút.  Li tâm 10000 vòng 1 phút thu mẫu DNA đã được tinh sạch. 28 Hình 10. Trình tự và peak vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03 29 Hình 11. Trình tự và peak vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 30 Với sản phẩm PCR đã làm tinh sạch theoqui trình trên, chng1 tôi tiến hành đọc trình tự trực tiếp vùng rDDNA-ITS của 2 dòng SR-650 và BV-62-03 sử dụng 2 primer ITS1 và ITS4. 4.4.1. Đọc trình tự vùng rDNA-ITS của dòng BV-63-02 Với primer ITS1, vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03 đã đọc được là 361bp. Trình tự như sau: gggaatttaa ttgaatttta ttaatagagg agtagaacgt tgtagctgcg ccatttttct ggcaatgtgc ataatctctc tttcatacac acacccctgt gcacctgtga gacatctaca aggtcatttt agagaaattt gggcaagtgt ggagcttcat tgcaaaactt ttccctcctt ctcttggctt ttgctgtcta ttccactcac atacaaactc tattaaatat aaaacgaatg taattgatgt aacgcatcta atactaagtt tcaacaacgg atctcttggc tctcgcatcg atgaaaacgc acgaactgca agagtaatga aaatgaaatt catgaatcat tttttcttta a Với primer ITS4, vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03 đã đọc được là 312bp. Trình tự như sau: gtttcgccgg ggtagtccta cctgatttga gatcagatca taaggatgta ttttgtccaa gtcaaatcga ctattagaag cggttcgtct tgcatttacc ttggccacct ttttacagtg tcctcagcga tagataactt atcacgccga gtggaaccaa gcataacact tagagatcca gctaataaac atatacgcgc agggtgtgaa actgcaaagt actccaaaac caaagtaaga gaccagttga attaacatta ggtttacttt gagacacccc ctgaactcaa aaggtatgtt ccaggaaagg ag Do 2 chuỗi DNA đã đọc được là quá ngắn nên chúng tôi không xác định được trình tự vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03. 4.4.2. Đọc trình tự vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 Với primer ITS1, vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 đã đọc được là 602bp. Trình tự như sau: ggggaattat tgtatttatt accgaggagt agagttgtag ctggccattt ttctggcaat gtgcacattc ttctctttca tccacacacc cctgtgcacc tgtgagacag tcacaaggtc attttggagt ttgggcaagt gtggagcttc attgcaaaac ttttccctcc ttctcttggc ttttgctgtc tactcaatta acatacaaac tctattaaat ttaaaacgaa tgtaattgat gtaacgcatc taatactaag tttcaacaac ggatctcttg gctctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcggaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcaccttg cgctccttgg tattccttgg agcatgcctg tttgagtatc ctgaaatctt caaagtaaac cttttgttaa ttcaatcggt ctcttacttt ggttttggag gtctttgcag tttcacaccc tgctcctctt tgtttattag ctggatctct aagtgttatg cttggttcca . hành đọc trình tự trực tiếp vùng rDDNA-ITS của 2 dòng SR-650 và BV-62- 03 sử dụng 2 primer ITS1 và ITS4. 4.4.1. Đọc trình tự vùng rDNA-ITS của dòng BV- 63- 02 Với primer ITS1, vùng rDNA-ITS của. DNA đã đọc được là quá ngắn nên chúng tôi không xác định được trình tự vùng rDNA-ITS của dòng BV-62- 03. 4.4.2. Đọc trình tự vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 Với primer ITS1, vùng rDNA-ITS của dòng. Hình 10. Trình tự và peak vùng rDNA-ITS của dòng BV-62- 03 29 Hình 11. Trình tự và peak vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 30 Với sản phẩm PCR đã làm tinh sạch theoqui trình