19 Yêu cầu chung đối với mẫu Toàn bộ hoặc một phần của lá đều có thể đƣợc dùng làm mẫu phân tích. Nguyên liệu đòi hỏi phải còn tƣơi, lá lớn và còn non, không sử dụng lá già. Chọn những lá có biểu hiện bệnh để thực hiện thí nghiệm chẩn đoán bệnh TSWV. Trƣờng hợp cây có sự phân bố không đều mầm bệnh thì phải thu thập những phần mà có biểu hiện bệnh mạnh nhất. (Theo Lê Lƣơng Tề - Vũ Triệu Mân, 1999). 2.11.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử  Virus thực vật có những đặc điểm sinh vật sống, chúng tự nhân lên trong cây trồng và di truyền tính gây bệnh, chúng tự phân chia thành các phân tử nhỏ nhƣng cũng có thể tạo thành những tinh thể giống nhau chứa đựng những phân tử protein  Chúng ta không thể thấy virus dƣới kính hiển vi quang học, nhƣng chúng ta có thể quan sát đƣợc chúng trên kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 500.000 lần.  Phƣơng pháp đơn giản là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay thông qua làm tinh khiết cố định bằng hoá chất trên lƣới đồng để quan sát trên kính hiển vi điện tử. Đây là phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản nhất.  Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phƣơng pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trƣờng hợp nghi là mẫu bị lẫn virus khác. Phƣơng pháp này giúp ta xác định đƣợc hai virus khác nhau trong cùng một mẫu.  Ngƣời ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng Ultramicrotom và nhuộm mẫu đƣợc cắt, quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh. (Phạm Đức Toàn, 1996 – 2001) (Nguyễn Văn Tuất, 2002) 2.12 ELISA 2.12.1 Khái niệm về ELISA  Nguyên tắc: dựa vào phản ứng ngƣng kết giữa kháng nguyên và kháng thể. Cụ thể ở virút TSWV thì kháng nguyên là cấu trúc vỏ protein Nucleocapsid (N); glycoprotein (GP) G1. 20 (Trích từ Chemicon International) 2.12.2 Phân loại ELISA 2.12.2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) Sơ đồ 2.1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp Cho kháng nguyên vào đĩa ELISA Đem ủ các đĩa chứa kháng nguyên Rửa Thêm kháng thể có gắn enzyme Rửa Ủ ở 37 o C Thêm cơ chất Ủ ở 37 o C Đọc kết quả 21 2.12.2.2 ELISA gián tiếp Sơ đồ 2.2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp 2.12.2.3 Sandwich ELISA Sandwich ELISA có thể đƣợc chia làm hai hệ thống:  Sandwich ELISA trực tiếp Sơ đồ 2.3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp Cho kháng nguyên vào đĩa Đem ủ, rửa Thêm kháng thể Ủ, rửa Bổ sung kháng kháng thể có gắn enzyme Ủ, rửa Thêm cơ chất tạo màu Ủ, đọc kết quả Cho kháng thể vào mỗi đĩa ELISA Ủ, rửa Thêm kháng nguyên vào Ủ, rửa Bổ sung kháng thể có gắn enzyme Ủ, rửa Thêm cơ chất tạo màu Ủ, đọc kết quả 22  Sandwich ELISA gián tiếp Sơ đồ 2.4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp 2.12.2.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh C-ELISA (competition ELISA) (John R. Crowther, 2001). Cho kháng thể thứ I vào giếng ELISA Ủ, rửa Thêm kháng nguyên Ủ, rửa Thêm kháng thể thứ II Ủ, rửa Bổ sung kháng kháng thể thứ II có gắn enzyme vào Ủ, rửa Thêm cơ chất tạo màu Ủ, đọc kết quả Trƣờng hợp I Trƣờng hợp II Cho kháng nguyên vào Cho kháng nguyên vào Ủ, rửa Ủ, rửa Bổ sung kháng nguyên Không bổ sung kháng nguyên Thêm kháng thể có gắn enzyme Thêm kháng thể có gắn enzyme Ủ, rửa Ủ, rửa Bổ sung cơ chất tạo màu Bổ sung cơ chất tạo màu Ủ Ủ Đọc kết quả (không màu): 100% Đọc kết quả (màu): 0%  Tuỳ theo độ đậm nhạt của màu mà ta có phần trăm mức độ cạnh tranh từ đó kết luận mức độ nhiễm bệnh. cạnh tranh cạnh tranh 23 2.12.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA  Số lƣợng kháng thể thứ nhất đƣợc gắn vào đáy giếng  Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên  Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên  Hoạt tính chuyên biệt của kháng thể thứ hai (Chemicon International) 2.12.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả ELISA  Nếu các đối chứng âm cho kết quả dƣơng tính thì có thể do sự nhiễm từ chất tạo màu hoặc từ kháng thể đƣợc đánh dấu hoặc chính các đối chứng bị nhiễm.  Nếu màu không xuất hiện đối với đối chứng dƣơng hoặc đối với mẫu thì phải kiểm tra lại tất cả hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản  Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dƣơng và cả mẫu kiểm tra thì phải kiểm tra lại kháng thể đƣợc gắn enzyme và nồng độ của chất tạo màu  Nếu có tạo màu đối với mẫu nhƣng không tạo màu với đối chứng dƣơng thì có thể kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảo quản.  Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì chỉ nên thay đổi một yếu tố thí nghiệm. (Trích từ Chemicon International). 2.13 Giới thiệu về kỹ thuật PCR 2.13.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự nhƣ sau :  Bƣớc 1: Biến tính sợi đôi thành sợi đơn (denature) Giai đoạn này đƣợc thực hiện ở nhiệt độ cao (94-95 o C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.  Bƣớc 2: Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây template (gọi là tiến trình bắt cặp) để có phân tử DNA mới. Ở giai đoạn này nhiệt độ đƣợc hạ thấp cho phép các primer bắt cặp với DNA khuôn mẫu, nhiệt độ này dao động trong khoảng 30-70 o C, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của các primer sử dụng. Giai đoạn này gọi là giai đoạn bắt cặp.  Bƣớc 3: Kéo dài dây mới nhờ primer (extension) 24 Nhiệt độ đƣợc tăng lên 72 o C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Kết quả cuối cùng là một đoạn mã hóa di truyền đặc biệt nào đó đƣợc khuếch đại lên rất nhiều lần. Sự khuếch đại này có thể đƣợc tính nhƣ sau: Tổng lƣợng DNA khuếch đại = m x 2 n m : là số bản sao của chuỗi mã hóa. n : là số chu kỳ. Hình 2.6: Nguyên tắc phản ứng PCR Ba tiến trình này xảy ra theo chu kỳ rất nhanh để khuếch đại DNA. Trong chu kỳ thứ nhất và thứ hai của phản ứng khuếch đại, chỉ có sản phẩm chuỗi dài đƣợc hình thành, còn trong những chu kỳ tiếp theo khuếch đại cả những sản phẩm chuỗi dài và chuỗi ngắn. Sản phẩm chuỗi dài đƣợc tích tụ theo hƣớng tuyến tính, còn sản phẩm chuỗi ngắn tích tụ theo logarit.Ngƣời ta hy vọng có khoảng 10 5 lƣợng sản phẩm chuỗi ngắn sau khoảng 25-30 chu kỳ. Theo nguyên tắc PCR đƣợc áp dụng để khuếch đại các đoạn DNA có chiều dài 200-2000bp. Những phản ứng trên đƣợc thực hiện nhờ polymerase nhƣ Taq polymerase, và sự thay đổi chu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho sự biến tính và nhiệt độ cho bắt cặp. Một polymerase của DNA và bốn loại nucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) đƣợc dùng để khuếch đại một đoạn nào đó của DNA. Primer bên trái tác động trên dây DNA 3’-5’ còn đƣợc gọi là forward primer, kí hiệu là F. Primer bên phải tác động trên dây 5’-3’ còn đƣợc gọi là reverse primer, kí hiệu là R. Sự sắp xếp nhƣ vậy đảm bảo vùng bị can thiệp đƣợc tăng cƣờng hoạt động, theo 3 trình tự đã nói ở trên. Tóm lại khi các primer kết hợp với sợi DNA bổ sung của 25 nó trong điều kiện một khoảng cách đã đƣợc kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ đƣợc khuếch đại lên theo phản ứng dây chuyền với polymerase. 2.13.2.Tối ƣu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR  DNA mẫu PCR là một công cụ rất mạnh để khuếch đại DNA, vì thế trong phản ứng PCR chỉ cần một lƣợng rất nhỏ là đủ. Nhƣng để giảm bớt lỗi gây ra bởi Taq DNA polymerase thì một nồng độ cao hơn có thể đƣợc sử dụng, tuy nhiên nếu nồng độ DNA khuôn mẫu quá cao thì sẽ làm gia tăng mức độ nhiễm đồng thời có thể làm giảm hiệu quả phản ứng. Phản ứng khuếch đại tối ƣu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên, những kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Thông thƣờng, nhiễm protein trong mẫu DNA trong quá trình ly trích DNA sẽ không ảnh hƣởng xấu đến sự nhân DNA. Tuy nhiên nhiễm DNA lạ sẽ dẫn đến kết quả PCR bị sai lệch. Đối với những DNA có kích thƣớc quá lớn (>50kb), sự biến tính có thể không hữu hiệu và năng suất PCR thấp. Trong trƣờng hợp này, cần phải cắt DNA trƣớc bằng enzyme cắt hạn chế mà enzyme đó không cắt trong chuỗi đích; hoặc có thể tách DNA bằng cách dùng nhiệt độ tới 100 o C trong 2-5 phút.  Enzyme DNA polymerase Ngƣời ta thƣờng sử dụng Taq polymerase, đây là enzyme chịu nhiệt ly trích từ vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus (Bùi Trang Việt, 2002). Với enzyme này, PCR cho hiệu quả cao nhất, Taq có thể xúc tác kéo dài khoảng 35-100 nucleotide trong 4 giây ở nhiệt độ 70-80 o C. Đây là giới hạn nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme này hoạt động (Newton và Graham, 1997). Nồng độ Taq polymerase đƣợc sử dụng thông thƣờng là 0.5-5 đơn vị/100μl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm không chuyên tính có thể nhảy vào làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lƣợng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn. Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hƣớng thêm một nucleotide loại “A” vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan trong trong việc tạo dòng (TA- cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầu 26 tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation). Ngoài ra có thể làm gia tăng hoạt tính của Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu. Use Tli, Pfu và một số enzyme polymerase khác.  Lựa chọn Enzyme polymerase cho phản ứng PCR DNA Polymerase Tự nhiên hoặc tái tổ hợp Nguồn gốc Taq Tự nhiên Thermus aquaticus Amplitaq® Tái tổ hợp T. aquaticus Amplitaq (Stoffel fragment)® Tái tổ hợp T. aquaticus Hot Tub™ Tự nhiên Thermus flavis Pyrostase™ Tự nhiên T. flavis Vent™ Tái tổ hợp Thermococcus litoralis Deep Vent™ Tái tổ hợp Pyrococcus GB-D Tth Tái tổ hợp Thermus thermophilus Pfu Tự nhiên Pyrococcus furiosus ULTma™ Tái tổ hợp Thermotoga maritima  Đặc tính của từng loại DNA polymerase đƣợc sử dụng trong PCR (Michael Blaber, 1998) Taq/Amplitaq® Stoffel fragment Vent™ Deep Vent™ Pfu Tth ULTma™ 95 °C half-life 40 phút 80 phút 400 phút 1380 phút >120 phút 20 phút >50 phút 5'3' exo + + 3'5' exo + + + + Tỉ lệ kéo dài (nucleotide/giây) 75 >50 >80 ? 60 >33 ? Hoạt tính Reverse transcription Yếu Yếu ? ? ? Tốt ? Tạo ra đầu tận cùng 3' A 3' A >95% đầu bằng >95% đầu bằng đầu bằng 3' A đầu bằng Sự đổi chỗ sợi + + Trọng lƣợng phân tử (kDa) 94 61 ? ? 92 94 70 27  Primer Một số chỉ tiêu cơ bản trong thiết kế- lựa chọn Primer:  Thông thƣờng các primer có chiều dài 20- 30 mer  Không nên thiết kế các primer có polybase (chuỗi base cùng loại) hay những trình tự lặp lại  Kiểm tra lại primer để tránh hiện tƣợng primer- dimer  Thêm một cặp GC vào đầu tận cùng 5’ nếu thấy có vị trí cắt giới hạn ở đó  Các trình tự bổ sung với các primer khác sử dụng trong PCR nên đƣợc tránh để ngăn chặn sự lai giữa các primer với nhau  Khoảng cách giữa các primer nên thấp hơn 10 kb  Thêm một hoặc hai G / C vào đầu tận cùng 3’ thì tốt nhƣng tránh thêm quá nhiều vì điều này có thể cho kết quả là sẽ tạo ra các sản phẩm PCR không đặc hiệu  Tm của mồi xuôi và mồi ngƣợc không cách biệt nhau quá xa. Thành phần nucleotide của các primer cân bằng, tránh các cặp G, C lặp lại nhiều lần.  Các primer đƣợc chọn phải đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên genome.  Trình tự DNA nằm giữa hai mồi “xuôi” và “ngƣợc” không quá lớn. Phản ứng sẽ tối ƣu trên những trình tự DNA nhỏ hơn 1 kb. Tính toán nhiệt độ nóng chảy (Tm) của primer:  Cách 1: Cách này chỉ sử dụng khi chiều dài primer không quá 20 nucleotide Tm = [(A+T) x 2 °C] + [(G+C) x 4 °C]  Cách 2: Hiệu quả đối với primer có chiều dài từ 14 – 70 nucleotide Tms = 81.5 + 16.6(log10[J + ]) + 0.41(%G+C) - (600/l) + [J + ] : nồng độ mol các cation hoá trị I + (%G+C) : % nucleotide loại G và C  Cách 3: Hiệu quả nhất đối với các primer có chiều dài từ 20 – 35 base Tmp = 22 + 1.46([2 x (G+C)] + (A+T)) 28  Nhiệt độ bắt cặp Kỹ thuật PCR rất mẫn cảm với nhiệt độ. Vì thế bất cứ sự thay đổi nhiệt độ nào của phản ứng cũng có thể ảnh hƣớng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt. Suggs và ctv.(1981) đã đề nghị một công thức để ƣớc đoán nhiệt độ T m , mà ở nhiệt độ ấy, một nửa các primer sẽ lai với DNA mục tiêu. Công thức đƣợc sử dụng trong điều kiện primer có khoảng 20 oligonucleotide: T m = 4 (G + C) + 2 (A + T) A, T, C, G là số lƣợng các base có trong oligonucleotide. Tuy nhiên, việc tính toán này chỉ có tính chất tạm thời, chúng ta phải điều chỉnh lại nhiệt độ này để có sự khuếch đại cao nhất và thu nhận tần suất đa hình cao nhất. Bằng kinh nghiệm và thực hiện xét nghiệm nhiều lần, chúng ta mới có thể có số liệu đúng về nhiệt độ lai. Số base càng ít nhiệt độ này càng thấp và ngƣợc lại. Nếu nhiệt độ bắt cặp quá thấp dẫn đến sản phẩm đƣợc nhân lên quá mức do sự bắt cặp các primer không chuyên biệt có thể xảy ra. Nếu nhiệt độ lai quá cao, năng suất của sản phẩm mong muốn sẽ giảm. Nếu primer bắt cặp một cách chính xác với đoạn DNA mẫu, nhiệt độ bắt cặp nên thấp hơn nhiệt độ lý thuyết T m khoảng 5 o C. Thông thƣờng, với một oligonucleotide có 20 nucleotide có thể dùng nhiệt độ lai 50-55 o C. Nếu chuỗi dài hơn (25 nucleotide hay nhiều hơn) hoặc có thể nhiều base G, C, nhiệt độ lai có thể đến 55- 65 o C. Trong vài phản ứng, oligonucleotide lớn (từ 30 bp trở lên), giai đoạn bắt cặp và kéo dài có thể đƣợc kết hợp và thực hiện ở 68-72 o C. Khi dùng dƣ oligonucleotide với khả năng bắt cặp sai, nhiệt độ bắt cặp có thể giảm còn 37-45 o C (Hồ Bích Liên,2003).  Tỉ lệ primer/DNA khuôn mẫu Một trong những yếu tố quan trọng nhất của PCR là tỉ lệ tối ƣu giữa primer và DNA mẫu. Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tƣợng primer-dimer sẽ xuất hiện, giống nhƣ trƣờng hợp DNA mẫu quá loãng. Nếu tỉ lệ này quá nhỏ, kết quả sản phẩm PCR sẽ không nhiều. Hầu hết các trƣờng hợp áp dụng PCR, đều dùng một nồng độ primer không quá 0.5μM (12.5 pmol/25 μl phản ứng), không tính đến nồng độ DNA mẫu, để tránh hiện tƣợng primer-dimer. . thiệu về kỹ thuật PCR 2.13.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự nhƣ sau :  Bƣớc 1: Biến. ra đầu tận cùng 3' A 3' A >95% đầu bằng >95% đầu bằng đầu bằng 3' A đầu bằng Sự đổi chỗ sợi + + Trọng lƣợng phân tử (kDa) 94 61 ? ? 92 94. còn tƣơi, lá lớn và còn non, không sử dụng lá già. Chọn những lá có biểu hiện bệnh để thực hiện thí nghiệm chẩn đoán bệnh TSWV. Trƣờng hợp cây có sự phân bố không đều mầm bệnh thì phải thu