31 Clark dùng điện cực alcohol oxydoreductase để xác đònh nồng độ cồn. Ngoài ra enzyme còn có thể dùng vào nhiều mục đích khác nhau như: hoạt hóa zymogen, nghiên cứu cấu trúc phân tử protein, sử dụng phương pháp sắc ký ái lực để tinh chế một số chất có khả năng liên kết đặc biệt với enzyme. Ngày nay có nhiều qui trình sử dụng chế phẩm tế bào cố đònh để xử lý nước thải đạt hiệu quả. Các nghiên cứu về màng enzyme cố đònh ngày càng tăng, những kết quả đạt được cũng phụ thuộc nhiều vào tính chất của màng dùng để gắn enzyme. Trên cơ sở nghiên cứu tính chất của enzyme cố đònh sẽ góp phần giải quyết nhiều vấn đề lớn khác nhau như : – Giải thích toàn diện hơn chức năng xúc tác sinh học trong tế bào sống và điều hòa hoạt động enzyme trong tế bào. – Điều hòa tính thấm của màng và khuếch tán qua màng. – Đặc tính của phản ứng enzyme ở giới hạn phân cách giữa các phase của màng, trong môi trường kỵ nước, môi trường nước trong màng tế bào. Ngày nay, việc nghiên cứu enzyme cố đònh được tiến hành theo hướng ngày càng phức tạp dần, mô hình từ một enzyme riêng lẻ đến hệ thống nhiều enzyme, sẽ tiến đến tạo những cấu trúc trên phân tử có trật tự bao gồm nhiều phức hệ enzyme. Nghiên cứu quá trình xúc tác nhờ các hệ thống phức tạp sẽ giúp hiều biết đầy đủ cơ chế các quá trình trao đổi chất của tế bào. 2.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME CỐ ĐỊNH 2.4.1. Các nghiên cứu trong nước Việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme cố đònh ở Việt Nam chưa phổ biến lắm và vẫn còn được xem là hướng mới mẻ, kết quả thu được còn hạn chế. Tuy nhiên, gần đây đã có một số cuộc thử nghiệm về vấn đề cố đònh enzyme ở tế bào vi sinh, enzyme trích từ động vật, thực vật trong đó nổi bật là : 32  Nhóm nghiên cứu của GS TS Nguyễn Văn Uyển thử nghiệm sản xuất cồn bằng kỹ thuật cố đònh tế bào nấm men Saccharomyces Cerevisiae trên gel calcium alginate. Phương pháp này không đòi hỏi thiết bò phức tạp và có thể thực hiện nhanh chóng. Ưu điểm phương pháp sản xuất liên tục nên năng suất tạo cồn tăng, ít đầu tư vốn, nấm men hoạt động liên tục (100 ngày) thay vì phải cấy và nhân giống hàng ngày nếu theo qui trình cũ.  Nhóm nghiên cứu của Viện Sinh Học Nhiệt Đới kết hợp với bộ môn sinh hóa trường Đại học Khoa Học Tự nhiên năm 1994 nghiên cứu thử nghiệm tạo pepsin cố đònh và năm 1995 thử nghiệm tạo pancreatin cố đònh trên cytochrom. Kết quả thu được mở ra hướng nghiên cứu tiếp theo cho các enzyme khác.  Phòng nghiên cứu công nghệ bức xạ Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt có nhiều công trình nghiên cứu enzyme cố đònh trên tế bào vi sinh và các chất có hoạt tính sinh học bằng kỹ thuật bức xạ như cố đònh glucoamylase, protease, vi khuẩn tả (Vibrio Cholerae), tế bào nấm men (Saccharomyces Serevisae), vi khuẩn xử lý nước thải (Pseudomonas Maltophila) và progesteron trên các giá thể polymer tổng hợp.  Nghiên cứu của Nguyễn Anh Dũng tại Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt năm 1999 ứng dụng kỹ thuật bức xạ theo 2 hướng chính là : chế tạo vật kiệu tương hợp sinh học và cố đònh các chất có hoạt chất sinh học lên các vật liệu polymer ghép bằng bức xạ. Để chế tạo vật liệu tương hợp sinh học thường dùng phương pháp copolymer hóa các monomer với polymer và phương pháp khâu mạch bức xạ. Để cố đònh các chất có hoạt chất có hoạt tính sinh học bằng cách tạo liên kết với polymer hoặc nhốt trong polymer. Tác giả đã cố đònh được trypsin trong gel chitosan g.co HEMA tránh sự tác động trực tiếp của bức xạ có thể đáp ứng được yêu cầu ứng dụng trong công nghiệp. 33 2.4.2. Các nghiên cứu ngoài nước  Enzyme cố đònh đã được các nhà khoa học quan tâm và đưa ra nhiều hướng nghiên cứu từ rất lâu. Năm 1916 khi Nelson và Griffin quan sát khả năng thủy phân đường saccharose bằng invertase ở nấm men hấp thụ trên than hoạt tính.  Sau đó đến năm 1953, Grubhofer và Schleith cố đònh carboxipeptidase, pepsin, ribonuclease bằng liên kết cộng hóa trò trên nhựa polyaminostyren được diazo hóa.  Vào năm 1963 Bernfeld và Wan đã mô tả phương pháp nhốt. Các enzyme trypsin, papain, amylase và ribonuclease trong gel polyacrylamide.  Vào năm 1964, Richard lần đầu tiên dùng glutaraldehyde 1% để điều chế ra carboxypeptidase axit amin ở dạng tinh thể không tan, sau khixử lý enzyme vẫn không thay đổi hình dạng và giữ được 30% hoạt độ ban đầu. Cùng năm này Chang đã nhốt enzyme hydratase trong các vi hạt.  Năm 1970, Mosbach đã cố đònh 3 loại enzyme : galactosidase, hexokinase và gluco 6 phosphate dehydrogenase được gắn bằng liên kết đồng hóa trò lên hạt sephadex và hiệu quả của phản ứng được xúc tác bởi enzyme liên kết là cao hơn nhiều.  Cùng năm này Bernty đã dùng glucooxidase gắn bằng liên kết đồng hóa trò ở trong cột polystirol để xác đònh tự động glucose.  Năm 1971, người ta đã thành công trong việc dùng chymotrypsin liên kết đồng hóa trò với các carboximethyl cellulose để làm đông tụ sửa thay cho renin đắt tiền.  Năm 1974, Ichiro Chibata và 1976 Koro Yamoto lần đầu tiên thành công trong việc sản xuất enzyme cố đònh đem ứng dụng trong sản xuất công nghiệp, tạo ra sản xuất là L– malic và acid fumaric người ta dùng vật liệu cố đònh là polyacryllamide và carrageenan được hoạt hóa bởi glutaraldehyde và hexamethyl enediamine để cố đònh tế bào vi sinh. Dùng carrageenan để cố đònh nhiều loại tế 34 bào vi sinh thì có kết quả tốt hơn dùng gel polyarylamide trong sản xuất công nghiệp.  Năm 1978 Sten Ohlsan, Per Olof Larsson và Klaus Mosbach cố đònh tế bào vi sinh Artbrobacter simplex bằng gel calcium alginate.  Năm 1979 Yodogawaku (Japan) đã sử dụng tế bào B. Flavum cố đònh trên carrageenan để thực hiện phản ứng chuyển từ L– fumaric tạo ra sản phẩm L – malic với hiệu suất thu sản phẩm cao hơn.  Ngày nay, những enzyme đắt tiền đang được chú ý đặc biệt để nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong sản xuất công nghiệp với dạng enzyme cố đònh. Ngoài việc cố đònh tế bào vi sinh, người ta còn cố đònh lục lạp, ty thể, trên các vật liệu cố đònh khác nhau. Từ đó mở ra một hướng mới trong việc sử dụng tế bào vi sinh vật và cao hơn nữa là cơ quan của thực vật, động vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và có giá trò kinh tế hơn. 2.5. GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE amylase có khả năng phân cắt các liên kết 1,4 glucoside nằm phía trong phân tử cơ chất một cách ngẫu nhiên không theo một trật tự nào cả. Quá trình thủy phân tinh bột bởi amylase là một quá trình đa giai đoạn. Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa) chỉ một số phân tử cơ chất bò thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp ( dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh. Sang giai đoạn hai (giai đoạn đường hóa) các dextrin phân tử thấp vừa được tạo thành bò thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra trimaltose không bắt màu với iodine. Các chất này bò thủy phân rất chậm bởi amylase cho tới di và monosaccharide. Dưới tác dụng của amylase, tinh bột bò phân giải khá nhanh thành oliigosaccharide gồm 6 7 gốc glucose. Sau đó các polyglucose này lại bò phân cắt tiếp nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bò phân giải chậm đến maltotetrose và matotriose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân bởi amylase chứa 13% glucose và 87% maltose, tác dụng của 35 amylase không phân cắt được liên kết 1,6 glucoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chòu tác dụng lâu dài thì trong sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose, 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và izomaltose (8%).tóm lại dưới tác dụng của amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. 2.5.1 Đặc tính Trung tâm hoạt động của amylase có chứa nhóm [ COOH] và [NH 2 ]. amylase dễ tan trong nước, trong các dung dòch muối và rượu loãng. Protein của amylase có tính acid yếu và tính chất của globulin. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4.2–5.7. Phân tử lượng của amylase từ các nguồn gốc khác nhau rất khác nhau (của nấm mốc 45.000 50.000, của malt 59.000) (Knin 1956; Fisher, Stein 1970). amylase là một metaloenzyme (enzyme cơ kim). Các amylase đều chứa từ 1 30 nguyên tử gam Ca/mol. Song không ít hơn 1 6 nguyên tử gam Ca/mol. Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi protein của enzyme thì amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất. Và Ca tham gia vào sự hình thành và ổn đònh cấu trúc bậc ba của enzyme, duy trì cấu hình hoạt động của enzyme (Molodova, 1956) . Ca còn có tác dụng đảm bảo cho amylase có độ bền cực lớn đối với các tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzyme phân giải protein. amylase bền nhiệt hơn so với các loại amylase khác. Người ta cho rằng đặc tính này của amylase có liên quan đến hàm lượng của Ca trong phân tử của nó ( amylase của các vi khuẩn ưa nhiệt có chứa Ca nhiều hơn amylase của nấm mốc 3 4 lần nên nó bền nhiệt hơn). Tất cả những amylase đều bò kìm hãm bởi những kim loại nặng như : Cu 2+ , Li + , Mg 2+ , Cr 3+, Mn 2+ , Zn 2+ , Co 2+ , Sn 2+ ,… 36 amylase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần amino acid khác nhau. Mỗi loại amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng song chúng đều khá giàu tyrosine và tryptophan. Các glutamic acid và aspatic chiếm ¼ tổng lượng amino acid cấu thành phân tử enzyme. Trong amylase rất ít methionine và chỉ có khoảng 7 10 gốc cysteine, trừ amylase của Bac. Subtilis không có các liên kết sulfhydryl và disulfhydryl. Điều kiện hoạt động của amylase từ các nguồn khác nhau cũng khác nhau. pH tối thích cho hoạt động của amylase từ nấm sợi là 4,5 4,8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH 4,5 4,8) của đại mạch nẩy mầm là 5,3 và của vi khuẩn là 5,8 6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH 5,8 7,0). Độ bền đối với tác dụng acid cũng khác nhau. amylase của nấm sợi bền vững với acid tốt hơn là của malt và vi khuẩn. Ở pH 3,6 và 0 0 C amylase của malt bò vô hoạt hoàn toàn sau 15–30 phút, amylase của vi khuẩn bò vô hoạt 50% trong khi đó hoạt lực của amylase của nấm sợi hầu như không giảm bao nhiêu (Fenilxova, Rmoshinoi, 1989). Ở pH <4,0 amylase của vi khuẩn bò vô hoạt hoàn toàn (Virits, 1971) amylase của nấm sợi rất nhạy với nhiệt (nhiệt độ tối thích 50 0 C) Amylase của thóc mầm và của malt bền nhiệt hơn và hoạt động tối thích ở 58 60 0 C, amylase của vi khuẩn có độ bền cao hơn cả. 2.5.2. Giới thiệu về enzyme Termanyl Termanyl là chế phẩm enzyme dạng nước chứa amylase chòu được nhiệt độ cao và được sản xuất bởi chủng men Bacillus Licheniformis (enzyme này là một amylase thủy phân liên kết) 1.4 glucosidic thành amylose và amylosepectin. a. Một số ứng dụng của termamyl trong công nghiệp (thông tin do hãng Novo cung cấp) : 37 Trong kỹ nghệ tinh bột : Termamyl được dùng cho việc dòch hóa liên tục tinh bột trong nồi hơi hoặc trong những thiết bò tương tự hoạt động ở nhiệt độ từ 105 110 0 C và vì vậy lợi dụng được tính ổn đònh nhiệt độ cao của enzyme. Trong kỹ nghệ nấu cồn : Termamyl được dùng để phân tán tinh bột khi nghiên cứu và chưng cất. Và ở giai đoạn này, cũng lợi dụng được độ ổn đònh nhiệt của enzyme Trong kỹ nghệ nấu bia : Termamyl được dùng để giúp cho việc dòch hóa được dễ dàng. Do độ ổn đònh nhiệt độ cao của enzyme. Trong kỹ nghệ đường : Termamyl được sử dụng để phá vỡ lượng tinh bột hiện diện trong mía. Trong kỹ nghệ dệt : Termamyl được sử dụng ở tốc độ cao, nhiệt độ cao để rủ hồ trước khi nhuộm. Loại enzyme kỹ thuật được áp dụng cho công nghệ này. b. Hoạt tính của enzyme thương phẩm Các thông số về hoạt tính Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme trong điều kiện thử nghiệm : – Chất nền : 0,5% tinh bột. – Chất ổn đònh : 30 – 60 ppm Ca. 300 225 150 75 4 6 8 10 90 0 C 60 0 C 37 0 C Hoạt tính (Knu/g) 38 Hình 2.13: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme Termanyl tại các nhiệt độ 39 – Chất nền : 0,5% tinh bột. – Chất ổn đònh : 30 – 60 ppm Ca. – pH : 5.7 Hình 2.14: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enyme Termamyl Độ ổn đònh của Termamyl Ảnh hưởng của calci Trong bột nhão, tính ổn đònh của Termamyl được thỏa mãn với sự hiện diện từ 50 70 ppm ion Ca 2+ . Ngoài ra hoạt tính của enzyme cũng có thể biểu thò bằng tốc độ gia tăng ban đầu của DE (đương lượng Dextrose) với nồng độ enzyme đã cho sẳn. Tốc độ gia tăng trung bình đương lượng DE trên một thời gian cho sẳn sẽ tùy thuộc vào độ ổn đònh tốc độ ban đầu đối với hàm lượng Termamyl 0.1% trên trọng lượng như sau : Nhiệt độ 90 0 C 95 0 C 100 0 C 105 0 C Độ gia tăng ban đầu đương lượng DE/giờ 5.1 5.5 5.9 6.2 Độ gia tăng trung bình đương lượng DE 5.1 5.3 5.3 4.3 sau 1 giờ đầu tiên (điều kiện tiêu chuẩn) 100 75 50 25 40 50 60 70 80 90 % hoạt tính tương đối 0 C 40 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. VẬT LIỆU  Enzyme – amylase Trong quá trình tiến hành thí nghiệm, sử dụng enzyme amylase thương phẩm: Termamyl do hãng Novo sản xuất.  Gel calcium alginate Alginate sử dụng trong quá trình thí nghiệm là muối sodium alginate do hãng Kanto của Nhật sản xuất. Sản phẩm ở dạng bột mòn hòa tan hoàn toàn trong nước. 3.2. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.2.1. Phương pháp cố đònh enzyme a. Chuẩn bò dụng vụ & hóa chất cố đònh enzyme Dụng cụ – Bercher 500 ml , 1000 ml . – Pipet. – Que khuấy. – Xilanh tạo giọt. Hóa chất – Sodium alginate dạng bột mòn do Nhật sản xuất. – CaCl 2 0.2M – Enzyme Termamyl thương phẩm dạng lỏng. b. Qui trình cố đònh enzyme –Tạo dung dòch sodium alginate 3%. –Trộn đều enzyme và dung dòch sodium alginate theo tỉ lệ 1:1 tạo ra hổ hợp enzyme–sodium alginate . Hình 2.1 3: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme Termanyl tại các nhiệt độ 39 – Chất nền : 0,5% tinh bột. – Chất ổn đònh : 30 – 60 ppm Ca. – pH : 5.7 Hình 2.1 4: Ảnh. xuất. – CaCl 2 0.2M – Enzyme Termamyl thương phẩm dạng lỏng. b. Qui trình cố đònh enzyme –Tạo dung dòch sodium alginate 3%. –Trộn đều enzyme và dung dòch sodium alginate theo tỉ lệ 1:1 tạo. Phương pháp cố đònh enzyme a. Chuẩn bò dụng vụ & hóa chất cố đònh enzyme Dụng cụ – Bercher 500 ml , 1000 ml . – Pipet. – Que khuấy. – Xilanh tạo giọt. Hóa chất – Sodium alginate dạng