19 3.3. Vật liệu 3.3.1. Vật liệu Buồng trứng heo thịt thu tại lò mổ Nam Phong, quận Bình Thạnh, TP.Hồ Chí Minh. Buồng trứng chó ta thu tại lò mổ anh Phước, quận Thủ Đức, TP.Hồ Chí Minh. Hình 3.1: Buồng trứng heo (a) Buồng trứng dài 1 cm (b) Buồng trứng dài 1,5 cm (c) Buồng trứng dài 2 cm Hình 3.2: Buồng trứng chó 3.3.2. Hóa chất (xem thêm mục pha môi trường) Dung dịch NaCl 0.9% Cồn 70 o Môi trường DBPS Môi trường HEPES Môi trường TCM 199 Dầu khoáng Một số chất phụ thêm vào môi trường nuôi trứng chín. Một số hóa chất dùng để nhuộm. 3.3.3. Thiết bị Kính hiển vi đảo ngược (Olympus) Kính hiển vi soi nổi (Nikon SMZ800) 20 Tủ ấm CO 2 Tủ thao tác vô trùng Hình 3.3: Tủ ấm CO 2 3.3.4. Dụng cụ Bình giữ nhiệt Kéo các loại Khay Becher 500 ml Găng tay Lọ cồn Kẹp Đầu tip các loại Pipette Pasteur vô trùng Micropipette Phin lọc (0,2µm) Đĩa petri nhựa (35 10 mm) Đĩa petri thủy tinh Lame và lamel 21 3.4. Phƣơng pháp Qui trình chung cho quá trình nuôi noãn chín Thu nhận buồng trứng Cắt nang noãn Tìm và rửa noãn Nuôi noãn Thu nhận noãn sau khi nuôi Đánh giá bước 1 Nhuộm và đánh giá bước 2 22 3.4.1. Thu nhận buồng trứng tại lò mổ Tiến hành thu nhận trực tiếp bộ phận sinh dục của thú cái ngay sau khi vừa được mổ. 3.4.2. Đánh giá buồng trứng heo Bước đầu đánh giá số hoàng thể, số nang noãn ở các mức kích thước Thực hiện cắt nang noãn Lấy noãn bằng phương pháp xé Phân loại noãn Dùng kim và syringe hút noãn Dùng kéo cắt 2 buồng trứng ở 2 bên sừng tử cung Rửa bằng cồn 90 o Rửa bằng nước muối 0.9 % Trữ trong nước muối sinh lý ở 30 – 37 o C Vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm 23 3.4.3. Đánh giá buồng trứng chó Hình 3.4: Nang đa noãn trên chó 3.4.4. Phƣơng pháp chuẩn bị môi trƣờng 3.4.4.1. Trên heo Chuẩn bị 7 đĩa petri nhựa đánh số thứ tự. Đĩa 1 chứa 2 ml môi trường HEPES để rửa noãn Đĩa 2, 3, 4, 5, 6, 7 mỗi đĩa chứa 200 μl FCS; 200 μl pyruvic acid; 200 μl hMG; 1400 μl môi trường căn bản TCM199. Đĩa 2 và 3 để rửa noãn, đĩa 4 rửa vỏ nang noãn. Đĩa 5, 6, 7 mỗi đĩa chứa thêm 2 vỏ nang noãn, phủ dầu khoáng kín bề mặt, cho vào tủ ấm trước 30 phút và nuôi một loại noãn có đường kính nang khác nhau: < 0,4 mm; 0,4 – 0,6 mm; > 0,6 mm. Đo kích thước buồng trứng Cắt tách nang noãn, phân loại kích thước Thu noãn, phân loại A, B, C, và đánh giá nang một noãn, nang đa noãn 24 3.4.4.2. Trên chó Chuẩn bị 4 đĩa petri nhựa đánh số thứ tự. Đĩa 1 chứa 500 μl ECS; 50 μl pyruvic acid; 50 μl estradiol; 50 μl FSH; 50 μl hCG; 4300 μl môi trường căn bản TCM 199. Hút 2ml dung dịch ở đĩa 1 cho vào đĩa 2. Đĩa 1 và 2 dùng để rửa noãn. Các đĩa 3 và 4 dùng để nuôi noãn trong hệ thống giọt, mỗi đĩa chứa 100 μl dung dịch từ đĩa 1 và phủ dầu khoáng. Để tránh giọt môi trường vỡ, hút 50 μl, phủ dầu khoáng, sau đó thêm 50 μl còn lại. Hai đĩa này dùng để nuôi 2 loại noãn có đường kính nang noãn < 2 mm và > 2 mm. 3.4.5. Tìm và rửa noãn 3.4.6. Chuyển noãn vào môi trƣờng nuôi Chuyển các noãn sau khi rửa vào môi trường nuôi noãn chín tương ứng từng mức đường kính nang. Trên heo mỗi đĩa chứa khoảng 30 – 50 noãn, chuyển thành từng nhóm tránh phân tán, nuôi ở điều kiện 38,5 o C, 5 % CO 2 , 40 – 44 giờ. Trên chó mỗi đĩa chứa khoảng 10 noãn, nuôi ở điều kiện 37 o C, 5 % CO 2 , 72 giờ. Sau khi tách nang trong DPBS, đưa lên kính hiển vi độ phóng đại 40 lần Tìm noãn loại A,B, dùng pipette Pasteur hút qua đĩa rửa đến khi không còn mảnh vỡ tế bào 25 3.4.7. Thu nhận noãn sau khi nuôi Hình 3.5: Noãn trƣớc và sau khi tách tế bào hạt tụ 3.4.8. Đánh giá phân loại noãn Ta đánh giá và phân loại noãn trước khi nuôi và sau khi nuôi. Chất lượng noãn trước khi nuôi khác nhau là do bản chất noãn hoặc do cách thu nhận noãn. Noãn được thu hoạch phải có hình dạng tròn đều, noãn được phân làm 3 loại: Loại A có nhiều lớp tế bào hạt tụ bao xung quanh. Loại B có một lớp tế bào hạt tụ bao xung quanh. Loại C không có hạt tụ bao quanh. Chuyển noãn sau khi nuôi vào đĩa chứa DPBS Thêm hyaluronidase 0,1 % vào để trong 15 phút Dùng pipette Pasteur làm bong lớp tế bào hạt tụ xung quanh noãn Đánh giá phân loại noãn Chuyển noãn qua lame thực hiện bước nhuộm nhiễm sắc thể (a) Noãn trước khi nuôi (a) Noãn sau khi nuôi 26 (a) Noãn loại C (b) Noãn loại B (c) Noãn loại A Hình 3.6: Phân loại noãn trƣớc khi nuôi Sau khi nuôi, noãn được phân làm 3 loại (noãn chín, noãn tốt, noãn xấu). Chỉ có noãn chín mới dùng trong thụ tinh. Theo lý thuyết tế bào học về sự phát triển của noãn, các noãn có khả năng thụ tinh là noãn chín. Chúng đòi hỏi phải trưởng thành về nhân và tế bào chất. Sự trưởng thành về nhân được đánh giá thông qua xuất hiện thể cực thứ nhất ở noãn khi noãn bên trong nang vào trước giai đoạn xuất noãn (điều kiện in vivo) hay trong các môi trường nuôi noãn chín (điều kiện in vitro). Đây là chỉ tiêu đánh giá quan trọng nhất. Riêng sự trưởng thành tế bào chất chỉ có thể xác định qua khả năng hình thành tiền nhân sau khi tinh trùng xâm nhập và sự phát triển bình thường của tiền phôi. Trên cơ sở đó có hai chỉ tiêu để đánh giá phân loại noãn: Sự đồng nhất tế bào chất của noãn Sự xuất hiện thể cực thứ nhất (a) Noãn xấu (b) Noãn tốt (c) Noãn chín Hình 3.7: Phân loại noãn sau khi nuôi 27 Bảng 3.1: Phân loại noãn sau khi nuôi Noãn xấu Noãn tốt Noãn chín Là những noãn thoái hóa Tế bào chất không đồng nhất bị co cụm hoặc phân tán. Không xuất hiện thể cực thứ nhất. Là những noãn chưa chín Tế bào chất đồng nhất, chiếm hết xoang tế bào. Không xuất hiện thể cực thứ nhất. Là những noãn trưởng thành Tế bào chất đồng nhất, chiếm hết xoang tế bào. Xuất hiện thể cực thứ nhất. 3.4.9. Nhuộm noãn 3.4.9.1. Hóa chất Ethanol 100 % Acetic acid Acetol Acetol glycerol (glycerine: acetic acid: nước cất tỉ lệ 1:1:3) Acetol orcein (nước cất 16,3 ml: acetic acid 13,5 ml: orcein 0,3 g) . (a) Noãn xấu (b) Noãn tốt (c) Noãn chín Hình 3. 7: Phân loại noãn sau khi nuôi 27 Bảng 3. 1: Phân loại noãn sau khi nuôi Noãn xấu Noãn tốt Noãn chín Là những noãn thoái hóa. (a) Noãn trước khi nuôi (a) Noãn sau khi nuôi 26 (a) Noãn loại C (b) Noãn loại B (c) Noãn loại A Hình 3. 6: Phân loại noãn trƣớc khi nuôi Sau khi nuôi, noãn được phân làm 3 loại (noãn. về phòng thí nghiệm 23 3. 4 .3. Đánh giá buồng trứng chó Hình 3. 4: Nang đa noãn trên chó 3. 4.4. Phƣơng pháp chuẩn bị môi trƣờng 3. 4.4.1. Trên heo Chuẩn bị 7 đĩa petri