51 Coefficient 0.66 0.75 0.83 0.92 1.00 NP10 NP1 NP6 NP7 NH11 NP4 NH27 NP5 BA48 BA49 NH26 NP8 NP9 NH12 NH18 NH24 NH20 NH21 NH23 NH22 NS40 NS37 NS39 NS38 NS31 BA42 NS32 NS34 NS35 NH29 NH30 NS33 NS41 BA43 NH16 NP3 NH13 NS36 NH15 NH17 BA50 NP10 NP2 BA46 BA44 NH25 BA45 BA47 Hình 4.14: Cây phát sinh chủng loại của 47 mẫu điều tại tỉnh Ninh Thuận X Y A B BII BI Similarity Coefficient 52 Để đánh giá tổng quát quần thể điều toàn tỉnh, chúng tôi đã tiến hành lập cây phát sinh chủng loại thể hiện quan hệ di truyền giữa 47 mẫu điều nghiên cứu (hình 4.14). Kết quả cho thấy các mẫu chia thành hai nhóm lớn (X và Y) có hệ số đồng dạng di truyền là 0,66. Trong 47 mẫu phân tích nhóm X chỉ có 6 mẫu, do đó có thể phân biệt 6 mẫu này với các mẫu còn lại. Trong nhóm X mẫu NP2 và BA4 có hệ số đồng dạng di truyền 0,93 và cùng có hệ số đồng dạng di truyền với NH5 khoảng 0,87. Điều này cho thấy các mẫu này có quan hệ di truyền rất gần nhau và khá xa với các mẫu khác. 6 mẫu nhóm X được phân bố trên cả 3 huyện Ninh Phước, Ninh Hải và Bác Ái của tỉnh Ninh Thuận. Nhóm Y lại chia thành hai nhóm A và B có hệ số đồng dạng di truyền khoảng 0,68. Nhóm B chia làm 2 nhóm nhỏ BI và BII. Nhóm BII chỉ có một mẫu NP10, trên thực tế mẫu này có tính trạng đặc biệt là cây rất ít trái, tuy nhiên về mặt kiểu gene lại không có những band khác lạ. Nhóm BI gồm 6 mẫu NP3, NH13, NS36, NH15, NH17 và BA50 có hệ số đồng dạng di truyền dao động từ 0,86 đến 1,00. Có thể nhóm BI là một giống và được phân bố đều ở 4 huyện Ninh Phước, Ninh Hải, Ninh Sơn và Bác Ái. Nhóm A chia thành rất nhiều nhóm nhỏ, các mẫu trong nhóm này phân bố đều khắp tỉnh Ninh Thuận. Có thể nhóm này chỉ gồm một vài giống nhưng có sự lai hỗn tạp giữa các cá thể trong vườn, dẫn đến các cây lai có sự khác nhau ở một vài band trên gel điện di. Đặc biệt là mẫu NH16 có kiểu gene rất khác với các mẫu trong nhóm, band 1100 bp chỉ xuất hiện ở mẫu NH16 và BA47, nhưng ở mẫu NH16 band này rất sáng trong khi mẫu BA47 rất mờ. Band 1100 bp là một band đặc biệt, có thể là marker của một tính trạng nào đó nhưng trong giới hạn khóa luận này chúng tôi chưa xác định rõ. Để tìm hiểu sâu hơn, nên tách band này ra giải trình tự DNA nhằm phục vụ cho việc nhận định: xem đây có phải là một marker của tính trạng nào không? Qua cây phát sinh chủng loại ở hình 4.14 cho thấy hệ số đồng dạng di truyền giữa các mẫu phân tích biến thiên từ 0,66 đến 1,00. Điều này chứng tỏ các mẫu có đặc điểm di truyền tương đối gần nhau nhưng cây phát sinh chủng loại có rất nhiều nhánh cho thấy quần thể điều hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận có nguồn gene rất phong phú. Mẫu số 47 có kiểu gene khá xa với các mẫu còn lại và trên thực tế mẫu này có tính trạng đặc biệt là khi chín trái màu xanh. Các mẫu NP2, NH25, BA44, BA45 và BA46 có 53 kiểu gene khá gần nhau và khác xa với các mẫu khác nhưng trên thực tế mẫu NH25 lại có tính trạng đối lập với các mẫu NP2, BA44 và BA46. Các mẫu NH16, NH17 và NS34 có những tính trạng gần nhau (một năm 2, 3 đợt trái) nhưng kiểu gene lại khá xa nhau. Tuy nhiên cũng có các mẫu có kiểu hình giống nhau và kiểu gene cũng gần nhau như mẫu NP8, NP9, NH12, NH18 và NH24; mẫu NP4 và NH27; mẫu NP3, NH13 và NS36 Kết quả trên cho thấy tính đa hình của quần thể điều tại tỉnh Ninh Thuận đối với primer 11 và tính trạng kiểu hình thực tế có sự khác biệt rất lớn, cần phải nghiên cứu kỹ về chỉ thị DNA để có cơ sở chọn giống phù hợp và hiệu quả. 4.3.5. Một vài điểm lƣu ý khi thực hiện kỹ thuật RAPD  Không dùng giấy dán vào thành eppendorf để đánh dấu mẫu khi chạy RAPD - PCR  RAPD – PCR rất nhạy cảm với các thành phần hóa chất, chỉ cần thay đổi 1 yếu tố thì sản phẩm thu được sẽ khác nhau. Do đó cần kiểm tra lại toàn bộ quy trình khi có sự thay đổi về một yếu tố nào đó  Khi thay đổi về nhiệt độ bắt cặp của primer thì thường biến thiên 2 0 C, thay đổi 1 0 C ít có sự khác biệt  Máy PCR khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau. Khi gặp trở ngại về việc điện di thì nguyên nhân có thể do:  Kỹ thuật đổ gel: Agarose chưa tan đều hoặc do agarose quá nguội khi đổ.  Điện trường của máy điện di: Do điện thế không ổn định hoặc điện cực bị cong.v.v.  Dung dịch điện di: Cần thay dung dịch điện di khác. 4.4. Kết quả bƣớc đầu của việc sử dụng kỹ thuật AFLP trong nghiên cứu tính đa hình của một số mẫu Chúng tôi thực hiện kỹ thuật AFLP đối với 12 tổ hợp primer chọn lọc trên 4 mẫu NP10, NH12, NS40 và BA46 54 Bảng 4.2:Kết quả các cặp tổ hợp primer chọn lọc dùng trong AFLP Tổ hợp Primer MseI Primer EcoRI Màu huỳnh quang Số band 1 MseI-CAA EcoRI-ACT xanh dương 16 2 MseI-CAA EcoRI-AAC vàng 1 3 MseI-CAA EcoRI-AGG xanh lá cây 19 4 MseI-CAA EcoRI-ACC xanh dương 2 5 MseI-CAA EcoRI-AGC vàng 4 6 MseI-CAA EcoRI-ACG xanh lá cây 1 7 MseI-CAG EcoRI-ACA xanh dương 5 8 MseI-CAG EcoRI-AGC vàng 6 9 MseI-CAG EcoRI- AAG xanh lá cây 4 10 MseI-CAG EcoRI-AGT xanh dương 3 11 MseI-CAG EcoRI-AAC vàng 3 12 MseI-CAG EcoRI-AGG xanh lá cây 2 4.4.1. Kết quả phản ứng cắt và gắn Hình 4.15: Sản phẩm phản ứng cắt và gắn (ĐC: Đối chứng) Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng cắt và gắn cho thấy DNA bị cắt thành rất nhiều đoạn nhỏ trải dài trên gel điện di. Phản ứng được thực hiện khá thành công, DNA được cắt hoàn toàn. NP10 NH12 NS40 BA46 ĐC 55 4.4.2. Kết quả khuếch đại tiền chọn lọc Hình 4.16: Sản phẩm PCR tiền chọn lọc (ĐC: Đối chứng) Qua hình 4.16 cho thấy kết quả PCR tiền chọn lọc chưa tốt lắm. Lượng sản phẩm tạo thành còn ít nên kết quả điện di còn mờ và chưa thấy dấu hiệu phân chia các band. Tuy nhiên với kết quả này có thể thực hiện tiếp giai đoạn PCR với các tổ hợp primer chọn lọc. 4.4.3. Kết quả khuếch đại chọn lọc Sau khi điện di sản phẩm PCR khuếch đại chọn lọc trên máy giải trình tự DNA, chúng tôi nhận thấy 2 cặp tổ hợp primer 1 và 3 là cho kết quả tốt nhất. Cặp primer 1 cho 16 band và cặp primer 3 cho 19 band, tuy nhiên cặp primer 1 cho band ở cả 4 mẫu trong khi cặp primer 3 chỉ cho các band ở mẫu BA46, NS40 và NH12. 2 cặp primer này có thể được dùng để chạy AFLP trong việc đánh giá đa dạng quần thể điều. Hình 4.17: Các band thể hiện dƣới dạng peak trong kết quả điện di trên máy giải trình tự DNA Trong 12 cặp primer chọn lọc được sử dụng có 6 cặp dùng primer MseI-CAA và 6 cặp dùng primer MseI-CAG. Vậy sự khác biệt của kết quả là dựa vào primer EcoRI-AXX. Ở đây kết NP10 NH12 NS40 BA46 ĐC 56 quả thu được chỉ có 35 band (số band của tổ hợp primer 1 và 3) và mẫu NP10 chỉ có 4 band, mẫu NH12 có 6 band. Điều này cho thấy việc sử dụng tổ hợp primer EcoRI-AXX thu được thông tin quá ít, có thể chưa đủ số liệu để đánh giá chính xác mối quan hệ của các mẫu nghiên cứu. Để thu được lượng thông tin nhiều hơn nên khảo sát thêm các tổ hợp primer EcoRI-AX. Sau khi điện di sản phẩm PCR chọn lọc trên máy giải trình tự DNA, kết quả được đưa qua phần mềm NTSYS để sử lý số liệu (mã hóa số liệu được trình bày ở bảng 4.4 phần phụ lục II) Bảng 4.3: Hệ số đồng dạng di truyền của 4 mẫu điều trong kỹ thuật AFLP Tên Mẫu NP10 NH12 NS40 BA46 NP10 1.0000000 NH12 0.6774194 1.0000000 NS40 0.4193548 0.2258065 1.0000000 BA46 0.5161290 0.1935484 0.5806452 1.0000000 Qua bảng 4.3 chúng tôi thấy hệ số đồng dạng di truyền biến thiên từ 0,19 đến 0,67, các mẫu này có quan hệ di truyền rất xa nhau, so với bảng 4.1 hệ số đồng dạng di truyền của các mẫu khác nhau. Điều này nói lên mức độ tin cậy giữa 2 kỹ thuật. Tuy nhiên vì kỹ thuật AFLP chỉ thực hiện trên 4 mẫu và chỉ ở mức độ khảo sát 12 cặp tổ hợp primer nên chưa thể đưa ra kết luận để so sánh và đánh giá các mẫu. Coefficient 0.34 0.42 0.51 0.59 0.68 NP10 NP10 NH12 NS40 BA46 Hình 4.18: Cây phát sinh chủng loại của 4 mẫu trong kỹ thuật AFLP Qua hình 4.18 chúng tôi thấy mẫu NP10 và NH12 có hệ số đồng dạng di truyền khoảng 0,68 gần giống với kỹ thuật RAPD (0,61). Mẫu NS40 và BA46 có quan hệ di truyền giống nhau khoảng 58% trong khi kỹ thuật RAPD là 76%. Điều này cho thấy độ tin cậy của 2 kỹ thuật có một sự chênh lệch nhất định. Similarity Coefficient 57 CHƢƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1.Kết luận Từ các kết quả thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:  Quy trình tách chiết DNA của lá điều khá ổn định. Ly trích được 50 mẫu (trên tổng số 55 mẫu) đạt DNA tiêu chuẩn dùng trong các kỹ thuật sinh học phân tử  Quy trình RAPD – PCR tốt nhất là quy trình ở nghiệm thức 2 của thí nghiệm 3 (Bảng 3.5 trang 31).  Primer 11 dùng trong kỹ thuật RAPD – PCR cho 13 band đối với các mẫu thí nghiệm, trong đó có 2 band đồng hình và 11 band đa hình. Primer 11 có tính đa hình cao đối với quần thể điều.  Với việc phân tích RAPD sử dụng primer 11 thì quần thể điều hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận có hệ số đồng dạng di truyền trên cây phát sinh chủng loại dao động trong khoảng 0,65 – 1,00.  Cây phát sinh chủng loại có rất nhiều nhánh chứng tỏ quần thể điều ở tỉnh Ninh Thuận có sự tạp giao rất phức tạp.  Quy trình kỹ thuật AFLP ổn định, 2 tổ hợp primer MseI-CAA với EcoRI-ACT và MseI-CAA với EcoRI-AGG cho tính đa hình cao, có thể được dùng để đánh giá tính đa dạng của quần thể điều. 5.2. Đề nghị  Tối ưu quy trình ly trích DNA đối với lá điều non bằng cách cho thêm 10% CTAB vào bước 3, tiếp theo cho dung dịch kết tủa vào, sau đó cho dung dịch NaCl – TE.  Khảo sát thêm các primer khác dùng trong kỹ thuật RAPD  Tách riêng các band 750 bp và 1100 bp khi chạy RAPD với primer 11 để giải trình tự nhằm giải đáp cho sự chênh lệch giữa các mẫu và phục vụ cho công tác phân biệt và chọn giống.  Thực hiện kỹ thuật AFLP đối với các tổ hợp primer chọn lọc khác và trên các tổ hợp primer chọn lọc MseI-CXX với EcoRI-AX. 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nƣớc: 1. Nguyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thị Hằng, Nông Văn Hải, 2005. Nghiên cứu đa hình một số giống tằm dâu bằng kỹ thuật RAPD. Tạp chí di truyền học và ứng dụng 2. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,1999. Di truyền phân tử: những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản nông nghiệp TP Hồ Chí Minh. 275 trang 3. Hoàng Chương và Cao Vĩnh Hải,1999. Kỹ thuật trồng điều. Nhà xuất bản nông nghiệp TP Hồ Chí Minh.Trang 3; 12-14; 21-26; 34-39 4. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2002. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 24-30; 122-124. 5. Đỗ Thị Hòa, 2005. Bước đầu điều tra hiện trạng canh tác và xây dựng ngân hàng di truyền invitro các giống điều ở một số huyện trồng điều chính ở Tỉnh Bình Dương. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Nông Học - Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. 6. Phạm Thành Hổ, 1998. Di truyền học. Nhà xuất bản giáo dục TP Hồ Chí Minh. 612 trang. 7. Nguyễn Thị Huyền, 2005. Bước đầu xây dựng ngân hàng gen trên cây điều ở một số huyện của tỉnh Đồng Nai. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Nông Học - Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 8. Hoàng Thị Liễu, 2004. Phân tích mức độ đa dạng di truyền và xây dựng phương pháp nhận diện một số giống cacao trên cơ sở kỹ thuật PCR. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Nông Học - Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 9. Khuất Hữu Thanh, 2003. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 221 trang. 10. Phạm Đình Thanh, 2003. Hạt điều: sản xuất và chế biến. Nhà xuất bản nông nghiệp TP Hồ Chí Minh. Trang 9-12; 28-36. 11. Nguyễn Đức Thành, 2004. Một số kỹ thuật chỉ thị phân tử. Nhà xuất bản viện khoa hoc và công nghệ Việt Nam – Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội. 12. Lê Duy Thành, 2001. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 159 trang. 59 13. Nguyễn Văn Uyển, 1996. Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật - tập II. Nhà xuất bản nông nghiệp TP Hồ Chí Minh. trang 56. Tài liệu nƣớc ngoài: 14. Kazutoshi Okuno and shuichi Fukuoka, 1998. Manual for DNA extraction in plants. Japan international cooperation agency. 15. Sunil Archak, Ambika B. Gaikwad, Diksha Gautam, E.V.V.B. Rao, K.R.M. Swamy and J.L. Karihaloo, 2003. DNA fingerprinting of Indian cashew (Anacardium occidentale L.) varieties using RAPD and ISSR techniques. Euphytica 230: p. 397 - 404 16. Samal. S, Rout G.R., Lenka P.C., 2003. Analysis of genetic relationships between populations of cashew (Anacardium occidentale L.) by using morphological characterisation and RAPD markers. Plant soil environ 49: p. 176 - 182 17. http://www.keygene.com/technologies/technologies_aflp.htm 18. http: //www.biotech.ufl.edu/WorkshopsCourses/ Word_files/AFLP%20Workshop%20Manual.doc 19. http: //www.weihenstephan.de/pbpz/bambara/html/rapd.htm . RAPD (0 ,6 1). Mẫu NS40 và BA 46 có quan hệ di truyền giống nhau khoảng 58% trong khi kỹ thuật RAPD l 76% . Điều này cho thấy độ tin cậy của 2 kỹ thuật có một sự chênh l ch nhất định. Similarity. NTSYS để sử l số liệu (mã hóa số liệu được trình bày ở bảng 4.4 phần phụ l c II) Bảng 4. 3: Hệ số đồng dạng di truyền của 4 mẫu điều trong kỹ thuật AFLP Tên Mẫu NP10 NH12 NS40 BA 46 NP10 1.0000000. primer 11 thì quần thể điều hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận có hệ số đồng dạng di truyền trên cây phát sinh chủng loại dao động trong khoảng 0 ,65 – 1,00.  Cây phát sinh chủng loại có rất