19 Hình 2.6. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí detector ion hóa ngọn lửa FID 2.6.2. Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) Sắc ký khối phổ là một loại sắc ký đặc biệt, vì sau khi ra khỏi cột sắc ký, các cấu phần được lần lượt cho vào buồng MS để thực hiện việc ghi phổ của từng cấu phần. Nhờ một phần mềm, các phổ MS này được so sánh với các phổ MS chuẩn chứa trong thư viện của máy tính. Do đó để tăng độ chính xác cho sự dò tìm và so sánh, thư viện phổ khối lượng cần phải có nhiều phổ chuẩn. Độ tương hợp giữa phổ MS của các cấu phần và phổ mẫu có tính tương đối tùy thuộc phần mềm phụ trách việc so sánh, thường thì độ tương hợp càng lớn thì xác suất định danh càng cao. Kinh nghiệm về thành phần hóa học và kiến thức về phổ khối lượng quyết định rất lớn độ chính xác của kết quả định danh. Đầu dò phổ khối lượng có độ nhạy cao, khoảng 10 -6 – 10 -9 g, do đó có thể xác định được những cấu phần có hàm lượng thấp mà các phương pháp khác không thể thực hiện được. Sắc ký khối phổ có khả năng định danh cao, khả năng dò tìm nhanh, lượng mẫu sử dụng ít [5]. 20 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH  Thời gian: từ 3/2005 – 8/2005.  Địa điểm lấy mẫu: Phường An Phú Đông, quận 12, Tp. HCM.  Địa điểm tiến hành thí nghiệm: phòng Hóa Lý - Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh và khoa Hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh. 3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ  Vật liệu: hoa lài 20 kg.  Hóa chất sử dụng trong chiết xuất: petroleum ether (Trung Quốc), ethanol (Trung Quốc), hexan (Trung Quốc), diethyl ether (Trung Quốc) và natrisulphate (Trung Quốc).  Thiết bị: Cân điện tử BP 210S – Sartorius AG Gottingen (Đức). Máy lắc Orbital shaker SO1 – Stuart Scientific (Anh). Bồn siêu âm Power sonic 510 – Hwashin Technology Co. (Hàn Quốc). Bộ chưng cất hơi nước Clevenger (Việt Nam). Máy cô quay chân không Buchi Rotavapor R – 200 – Buchi (Thụy Sĩ). Khúc xạ kế WAY – S ABBE. Tỷ trọng kế (Việt Nam). Máy sắc ký khí HP 6890 N (G1540N) – Agilent Technologies (Mỹ). Máy sắc ký khối phổ HP 6890 N (G1530N) – Agilent Technologies (Mỹ). 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Khảo sát đặc điểm sinh học cây hoa lài ở An Phú Đông, Thành phố HCM.  Chiết xuất tinh dầu hoa lài bằng các phương pháp và dung môi khác nhau.  Xác định các cấu tử trong tinh dầu hoa lài.  Xác định tính chất vật lý và hóa học của tinh dầu hoa lài. 21 3.3.1. Khảo sát đặc điểm sinh học cây hoa lài Đối tượng khảo sát: hoa lài 6 năm tuổi ở An Phú Đông, quận 12, Tp. HCM.  Khảo sát đặc điểm hình thái, màu sắc: thân, lá, hoa,…  Đặc điểm sinh thái: nhiệt độ, độ ẩm.  Mật độ trồng cây hoa lài.  Khảo sát kinh nghiệm của các chủ vườn.  Từ các đặc điểm thu được, đối chiếu với các tài liệu phân loại để xác định đúng tên khoa học. 3.3.2. Chiết xuất tinh dầu hoa lài Tiến hành chiết xuất tinh dầu hoa lài bằng 3 phương pháp: ngâm chiết tĩnh, ngâm chiết động và chưng cất hơi nước cổ điển. 3.3.2.1. Phƣơng pháp ngâm chiết tĩnh Thực hiện trên 2 qui trình: qui trình 1 và qui trình 2. 22 a. Qui trình 1 Thực hiện trên 3 dung môi: petroleum ether, ethanol và hexan. Sơ đồ 3.1. Phương pháp ngâm chiết tĩnh, qui trình 1. Dung dịch III Ngâm 24 giờ Lọc Dung dịch II Xác hoa 120 ml dung môi Dung dịch I Xác hoa 120 ml dung môi 30g hoa + 120 ml dung môi - Ngâm 24 giờ - Lọc - Ngâm 24 giờ - Lọc Lọc Đồng hóa dung dịch I, II, III Thêm 30 g Na 2 SO 4 Cô quay Thêm 5 ml ethanol -5 o C, 2 ngày Lọc tách Na 2 SO 4 và tạp chất Đem phân tích Cân 23 b. Qui trình 2 Thực hiện trên 3 dung môi: petroleum ether, ethanol và hexan. Sơ đồ 3.2. Phương pháp ngâm chiết tĩnh, qui trình 2. Đem phân tích 10 g hoa + 120 ml dung môi Lọc lấy dịch trích Lọc lấy dịch trích Ngâm 24 giờ Thêm 30 g Na 2 SO 4 Cô quay, 40-55 o C Thêm 5ml ethanol Lọc 10 g hoa 10 g hoa Ngâm 24 giờ Ngâm 24 giờ, lọc Lọc -5 o C, 2 ngày Cân 24 3.3.2.2. Phƣơng pháp ngâm chiết động Thực hiện trên 3 dung môi: petroleum ether, ethanol và hexan với phương pháp lắc và siêu âm. Sơ đồ 3.3. Phương pháp ngâm chiết động. Dung dịch II Xác hoa 120 ml dung môi Dung dịch III Lắc/siêu âm 30 phút Để yên 15 phút, lọc Dung dịch I Xác hoa 120 ml dung môi 30g hoa + 120 ml dung môi - Lắc/siêu âm 30 phút - Để yên 15 phút, lọc - Lắc/siêu âm 30 phút - Để yên 15 phút, lọc Lọc Đồng hóa dung dịch I, II, III Thêm 30 g Na 2 SO 4 Cô quay Thêm 5 ml ethanol -5 o C, 2 ngày Lọc tách Na 2 SO 4 và tạp chất Đem phân tích Cân 25 3.3.2.3. Phƣơng pháp chƣng cất hơi nƣớc cổ điển Hoa lài 300 g cho vào bình cầu, cho vào 500 ml nước. Đun bình tới sôi, hơi nước bay sẽ cuốn theo tinh dầu, hơi nước cùng tinh dầu qua hệ thống sinh hàn sẽ ngưng tụ lại. Tinh dầu hoa lài nhẹ hơi nước sẽ ở phía trên, dùng bình chiết phân ly để tách nước và thu lấy tinh dầu. Phần tinh dầu này vẫn còn lẫn ít nước, dùng diethyl ether trích để thấy rõ sự phân lớp giữa tinh dầu và nước. Tiếp tục dùng bình chiết để tách hết nước và thu lấy tinh dầu cùng với diethyl ether, làm khan tinh dầu bằng Na 2 SO 4 . Cô quay dưới áp suất thấp (nhiệt độ phòng) loại diethyl ether ta thu được tinh dầu tinh khiết. Sơ đồ 3.4. Phương pháp chưng cất hơi nước cổ điển Hoa lài Bình chưng cất Hệ thống ngưng tụ Bình chiết phân ly tinh dầu và nước Phần tinh dầu Tinh dầu tinh khiết - Trích bằng diethyl ether - Tách hết nước - Làm khan bằng Na 2 SO 4 - Thu hồi diethyl ether Hình 3.1. Hệ thống chưng cất hơi nước 26 3.3.3. Xác định các cấu tử trong tinh dầu hoa lài Tinh dầu hoa lài được xác định thành phần trên GC/MS. Chương trình nhiệt và các thông số thực nghiệm được điều chỉnh trên GC, các thông số này được tối ưu hóa và áp dụng trên GC/MS. Sau đây là các điều kiện thực nghiệm trên GC và GC/MS. 3.3.3.1. Trên sắc ký khí (GC) - Nhiệt độ lò: 50 o C - Đầu dò FID 250 o C - Dòng H 2 : 30 ml/phút N 2 : 45 ml/phút Không khí: 100 ml/phút - Tỉ lệ chia dòng 1:50 - Cột Model No: Agilent 19091J – 413 HP-5 Phenyl Methyl Siloxane 30 m 320 μm 0,25 μm. - Chương trình nhiệt: nhiệt độ đầu 50 o C, tăng 4 o C/phút đến 290 o C kết thúc. Thời gian tổng cộng 60 phút. 3.3.3.2. Trên sắc ký khối phổ (GC/MS) - Nhiệt độ lò: 50 o C - Đầu dò MS 250 o C - Cột DB5-MS 30 m 0,25 mm 0,25 μm. - Tỉ lệ chia dòng 1:50 - Chương trình nhiệt: nhiệt độ đầu 50 o C, tăng 4 o C/phút đến 290 o C kết thúc, giữ trong 5 phút. Thời gian tổng cộng 65 phút. 3.3.4. Xác định tính chất vật lý và hóa học của tinh dầu hoa lài 3.3.4.1. Tính chất vật lý Sử dụng tinh dầu hoa lài ly trích từ phương pháp chưng cất hơi nước cổ điển để xác định tính chất vật lý. a. Tỷ trọng Hình 3.3. Máy sắc ký khí ghép khối phổ Hình 3.2. Máy sắc ký khí 27 Tỷ trọng của tinh dầu là tỉ số khối lượng tinh dầu trên khối lượng của cùng một thể tích nước cất ở cùng nhiệt độ. Dụng cụ: Tỷ trọng kế (Việt Nam), cân phân tích 4 số nhiệt kế chia vạch 0,2 o C Cho nước cất vào đầy tới cổ bình 5 ml, đậy nút, lau khô phần nước trào. Cân trên cân phân tích xác định khối lượng nước (m H20 ). Thay nước cất bằng tinh dầu rồi cân xác định khối lượng tinh dầu (m TD ). Mỗi thí nghiệm tiến hành 3 lần lặp lại, xác định m H2O , m TD . Tỷ trọng d = m TD m H2O b. Chỉ số khúc xạ Chỉ số khúc xạ (chiết xuất) của tinh dầu là tỉ số giữa sin góc tới và sin góc khúc xạ của một tia sáng có độ dài sóng xác định đi từ không khí qua tinh dầu ở nhiệt độ nhất định. Dụng cụ: Khúc xạ kế có chỉ số khúc xạ từ 1,3000 đến 1,7000 với độ chính xác 0,0002. Mỗi lần nhỏ 2 giọt tinh dầu hoa lài lên lăng kính của khúc xạ kế, chỉnh máy, ghi nhận nhiệt độ và chiết suất của tinh dầu. Thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả lấy giá trị trung bình. 3.3.4.2. Tính chất hóa học Sử dụng tinh dầu hoa lài ly trích từ phương pháp chưng cất hơi nước cổ điển để xác định tính chất hóa học. a. Chỉ số acid Chỉ số acid (IA) là số mg KOH cần thiết để trung hòa các acid tự do có trong 1 g tinh dầu. Dụng cụ và hóa chất: Bình cầu 100 ml, ống đong 5 ml, ống nhỏ giọt 25 ml, phenolphtalein, KOH (0,1 mol/l ethanol), ethanol 95 %. KOH trung hòa acid tự do trong tinh dầu theo phản ứng: ROOH + KOH  ROOK + H 2 O Hình 3.4. Khúc xạ kế . tinh dầu hoa l i bằng các phương pháp và dung môi khác nhau.  Xác định các cấu tử trong tinh dầu hoa l i.  Xác định tính chất vật l và hóa học của tinh dầu hoa l i. 21 3. 3.1. Khảo sát. đặc điểm sinh học cây hoa l i Đối tượng khảo sát: hoa l i 6 năm tuổi ở An Phú Đông, quận 12, Tp. HCM.  Khảo sát đặc điểm hình thái, màu sắc: thân, l , hoa, …  Đặc điểm sinh thái: nhiệt độ,. của tinh dầu hoa l i 3. 3.4.1. Tính chất vật l Sử dụng tinh dầu hoa l i ly trích từ phương pháp chưng cất hơi nước cổ điển để xác định tính chất vật l . a. Tỷ trọng Hình 3. 3. Máy sắc ký