- 19 - Bảng 2.5 Thành phần đa lượng trong môi trường C Tên chất Khối lượng (g) pha cho 300 lít KH 2 PO 4 KNO 3 Ca(NO 3 ) 2 MgSO 4 52,680 193,938 265,050 121,680 Bảng 2.6 Thành phần vi lượng trong môi trường C Tên chất Khối lượng pha 1 lít Stock Fe FeSO 4 .7H 2 O EDTA MnSO 4 . 4H 2 O H 3 BO 3 CuSO 4 . 5H 2 O ZnSO 4 .7H 2 O Na 2 MoO 4 . 2H 2 O CoSO 4 . 6H 2 O KI 0,05 g 25 g 35 g 4,065 g 2,864 g 0,400 g 0,900 g 0,126 g 0,100 g 0,500 g Sau khi pha stock ta lấy ra 300 ml dòch dung stock, pha cho 300 lít dung dòch dinh dưỡng. 2.2.2.2 Thiết lập hệ thống trồng cây cà chua ng dụng phương pháp thuỷ canh không hồi lưu để thiết lập hệ thống này. Các hạt cà chua được làm ẩm và ủ vô trùng trên đóa petri giữ ở nhiệt độ phòng. Khi hạt nảy mầm khoảng 2 – 5 mm đem hạt chuyển vào những khối mút có kích thước 2×2×2 cm, có khoét lỗ ở giữa để bỏ hạt cà chua vào. Sau đó đem các khối mút đó bỏ vào trong các lỗ trên tấm xốp. Các dung dòch được chuẩn bò sẵn cho vào trong - 20 - các khay (mỗi khay một môi trường khác nhau), rồi ráp hai tấm xốp vào trong mỗi khay. Dung dòch trong khay phải ngập nửa tấm xốp. Các khay được đểû trong nhà lưới ở nhiệt độ thường. 2.2.2.3 Chỉ tiêu theo dõi - Theo dõi sự phát triển của cây cà chua trên 3 môi trường dinh dưỡng khác nhau. - Đo chiều cao của cây cà chua sau khoảng thời gian 5 ngày lập lại, sau khi trồng. Nội dung B: đánh giá tính kháng của cây cà chua trồng trong dung dòch đối với R. solanacearum. 2.3 Thời gian và đòa điểm 2.3.1 Thời gian Đề tài được thực hiện từ 06/2005 đến 08/2005. 2.3.2 Đòa điểm Nơi chủng bệnh: khu nhà lưới – Khoa Nông học – Trường đại học Nông Lâm TPHCM. Nơi phân lập và nuôi cấy: phòng thực tập bệnh cây – Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật - Trường đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. Nơi phân tích: Trung tâm phân tích thí nghiệm Hoá Sinh Trường đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. 2.3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Vật liệu dụng cụ 2.3.1.1 Vật liệu Đối tượng nghiên cứu: cây cà chua giống nhiễm trồng trong dung dòch thuỷ canh trong nội dung A. Vật liệu thí nghiệm: các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum: RST001, RST003, RST006, RSBog1, do Phạm Đặng Minh (2003) phân lập. Và RSCc1, - 21 - RSCc2, RSCc3, RSCc4, do chúng tôi phân lập được trên cây ký chủ cà chua trồng ở Củ Chi. Môi trường phân lập và nuôi cấy - PDA ( potato, sucrose, agar). - TZC (peptone, Glucose, Casein hydrolysate, TZC, Agar). - LB ( Trytone, Yeast extract, sodium chloride). Cấu trúc cặp primer PI–IS- F / PI-IS-R, sử dụng trong nghiên cứu này. Bảng 3.7 Trình tự primers PI-IS-F và PI-IS-R Primer Trình tự (5 / - 3 / ) Kích thước đoạn DNA khuếch đại Nguồn gốc PI–IS- F PI-IS-R CGCAACGCTGGATGAACCC CAGACGATGCGAAGCCTGAC 1,070 bp 1,070 bp Yung-An Lee (Đài Loan) Một sồ hoá chất, emzyme và dung dòch, sử dụng trong ly trích, phản ứng PCR và điện di. + TE 1X (pH =8) + SDS 10% ( Sodium Dodecyl Sulfate) + Taq polymerase (Bio – Rad) + Thang DNA (ladder) 1000bp (Bio – Rad) + Agarose (ultra pure DNA grade) 3.4.1.2 Dụng cụ Sử dụng các dụng cụ và trang thiết bò tại phòng thực tập bệnh cây – Bộ môn bảo vệ Thực Vật, Trung tâm phân tích Hoá Sinh – Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. - 22 - 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 3.4.2.1 Phương pháp lấy mẫu Chọn những vườn cây ký chủ cà chua, và tiến hành chọn những cây bò bệnh điển hình, gói lại trong 2 -3 lớp báo, dán nhãn ghi rõ triệu chứng, nơi lấy mẫu, họ tên ký chủ. 3.4.2.2 Phân lập nuôi cấy và tồn trữ mẫu Mẫu sau khi đem về, cắt lấy 10 -15 cm đoạn thân sát rễ, rửa sạch dưới vòi nước máy, ngâm trong cồn 70 0 khoảng 10 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng. Cắt đoạn thân trên thành những đoạn 5 – 10 cm đặt vào ống nghiệm chứa khoảng 5 ml nước cất vô trùng. Sau 3 – 5 phút, vớt bỏ phần thân trên, phần dòch tiết ra ở bề mặt vết cắt gọi là dòch thô. Dòch thô được pha loãng 1000 lần với nước cất vô trùng, lấy 300 ul dòch trên cấy vào môi trường PDA đã chuẩn bò sẵn, ủ ở nhiệt độ 27 0 C . Sau khoảng thời gian 12 giờ chọn ngẫu nhiên từng khuẩn lạc cấy trên môi trường TTC tiếp tục ủ ở nhiệt độ 27 0 C. Sau 4 – 5 ngày tiến hành chọn những khuẩn lạc mọc sớm (Tiếp tục nuôi cấy trên môi trường LB lắc lỏng (150 vòng/phút) ở nhiệt độ 27 0 C khoảng 16 giờ. Lấy 850 ul dòch này cho vào eppendorf và 150 ul glycerol, trộn đều, cất giữ mẫu ở -80 0 C. 3.4.2.3 Phương pháp xác đònh Ralstonia solanacearum bằng môi trường chọn lọc TZC Môi trường TZC sau khi hoà tan bằng nước cất điều chỉnh pH khoảng 7,1 - 7, sau đó đem vô trùng ở 121 0 C trong 15 phút. Các dòng vi khuẩn R. solanacearum sau hai ngày nuôi cấy trên môi trường LB lỏng (2 ml), thu vi khuẩn bằng cách li tâm 3000 vòng/phút. Rửa 2 lần bằng nước cất vô trùng. Hòa tan vi khuẩn vào 4 ml nước cất vô trùng lấy 10 ul cho vào đóa petri có môi trường TZC . Theo dõi trong vòng 3 – 5 ngày và ghi nhận kết quả. - 23 - 3.4.2.4 Phương pháp ly trích DNA tổng số Theo phương pháp của Sambrook (1989), có cải tiến. Bước 1: Nhân vi khuẩn trong môi trường LB lỏng khoảng 16 giờ Bước 2: Thu vi khuẩn bằng cách ly tâm. Điều kiện 6000 vòng, 5 phút, 4 0 C, bỏ hết phần dòch phía trên. Rửa vi khuẩn 2 lần bằng nước cất vô trùng Bước 3: Hoà vi khuẩn trong 567 ul dung dòch TE, 30ul dung dòch SDS 10%, sau đó ủ ở 37 0 C khoảng 1 giờ. Bước 4: Cho thêm vào 100 ul dung dòch NaCl5M, hoà lẫn thật kỹ. Bước 5: Thêm vào 80 ul dung dòch CTAB/ NaCl (khoảng 1/10 thể tích). Pha trộn thật kỹ, ủ ở 65 0 C trong 10 phút. Bước 6: Thêm 780 ul dung dòch hỗn hợp chloroform/isoamyl alcohol (24 : 1) hòa thật đều, ly tâm 10 phút ở 14000 vòng/ phút,4 0 C. Bước 7: Thu lấy dòch bên trên (dung dòch DNA) cho vào ống ly tâm mới. Bước 8: Chiết xuất dung dòch DNA với phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1), cùng thể tích với dung dòch DNA. Hòa lẫn đều, ly tâm 10 phút ở 12000 vòng/phút, 4 0 C. Bước 9: Thu lấy dung dòch bên trên cho vào ống ly tâm mới. Kết tủa DNA với isopropanol, dùng khoảng 0,6 thể tích của dung dòch. Rửa kết tủa với ethanol 70%. Thu bỏ phần dòch bên trên giữ lại kết tủa bằng cách ly tâm. Làm khô kết tủa. Bước 10: Hoà tan hoàn toàn DNA trong 100 ul TE. Cho thêm vào 1 ul dung dòch men RNAse, ủ phản ứng ở 37 0 C khoảng 2 giờ. Bước 11: Chiết xuất dung dòch DNA với phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1). Hoà thật đều, ly tâm 10 phút ở 12000 vòng/phút, 4 0 C. Bước 12: Thu phần dòch bên trên và chiết xuất với chloroform/isoamyl alcohol (24:1). Hoà lẫn kỹ, ly tâm 10 phút ở 12000 vòng /phút,4 0 C. - 24 - Bước 13: Thu phần dung dòch DNA bên trên. Thêm dung dòch sodium acetate3M, pH = 5,0 và isopropanol. 30 phút ở nhiệt độ -20 0 C, rửa kết tủa với ethanol 70%, thu kết tủa, làm khô. Bước 14: Hoà tan kết tủa trong 30 ul dung dòch TE. 3.4.2.5 Phương pháp PCR Phản ứng khuếch đại PCR được thực hiện theo quy trình của Holloway (1997), Có cải tiến. Thể tích phản ứng là 25 ul. Thành phần của phản ứng PCR dùng để xác đònh R. solanacearum. Bảng 3.8 Thành phần các chất trong phản ứng PCR Thành phần Lượng /phản ứng(ul) Nồng độ cuối Nước cất 10 mM dNTP / s 10 X PCR buffer MgCl 2 Primer PS-IS-F Primer PS-IS-R Taq DNA polymerase (5u/ul) Template DNA Tổng 18 0,5 2,5 1,5 1,1 1,2 0,2 2 25 - 200 Um 1X 1,5 uM 0,25 uM O,25 uM 0,5U - - Thiết lập phản ứng theo chu trình nhòêt - Bước 1: 94 0 C 2phút; 1 chu kỳ - Bước 2: 94 0 C 2 giây, 50 0 C 10 giây, 72 0 C 70 giây, 35 chu kỳ - Bước 3: 72 0 C 2 phút ; 1chu kỳ - Bước 4: 4 0 C Kỷ thuật đòên di - Chuẩn bò gel 1% (0,25 g agarose trong 25 ml dung dòch TAE 0,5 X ) - Sử dụng 5 ul sản phẩm PCR để kiểm tra kết quả phản ứng - Chạy điện di ở 100 V, 250 mA, 30 phút - Nhuộm gel với ethidium bromide, 10 phút - 25 - - Sử dụng máy agarose gel (trên phần mền quatity one) (Bio – rad) ghi nhận và đánh giá kết quả. 3.2.2.6 Đánh giá tính kháng của cây cà chua đối với R.solonacearum. Các dòng vi khuẩn sau khi xác đònh trên môi trường TZC và phương pháp PCR. Chúng tôi đã chọn 3 dòng vi khuẩn là RST001, RSCc2 và RSBog1, để làm thí nghiệm đánh giá tính kháng của cây cà chua trồng trong dung dòch. Cây cà chua trồng trong hệ thống thủy canh sau 14 ngày được dùng để chủng bệnh. Một dòng vi khuẩn chủng trong một hệ thống thuỷ canh riêng và 3 lần lập cho một dòng vi khuẩn. Và một hệ thống thuỷ canh dùng làm đối chúng không trủng bệnh. Phương pháp chủng bệnh theo Dogo và ctv(1997). Theo phương pháp này dùng vi khuẩn ở dạng huyền phù cho vào dung dòch dinh dưỡng với mật số cuối cùng là 10 8 cfu/ml.ø Theo dõi kết quả sau đó. Chỉ tiêu theo dõi - Theo dõi sau bao nhiêu ngày thì xuất hiện cây bò héo xanh đầu tiên.(số ngày). Theo dõi sau bao nhiêu ngày thì tất cả các cây bò héo xanh.( số ngày) - Theo dõi tỷ lệ chết của cây cà chua sau 14 ngày chủng: TLC (%) = (A*100) /B Trong đó: TLC: tỷ lệ chết A: số cây chết B: tổng số cây theo dõi 2.4.2.7 Khả năng sinh trưởng và phát triển của Ralstonia solanacearum trong hệ thống thuỷ canh Các dòng vi khuẩn R. solanacearum sau khi chủng vào trong hệ thống thuỷ canh để xác đònh xem nó có khả năng tồn tại và phát triển trong hệ thống thuỷ canh hay không. Bằng cách đếm mật số R. solanacearum sau khi chủng và các ngày sau đó phương pháp đếm mật số vi khuẩntrong hệ thống thuỷ canh: + tiến hành lấy 1ml dung dòch dinh dưỡng thủy canh cho vào eppendoff - 26 - ( một dòng vi khuẩn cho vào một eppendoff ) + pha loãng dung dòch vi khuẩn ở các mức 10 3 , 10 4 , 10 5 , với nước vô trùng, lắc đều. + Nhỏ 20ul dung dòch vi khuẩn ở một mức pha loãng lên đóa petri, với 3 lần lập lại cho một mức pha loãng, 3 mức pha loãng / đóa + Chờ dòch vi khuẩn khô, cho đóa petri vào tủ đònh ôn ở 27 0 C. + Sau 1 ngày đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường TZC, chọn mức pha loãng thích hợp cho việc đếm khuẩn lạc. Tính mật số vi khuẩn CFU/ml. - 27 - CHƯƠNG4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nội dung A: thiết lập hệ thống thuỷ canh trồng cà chua 4.1 Chọn lọc môi trường thích hợp cho cho cây cà chua trồng thuỷ canh Sau khi trồng thí nghiệm 3 loại môi trrường trên hệ thống thuỷ canh này và theo dõi. kết quả thu được là: Đối với môi trường dinh dưỡng A thì hạt cà chua không mọc được mà bò thối đen. Theo chúng tôi quan sát được thì trong dung dòch có hiện tượng bò kết tủa sau một thời gian (mới pha không có hiện tượng này). Vì vậy, theo chúng tôi thì có thể các thành phần của các nguyên tố đa lượng không cân bằng nên dẫn đến kết quả này. Đối với môi trường dinh dưỡng B thì ban đầu hạt mọc được lên đến khoảng 9 cm thì cây không phát triển nữa, thân cây nhỏ, lá không phát triển, mỗi cây chỉ có 4 lá. Theo chúng tôi trong thành phần dinh dưỡng của môi trường này bò thiếu một chất nào đó (có thể là phospho) làm cho cây không phát triển được. Đối vơí môi trường dinh dưỡng C thì hạt cà chua mọc lên được và phát triển tốt nhất trong 3 môi trường dinh dưỡng. Kết quả đo chiều cao cây với khoảng cách sau 5 ngày như sau. . nghiệm đánh giá tính kháng của cây cà chua trồng trong dung dòch. Cây cà chua trồng trong hệ thống thủy canh sau 14 ngày được dùng để chủng bệnh. Một dòng vi khuẩn chủng trong một hệ thống. chiều cao của cây cà chua sau khoảng thời gian 5 ngày lập lại, sau khi trồng. Nội dung B: đánh giá tính kháng của cây cà chua trồng trong dung dòch đối với R. solanacearum. 2 .3 Thời gian. 30 0 ml dòch dung stock, pha cho 30 0 lít dung dòch dinh dưỡng. 2.2.2.2 Thiết lập hệ thống trồng cây cà chua ng dụng phương pháp thuỷ canh không hồi lưu để thiết lập hệ thống này. Các hạt cà