21 D(-) acid lactic L(+) acid lactic Hình 2.2 Hai loại đồng phân acid lactic. L (+) acid lactic: đƣợc chuyển hóa hoàn toàn và nhanh chóng trong quá trình tổng hợp glycogen. D (-) acid lactic: đƣợc chuyển hóa ít hơn và phần không chuyển hóa sẽ đƣợc bài tiết dƣới dạng urine. Sự hiện diện của acid không đƣợc chuyển hóa trong ống tiêu hóa sẽ gây tình trạng nhiễm acid trong trao đổi chất (metabolic acidosis) ở trẻ sơ sinh. Một số loài Lactobacillus, tiêu biểu là L. acidophilus có sản xuất D (-) acid lactic nên lợi ích về mặt lâm sàng là không chắc chắn mặc dù đã sớm đƣợc sử dụng trong nhiều liệu pháp. Vì vậy, xu hƣớng mới trong sản xuất probiotic là tìm những nguồn vi sinh vật có khả năng tạo ra L (+) acid lactic sẽ an toàn hơn cho sức khỏe. Đại diện tiêu biểu thỏa mãn yêu cầu này là Lactobacillus sporogenes. Ngoài ra, acid lactic còn làm hạ pH đƣờng ruột còn 4 – 5. Do đó, sự phát triển của vi sinh vật gây thối và E. coli (thích nghi ở pH 6 – 7) bị ức chế. Sản xuất bacteriocin và các cơ chất kháng khuẩn Bacteriocin là protein hay hợp chất protein do vi khuẩn sản xuất có hoạt tính diệt khuẩn trực tiếp [23, 31]. Cơ chất này giúp vi khuẩn Lactobacillus thể hiện hoạt tính ức chế đối với các vi sinh vật gây thối trong hệ tiêu hóa. Bảng 2.5 Một vài loại bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus Tên bacteriocin Loài sản xuất Acidolin L. acidophilus Acidophilin L. acidophilus Lactacin B L. acidophilus 22 Lactacin F L. acidophilus Bulgarin L. bulgaricus Plantaricin SIK-83 L. plantarum Plantaricin A L. plantarum Lactolin L. plantarum Plantaricin B L. plantarum Lactolin 27 L. helveticus Helveticin J L. helveticus Reuterin L. reuteri Lactobrevin L. brevis Lactobacillin L. brevis Vi khuẩn Lactobacillus còn có thể ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây thối nhờ vào những sản phẩm trao đổi chất khác nhƣ: H 2 O 2 , CO 2 và diacetyl. Bảng 2.6 Tác dụng của một vài sản phẩm trao đổi chất của Lactobacillus [33] Sản phẩm trao đổi chất Tác dụng 1.Carbon dioxide Ức chế sự khử nhóm carboxyl? Làm giảm tính thấm của màng tế bào? 2. Diacetyl Tƣơng tác với các protein gắn kết arginine 3. Hydrogen peroxide / Lactoperoxidase Oxi hóa những protein cơ bản 2.4.5.2. Lợi ích trong dinh dƣỡng và trị liệu Các sản phẩm lên men từ sữa đã đƣợc dùng để chữa bệnh trong nhiều nền y học thời xa xƣa ở Trung Cận Đông. Tuy nhiên giá trị về mặt dinh dƣỡng và trị liệu của các vi khuẩn lactic vẫn còn đang đƣợc tranh cãi. Mặc dù vậy, một số nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng đã cho thấy ích lợi của Lactobacillus (xem Sơ đồ 2.1). 23 Các lợi ích về mặt dinh dƣỡng Nghiên cứu trên chuột cho thấy tốc độ phát triển và lƣợng ăn vào tăng lên khi cho ăn sữa chua chứa Lactobacillus [10]. Vài loài Lactobacillus có khả năng tự tổng hợp vitamin B. Hàm lƣợng các loại vitamin nhóm B và K trong sữa chua thƣờng cao hơn trong sữa tƣơi. Ngoài ra, tính chất sinh học tự nhiên của Cu, Fe, Ca, Zn, Mg và P cũng tăng lên khi dùng sữa chua làm thức ăn cho chuột [16]. Các lợi ích về mặt trị liệu Các chế phẩm chứa Lactobacillus đều cho thấy hiệu quả trong chữa trị vô số những rối loạn và viêm nhiễm bao gồm: viêm ruột kết, táo bón, tiêu chảy, đầy hơi, bệnh hepatic encephalopathy, ung bƣớu, lƣợng cholesterol trong máu cao, đau đầu và viêm Lactobacillus Trị liệu Dinh dƣỡng Phục hồi cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột Giải độc tố Cải thiện tình trạng không dùng đƣợc lactose Tăng cƣờng miễn dịch Loại bỏ carcinogen trong sản phẩm cuối Ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh trong thực phẩm Sản xuất vitamin nhóm B, K. Tăng cƣờng khả năng tiêu hóa các chất trong thực phẩm và tăng cƣờng những hoạt tính sinh học tự nhiên của chất dinh dƣỡng Sơ đồ 2.1 Ích lợi của Lactobacillus về mặt dinh dƣỡng và trị liệu [35] 24 âm đạo không điển hình, cải thiện tình trạng không sử dụng đƣợc lactose (lactose intolerance). Khẩu phần chứa Lactobacillus có tác dụng làm hạ cholesterol trong máu. Cơ chế tác động của Lactobacillus lên quá trình hình thành cholesterol có thể đƣợc biểu diễn nhƣ Hình 2.5. Hình 2.3 Cơ chế ngăn chặn sự hình thành và hấp thụ cholesterol [35] Ngoài ra, có nghiên cứu còn cho rằng Lactobacillus làm giảm lƣợng cholesterol gắn cholesterol vào khoang ruột [17]. Lactobacillus tạo ra enzyme beta – galactosidase (lactase), có tác dụng thủy phân lactose thành acid lactic [21]. Vì vậy, Lactobacillus giúp cải thiện tình trạng không sử dụng đƣợc lactose ở những ngƣời thiếu enzyme lactase. Vi khuẩn Lactobacillus sản xuất acid lactic và các cơ chất khác tạo một môi trƣờng bất lợi cho sinh vật gây thối phát triển trong đƣờng tiêu hóa. Do đó, lƣợng urase trong ruột giảm và kéo theo lƣợng NH 3 trong máu. Hơn nữa, pH thấp do acid lactic tạo ra gây trở ngại cho NH 3 hấp thu từ ruột vào mô và thúc đẩy việc bài tiết NH 3 từ máu vào ruột [24]. Những vi khuẩn gây thối rữa ở ruột kết tạo các enzyme beta-glucuronidase, azoreductase và nitroreductase chuyển hóa procarcinogen thành carcinogen, chất có vai trò trong việc hình thành và phát triển khối u. Bằng cách ức chế cạnh tranh và tạo môi Chất béo trong khẩu phần Nhũ hóa Hấp thụ Tổng hợp cholesterol Muối mật Lactobacillus ức chế enzyme khử hydroxymethyl glutarate CoA, enzyme này hạn chế tốc độ tổng hợp cholesterol Lactobacillus kết hợp với muối mật để ngăn cản muối mật đi vào vòng tuần hoàn máu. 25 trƣờng acid không thuận lợi, Lactobacillus đã kìm hãm sự trao đổi chất của vi khuẩn trong ruột kết. Có lẽ điều này làm giảm sự hình thành carcinogen ở ruột già [18]. Nhờ vào khả năng sản xuất acid lactic và bacteriocin trong đƣờng ruột, Lactobacillus cải thiện tình trạng tiêu chảy. Acid lactic cũng giúp tăng cƣờng nhu động ruột nên chữa đƣợc chứng táo bón. Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy các loài Lactobacillus có thể thúc đẩy khả năng sản xuất anfa-interferon, tính tự vệ của tế bào và hoạt tính của enzyme 2 – 5 A - synthase. Viện Pasteur ở Tokyo đã ghi nhận đƣợc lƣợng interferon tăng 65% ở những ngƣời tham gia thí nghiệm sau 2 tuần tiêu thụ chế phẩm chứa Lactobacillus [22]. Lactobacillus duy trì pH âm đạo ở khoảng 4 – 4,5 nhờ vào hoạt động lên men glycogen thành acid lactic. Đây là môi trƣờng không thích hợp cho mầm bệnh phát triển nhƣ Trichomonas vaginalis (protozoa kí sinh) và Candida albicans (nấm men),… [30] Khi dùng Lactobacillus kèm theo kháng sinh sẽ giúp ngăn ngừa các triệu chứng trên. Lactobacillus thông qua các hoạt động trao đổi chất của mình: tạo acid lactic, bacteriocin để cố định trong đƣờng ruột, âm đạo hay miệng và tạo môi trƣờng không phù hợp cho mầm bệnh phát triển. Lactobacillus có hiệu quả trong phục hồi sự cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột và giúp hình thành hệ vi sinh vật dạ cỏ. Nhờ vào sự giảm nồng độ NH 3 và hạn chế vi sinh vật gây thối nhiễm vào đƣờng ruột, Lactobacillus có hiệu quả kích thích tăng trƣởng ở thú nuôi [11]. 2.4.6. Các đặc tính giúp L. sporogenes vƣợt trội hơn các vi khuẩn Lactobacillus khác trong ứng dụng làm probiotic Ngoài những chức năng sinh học kể trên, L. sporogenes còn vƣợt trội hơn các vi khuẩn khác làm probiotic nhờ đáp ứng những yêu cầu của một loại probiotic lý tƣởng nhƣ: Có nguồn gốc tự nhiên và thích hợp với cơ thể ngƣời và vật nuôi Không mang độc tính hay bất kỳ một tác dụng phụ nào cho ngƣời và vật nuôi Có khả năng gắn vào tế bào biểu mô ruột và cố định trên trên đƣờng tiêu hóa để ngăn ngừa và chống mầm bệnh xâm nhập 26 Kháng đƣợc acid và mật, vẫn sống sau khi di chuyển từ dạ dày xuống ruột non Lên men và tạo ra L (+) acid lactic, đƣợc chuyển hóa hoàn toàn trong quá trình trao đổi chất nên không gây tình trạng nhiễm acid nhƣ D (-) acid lactic. Tỉ lệ sống cao sau khi trải qua quy trình sản xuất (thu hoạch, sấy khô,…) Tính ổn định cao ở nhiệt độ phòng khi trộn hay không trộn với những thành phần khác Có tác dụng cải thiện sức khỏe vật chủ Ngoài ra, L. sporogenes còn là loài Bacillus duy nhất dùng làm probiotic mang chứng nhận an toàn cho sức khỏe GRAS (Generally Recognise As Safe) do FDA (Food & Drug Administration) cấp. Vì những lý do kể trên giúp L. sporogenes ngày càng đƣợc ƣa chuộng hơn Lactobacillus quen thuộc khác. Điển hình nhất trong số này là L. acidophillus. Đây là loài vi khuẩn rất thông dụng và phổ biến có mặt trong sữa chua, các loại thực phẩm lên men khác và thuốc trị rối loạn tiêu hóa,… và đƣợc con ngƣời tin dùng từ rất lâu. Những đặc điểm vƣợt trội của L. sporogenes so với L. acidophilus đƣợc thể hiện qua Bảng 2.7. Bảng 2.7 Bảng liệt kê những ƣu điểm của L. sporogenes so với L. acidophillus Lactobacillus sporogenes Lactobacillus acidophilus Bào tử vẫn sống sau khi đã xử lý 100 o C/20 phút trong môi trƣờng đệm Tất cả tế bào sinh dƣỡng đều bị tiêu diệt sau khi thanh trùng Pasteur. 27 phosphate. Không yêu cầu phải có vitamin để sinh trƣởng và phát triển. Yêu cầu phải có vitamin cho sự sinh trƣởng. Khi gặp điều kiện bất lợi, tế bào sinh dƣỡng tạo thành bào tử chống chịu tốt với những điều kiện bất lợi: nhiệt độ, pH thấp trong đƣờng tiêu hóa, dịch mật, sấy khô, đông lạnh, bức xạ, hóa chất diệt khuẩn và kháng sinh. Vi khuẩn không tạo bào tử. Tế bào sinh dƣỡng rất nhạy cảm với nhiệt độ. Lên men đồng hình tạo ra L (+) acid lactic dễ dàng chuyển hóa trong cơ thể [13]. Sản xuất D (-) acid lactic có thể gây chứng nhiễm acid vào quá trình trao đổi chất (tài liệu 159, International Dairy Federeration, 1983) Khả năng tái sinh tốt và tính ổn định của bào tử nên vẫn đạt đƣợc hiệu quả chữa trị dù chỉ dùng một liều nhỏ. Khả năng tái sinh và tính ổn định của tế bào kém nên phải uống một lƣợng lớn. Có hạn dùng đến 3 năm khi trữ ở nhiệt độ phòng Bảo quản ở nhiệt độ 4-10 o C để giữ hoạt tính tế bào Tuy nhiên, L. sporogenes có một khuyết điểm duy nhất đó là thời gian tồn tại trong ống tiêu hóa chỉ trong 6 – 7 ngày. Cuối cùng, bào tử theo phân thải ra ngoài. Hiện nay, cơ chế và nguyên nhân của vấn đề này còn đang đƣợc nghiên cứu. 2.4.7. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng L. sporogenes 28 Từ khi đƣợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1933 đến nay, L. sporogenes đã trải qua nhiều nghiên cứu. Những khảo sát về độc tính, khả năng làm giảm cholesterol, trị viêm âm đạo không điển hình, trị rối loạn tiêu hóa,… đã chứng minh dần những đặc tính có lợi và vƣợt trội của vi khuẩn này. Các sản phẩm probiotic chứa L. sporogenes đƣợc sản xuất ngày một nhiều hơn nhƣ: Lactospore®, Sporlac®, SANVITA,…của Sabinsa Corporation, Lactopure của Pharmed Medicare, NaturaFlora® & NaturaFlora Kids Formula-Chewable® của Natura Health,… [35, 36, 37, 38] Một nghiên cứu của Tae-Han Kim và ctv (đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã thành công khi dùng N – methyl – N’ – nitro – N – nitrosoguanidine (NTG) gây đột biến kháng rifampicin cho L. sporogenes [20]. Điều mở ra hƣớng kết hợp L. sporogenes với loại kháng sinh này dùng làm thuốc mà không gây bất hoạt sự phát triển của L. sporogenes. 29 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 3.1.1. Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện từ 2/2005 đến 8/2005 3.1.2. Địa điểm Tại phòng vi sinh khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại học Nông Lâm, TPHCM 3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Mẫu khảo sát Chế phẩm sinh học (Thorne Research, USA) 3.2.2 Môi trƣờng Môi trƣờng phân lập và giữ giống: GYE (Glucose Yeast Extract) thạch đĩa và thạch nghiêng Môi trƣờng thử sinh hóa: GYE thạch nghiêng và lỏng, NB (Nutrient broth) bán lỏng, các môi trƣờng đƣờng Môi trƣờng khảo sát bào tử: GYE và MRSA thạch đĩa. Môi trƣờng bảo quản: bột đậu nành sấy khô và glycerol 3.2.3. Hóa chất Thuốc nhuộm Gram NaCl 9% 0 ; NaOH 0,1N; H 2 O 2 30%; FeCl 3 1N; phenol 1% 3.2.4. Thiết bị – dụng cụ Thiết bị: tủ sấy, tủ ấm, nồi hấp autoclave, bếp nấu, giá đỡ ống nghiệm Dụng cụ: kính hiển vi, ống nghiệm, đĩa petri 3.3. Nội dung đề tài Phân lập các chủng L. sporogenes từ các chế phẩm có sẵn Khảo sát khả năng sinh acid lactic của các chủng L. sporogenes phân lập đƣợc Khảo sát các điều kiện hình thành bào tử ở vi khuẩn L. sporogenes 30 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Tổng quan các bƣớc thực hiện đề tài Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu đặc điểm sinh trƣởng, phát triển của L. sporogenes 3.4.2. Phân lập vi khuẩn Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập và định danh L. sporogenes Lấy mẫu Phân lập Khảo sát Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn Đặc điểm sinh hóa Xác định khả năng tạo acid lactic Khảo sát hình thái khuẩn lạc Khả năng tạo bào tử Nhuộm Gram (trực khuẩ n, Gram (+) ), sinh bào tử ở mộ t đầ u. Kiểm tra phản ứng sinh hóa Đánh giá Môi trƣờng GYE, 37 o C/48 giờ Môi trƣờng GYE để giữ giống ở nhiệt độ phòng Mẫu . tử ở vi khuẩn L. sporogenes 30 3. 4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3. 4.1. Tổng quan các bƣớc thực hiện đề tài Sơ đồ 3. 1: Sơ đồ nghiên cứu đặc điểm sinh trƣởng, phát triển của L. sporogenes. L. sporogenes 3. 4.2. Phân lập vi khuẩn Sơ đồ 3. 2: Quy trình phân lập và định danh L. sporogenes Lấy mẫu Phân lập Khảo sát Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn Đặc điểm sinh hóa Xác. L. brevis Lactobacillin L. brevis Vi khuẩn Lactobacillus còn có thể ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây thối nhờ vào những sản phẩm trao đổi chất khác nh : H 2 O 2 , CO 2 và diacetyl.