31 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 LY TRÍCH DNA 4.1.1 So sánh DNA ly trích từ cơ thu hồi theo hai mức độ làm khô DNA cơ bò được làm khô theo hai mức độ I và II, kết quả đo OD được trình bày ở bảng 4.1. Bảng 4.1 Tỷ số OD và hàm lượng DNA thu hồi theo hai mức độ làm khô Chỉ tiêu Mức độ I ( X ± SD) Mức độ II ( X ± SD) Sai biệt thống kê Tỷ số OD 1,86 ± 0,01 1,93 ± 0,04 P = 0,15 Hàm lượng DNA (µg / µl) 0,43 ± 0,06 0,37 ± 0,04 P = 0,50 Số mẫu 11 11 1.86 0.43 1.93 0.37 0 0.5 1 1.5 2 Mức độ I Mức độ II Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg / µl) Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy độ tinh sạch và hàm lượng của DNA dựa vào hai cách làm khô trên khác nhau không ý nghĩa (p > 0,05). Theo Sambrook và Russell (2001), khi DNA được làm quá khô thì khả năng hoà tan của nó vào dung môi sẽ giảm đi. Ở đây, chúng tôi thay đổi thời gian làm khô (chênh lệch thời gian khoảng 10 phút). Khi ủ DNA cùng với dung môi qua đêm thì thời gian này đủ lâu để cho DNA có thể tan với khả năng tối đa của nó. Do đó, sự khác biệt về lượng DNA không rõ rệt. Chỉ tiêu hiệu quả PCR trong thí nghiệm này được khảo sát sau khi đã xây dựng được qui trình PCR phù hợp. Biểu đồ 4.1 So sánh DNA ly trích từ cơ thu hồi theo mức độ I và II 32 4.1.2 So sánh DNA ly trích từ cơ và lông DNA ly trích từ 54 mẫu cơ được so sánh với DNA từ 10 mẫu lông về độ tinh sạch và hàm lượng DNA sau khi đo OD. Bảng 4.2 Tỷ số OD và hàm lượng DNA ly trích từ cơ và lông Chỉ tiêu DNA cơ DNA lông Sai biệt thống kê Tỷ số OD 1,76 ± 0,03 1,49 ± 0,1 P = 0,001 Hàm lượng DNA (µg /µl) 0,37 ± 0,03 0,03 ± 0,01 P = 0,00 Tổng số mẫu 54 10 1.76 0.37 1.49 0.03 0 0.5 1 1.5 2 DNA cơ DNA lông Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg /µl) Qua kết quả ở bảng 4.2, DNA ly trích từ cơ khá tinh sạch và có hàm lượng cao hơn so với DNA ly trích từ lông một cách rất có ý nghĩa (p < 0,01). Cơ vân chứa các tế bào đa nhân nên lượng DNA ly trích được rất nhiều. Hơn nữa, protein của cơ dễ bị phân hủy hơn keratin ở lông nên DNA ly trích có độ tinh sạch cao hơn DNA từ lông. Tuy nhiên, muốn có được lượng DNA tinh sạch này, thường phải giết chết con vật hoặc lấy mẫu sinh thiết. Chính cản trở này đã làm cho việc ly trích DNA từ những con vật quí hiếm thêm khó khăn. Từ đó, việc tìm ra qui trình ly trích DNA từ lông là điều rất cần thiết. 4.1.3 Kết quả ly trích DNA từ gốc lông và ngọn lông Sau khi đo OD của 10 mẫu DNA lông (5 mẫu gốc lông, 5 mẫu ngọn lông), chúng tôi tính toán các giá trị thống kê (xem bảng 4.3). Biểu đồ 4.2 So sánh DNA ly trích từ cơ và lông 33 Bảng 4.3 Tỷ số OD và hàm lượng DNA ly trích từ gốc lông và ngọn lông Chỉ tiêu Gốc lông Ngọn lông Sai biệt thống kê Tỷ số OD 1,77 ± 0,07 1,22 ± 0,03 P = 0,001 Hàm lượng DNA (µg / µl) 0,03 ± 0,01 0,02 ± 0,01 P = 0,34 Tổng số mẫu 5 5 1.77 0.03 1.22 0.02 0 0.5 1 1.5 2 Gốc lông Ngọn lông Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg / µl) Như vậy, DNA ly trích từ gốc lông có tỷ số OD trung bình 1,76, tinh sạch hơn so với DNA ly trích từ ngọn lông một cách có ý nghĩa (p < 0,01). Xét về cấu trúc của lông, mức độ keratin hoá ở gốc lông ít hơn ở ngọn lông cho nên việc tách keratin ra khỏi dung dịch DNA ly trích từ ngọn lông sẽ khó khăn hơn so với gốc lông. Kết quả cho thấy 0,15 g ngọn lông có thể cho khoảng 4,34 µg DNA (200 µl dung dịch DNA với nồng độ 0,02 µg / µl). Trong khi đó, cùng với khối lượng trên, gốc lông có thể cho 6,5 µg DNA (200 µl dung dịch DNA với nồng độ 0,03 µg / µl). Tuy vậy, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê (p > 0,05). Thực ra, phần lớn tế bào ở ngọn lông là tế bào chết nên có thể mất hết DNA, vì thế lượng DNA thu thập được sẽ ít hơn so với lượng DNA thu thập từ gốc lông (nơi có rất nhiều tế bào sống). Tuy nhiên khi ly trích, chúng tôi đã dùng quá ít lông nên sự khác biệt này không rõ ràng. Như vậy, ly trích DNA từ gốc lông sẽ tốt hơn nhiều so với ly trích từ ngọn. Tuy nhiên, do nhu cầu đa dạng trong tiến hành thí nghiệm, đôi khi phải ly trích DNA từ ngọn lông của một thú sống. Do vậy, cần phải cải thiện qui trình ly trích DNA từ ngọn lông (sử dụng loại enzyme phân cắt keratin, tạo điều kiện hoạt động cho enzyme hoặc tăng lượng lông cần ly trích). Biểu đồ 4.3 So sánh DNA ly trích từ ngọn lông và gốc lông 34 4.2 KẾT QUẢ PCR XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH 4.2.1 Kết quả xây dựng qui trình PCR 4.2.1.1 So sánh hai chu trình nhiệt Sau khi tiến hành xác định giới tính trên giống bò ta Vàng bằng hai chu trình nhiệt khác nhau, chúng tôi nhận được kết quả ở bảng 4.4. Bảng 4.4 Tỷ lệ thành công của hai chu trình nhiệt Chu trình nhiệt Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỷ lệ thành công (%) I 5 0 0 II 9 9 100 Sai biệt thống kê P = 0,002 Kết quả xác định giới tính trên giống ta Vàng bằng Taq ABgene 1,5 UI ở chu trình nhiệt II thành công hơn rất nhiều so với chu trình nhiệt I (p < 0,01). Sự khác biệt chủ yếu giữa chu trình nhiệt II so với chu trình nhiệt I là tăng thời gian trong giai đoạn 2 lên 1 phút ở tất cả các bước (biến tính, ủ bắt cặp và kéo dài). Theo Sambrook và Russell (2001), thời gian của mỗi bước trong giai đoạn chạy chu kỳ ảnh hưởng quyết định đến năng suất sản phẩm PCR. Nếu thời gian biến tính không đủ lâu để cắt đứt hoàn toàn các liên kết hidro trong mạch đôi thì giai đoạn bắt cặp sẽ không đạt hiệu quả cao. Thời gian kéo dài chuỗi nếu ít cũng gây ra kết quả không chuyên biệt. Theo lý thuyết, tốc độ kéo dài chuỗi của Taq polymerase là 2000 nucleotide / phút. Tuy nhiên, trong thực tế, người ta thường xem loại Taq này kéo dài 1000 nucleotide trong vòng 1 phút. Theo chu trình của Alves và ctv (2003), thời gian mỗi bước trong giai đoạn 2 đều là 45 giây. Nhóm tác giả này đã xác định giới tính chính xác 100% khi tiến hành với chu trình nhiệt ấy. Nhưng khi thí nghiệm với cùng chu trình của họ, chúng tôi hoàn toàn không thu được kết quả mong muốn (chỉ được một band chuyên biệt NST X). Nhóm tác giả này sử dụng hoá chất từ hãng Invitrogene Life Technologies trong khi hoá chất dùng trong thử nghiệm này có nguồn gốc từ hãng ABgene, IDT. Có thể vì lý do đó mà có sự khác nhau giữa hai qui trình. 35 4.2.1.2 Thử nghiệm ba loại Taq Quá trình thử nghiệm ba loại Taq của ba hãng sản xuất Promega, Bio-rad và ABgene với chu trình nhiệt II trong xác định giới tính của bò ta Vàng đã cho kết quả ở bảng 4.5. Bảng 4.5 Tỷ lệ thành công khi PCR với ba loại Taq Loại Taq Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỷ lệ thành công (%) Promega 8 0 0 Bio-rad 6 6 100 ABgene 9 9 100 Sai biệt thống kê P < 0,001 Kết quả từ bảng 4.5 cho thấy sử dụng Taq từ Bio-rad và ABgene ở nồng độ 1,5 UI trong phản ứng PCR đã cho hiệu quả cao hơn rõ rệt so với Taq Promega nồng độ 1,5 UI (100% so với 0%). Trước khi quyết định chọn nồng độ 1,5 UI trong mỗi phản ứng, chúng tôi đã thử nghiệm rất nhiều nồng độ khác nhau của mỗi loại Taq và xét thấy ở nồng độ 1,5 UI, ba loại Taq này đều hoạt động tốt hơn các nồng độ khác. Điểm khác nhau lớn nhất giữa ba loại Taq trên là việc sử dụng Tris - HCl trong phản ứng. Theo Alves và ctv (2003), buffer PCR cần 20 mM Tris - HCl trong phản ứng xác định Hình 4.1 Sản phẩm PCR từ hai chu trình nhiệt I: chu trình nhiệt I; II: chu trình nhiệt II 36 giới tính của bò. Thực tế, buffer PCR của Bio-rad và ABgene mới đáp ứng được điều này còn buffer của Promega chỉ có 10 mM Tris - HCl. Do đó, chúng tôi phải bổ sung thêm Tris - HCl (pH 8,3) để đạt nồng độ Tris - HCl trong buffer PCR là 20 mM. Nhưng sự bổ sung này cũng không mang lại hiệu quả. Ngoài ra, mỗi loại Taq được sản xuất ở mỗi hãng đều theo một qui cách khác nhau và như thế đều có thể ảnh hưởng đến kết quả PCR. Như vậy, ta có thể sử dụng một trong hai loại Taq của hãng Bio-rad hoặc ABgene để tiến hành phản ứng. Tuy nhiên, Taq của Bio-rad (3.773.783 VNĐ / 250 UI) khi so sánh giá thành với Taq ABgene (1.798.381 VNĐ / 250 UI) thì đắt hơn gấp 2,5 lần. Chính vì vậy, chúng tôi quyết định chọn Taq ABgene để tiến hành xác định giới tính sau này. Hình 4.2 Sản phẩm PCR từ ba loại Taq 37 4.2.2 Áp dụng qui trình PCR 4.2.2.1 Xác định giới tính của ba giống bò với DNA từ cơ Qui trình PCR với Taq ABgene 1,5 UI theo chu trình nhiệt II được sử dụng để xác định giới tính của ba giống bò ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan (DNA cơ). Bảng 4.6 Kết quả áp dụng PCR lên xác định giới tính của ba giống bò Giống Số mẫu tiến hành Số mẫu thành công Tỷ lệ thành công (%) Ta Vàng 9 9 100 Lai Sind 13 13 100 Sữa Hà Lan 10 10 100 Kết quả từ bảng 4.6 cho thấy qui trình PCR này áp dụng khá thành công và không có sự khác biệt đáng kể khi xác định giới tính các giống bò. Theo Alves và ctv (2003), khi áp dụng qui trình chẩn đoán giới tính bằng PCR lên hai nhóm giống Bos taurus (Holstein, Jersey và Simmental) và Bos indicus (Guzera, Nelore và Tebapua) thì kết quả đều thành công 100%. Như vậy, kết quả của chúng tôi khá phù hợp với kết quả của nhóm tác giả này. TV: ta Vàng; LS: lai Sind; HL: s ữa H à Lan Hình 4.3 Sản phẩm PCR chẩn đoán giới tính ba giống bò 38 4.2.2.2 Kết quả PCR với DNA từ cơ được phơi khô theo hai mức độ DNA từ cơ được làm khô theo mức độ I so với theo mức độ II không khác biệt gì về độ tinh sạch và hàm lượng DNA (xem bảng 4.1). Tuy nhiên, sau khi tiến hành PCR, tỷ lệ thành công lại khác biệt rất lớn giữa hai mức độ làm khô (bảng 4.7). Bảng 4.7 Hiệu quả PCR trên mẫu DNA làm khô theo hai mức độ Mức độ Số mẫu tiến hành Số mẫu thành công Tỷ lệ thành công (%) I 11 11 100 II 10 2 20 Sai biệt thống kê P = 0,001 Như vậy, tỷ lệ thành công khi tiến hành PCR trên mẫu DNA làm khô mức độ I (100%) cao hơn so với mẫu DNA làm khô mức độ II (20%) một cách có ý nghĩa (p < 0,01). Theo Svaren và ctv (1987), khi DNA được làm khô quá đáng thì nó có thể bị biến tính do mất lớp vỏ ổn định của những phân tử nước gắn kết (trích dẫn bởi Sambrook và Russell, 2001). Ở đây, đa số các mẫu được làm khô đến mức độ II có biểu hiện giảm sút độ ướt rất nghiêm trọng, vệt tủa thường bám rất chặt lên thành eppendorf và rất mờ, mới nhìn thì không xác định được vị trí vệt tủa. Có thể vì lý do Hình 4.4 Sản phẩm PCR từ hai mức độ làm khô DNA cơ bò đực S V 39 đó mà DNA bị hỏng khá nhiều và không đủ làm mẫu cho phản ứng nhân bản (kết quả 2 band mờ, 1 band chuyên biệt NST X hoặc không cho band nào). Tuy nhiên, để khẳng định điều này, cần phải có nhiều nghiên cứu sâu hơn nữa về tính chất của DNA và thực hiện số mẫu nhiều hơn. 4.2.2.3 So sánh kết quả PCR trên DNA của cơ và lông Sau khi tiến hành 10 phản ứng khuếch đại DNA trên các mẫu lông ở cả ba giống, chỉ có 2 mẫu thành công, 8 mẫu còn lại không phân biệt được giới tính chính xác. Tỷ lệ thành công trên mẫu lông là 20%, ít hơn so với mẫu cơ (100%) một cách có ý nghĩa (p < 0,001). Trong đó, hai mẫu lông thành công đều là mẫu lông gốc (đạt 40%), các mẫu lông ngọn đều không thành công (0%). Theo Sambrook và Russell (2001), độ tinh sạch của DNA ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả PCR. DNA có tỷ số OD từ 1,8 – 2,0 được xem là sạch (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002). Ở đây, mẫu lông có tỷ số OD trung bình 1,49 (xem bảng 4.2). Tỷ số này thấp chứng tỏ lượng protein còn trong dịch DNA rất nhiều (nhất là keratin) nên ức chế phản ứng khuếch đại DNA. Mẫu lông ngọn còn có tỷ số OD trung bình thấp hơn mẫu lông gốc khá nhiều (xem bảng 4.3) nên kết quả PCR của mẫu lông gốc không thành công. Hình 4.5 Kết quả PCR từ ngọn lông và gốc lông 40 Một yếu tố quan trọng khác ảnh hưởng đến hiệu quả PCR là nồng độ DNA mẫu và những chất ức chế khác (Sambrook và Russell, 2001). Thông thường, DNA mẫu của động vật hữu nhũ được dùng khoảng 1µg trong phản ứng và có xu hướng giảm xuống còn 0,1µg (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002). Ở đây, chúng tôi sử dụng 0,15 µg DNA mẫu trong 1 phản ứng. Ở mẫu cơ, nồng độ DNA ly trích được khá cao (369,55 ng / µl) nên thường sử dụng < 1µl DNA mẫu là có thể thực hiện được phản ứng. Trong khi đó, mẫu lông có nồng độ DNA khá thấp (27,1 ng / µl) (xem bảng 4.2), nên chúng tôi phải sử dụng 3 µl - 15 µl thì mới đủ lượng DNA mẫu cho phản ứng nhân bản. Khi đó, lượng EDTA có trong TE 1X (buffer cho DNA mẫu) được đưa vào phản ứng cũng tăng theo. Tuy nhiên, nếu lượng EDTA hiện diện nhiều trong phản ứng khuếch đại DNA thì nó có thể ức chế phản ứng bằng cách bẫy bắt Mg 2+ - một coenzyme của Taq polymerase và làm cô lập Mg 2+ với Taq. Chính vì vậy, PCR ở mẫu lông có hiệu quả rất thấp, nhất là ngọn lông. Một kinh nghiệm được rút ra từ sự thất bại trên mẫu lông là khi pha loãng DNA mẫu sau khi tủa trong cồn tuyệt đối lạnh thì phải pha với lượng nhỏ TE 1X để có được dung dịch DNA có hàm lượng > 100 ng / µl. . quyết định chọn Taq ABgene để tiến hành xác định giới tính sau này. Hình 4. 2 Sản phẩm PCR từ ba loại Taq 37 4. 2.2 Áp dụng qui trình PCR 4. 2.2.1 Xác định giới tính của ba giống bò với. đồ 4. 3 So sánh DNA ly trích từ ngọn lông và gốc lông 34 4. 2 KẾT QUẢ PCR XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH 4. 2.1 Kết quả xây dựng qui trình PCR 4. 2.1.1 So sánh hai chu trình nhiệt Sau khi tiến hành xác định. trình PCR với Taq ABgene 1,5 UI theo chu trình nhiệt II được sử dụng để xác định giới tính của ba giống bò ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan (DNA cơ). Bảng 4. 6 Kết quả áp dụng PCR lên xác định giới