21 ¾ β-glucozitase có tên khác β-D-glucozit-glucohydrolase, hay cellobiase Theo nhiều tác giả khác nhau thì cơ chế tác động của hệ enzyme cellulase có nhiều kiểu tác động khác nhau. Theo Mandels và Reese (1964) thì: Hình 2.2: Sơ đồ tác động enzyme cellulase lên cellulose theo Mandels và Reese Trong đó C 1 là nhân tố tiền phân hủy nhưng đặc hiệu, chỉ có tác dụng làm trương tạo thành các chuỗi cellulose mạch ngắn, các chuỗi này lại bị tấn công bởi C x . Các vi sinh vật sinh trưởng trên cellulose phức tạp có trật tự sắp xếp cao thì tổng hợp cả hai C 1 và C x . Trong tự nhiên người ta cũng tìm thấy có hiện tượng phối chéo tức là C 1 sinh ra từ loài nấm mốc này nhưng C x lại sinh ra từ một loài nấm mốc khác. β-glucozitase ở cuối chuỗi có tác dụng lớn trong việc phân giải hoàn toàn cellobiose thành glucose. 2.3.3 Giới thiệu về pectin Khối lượng phân tử pectin trong khoảng 3.000 – 280.000, ty nguồn gốc thực vật. Dung dịch pectin có độ nhớt cao. Độ hòa tan của pectin trong nước phụ thuộc vào mức độ ester hóa nhóm cacbonyl. Mức ester hóa càng cao độ hòa tan càng cao. Dưới tác dụng của axit, protopectinase hay đun sôi protopectin chuyển thành pectin hòa tan. Pectin hòa tan dưới tác dụng của kiềm loãng hay enzym pectase sẽ giống nhóm metoxi tạo rượu metylic và axit pectic tự do. Pectin là dẫn xuất polysaccharide phân tử của chúng bao gồm các đơn vị mắt xích là axit -D-galacturonic. Các đơn vị này nối với nhau nhờ liên kết 1-4 glucozit. Cellulose hoạt động Cellulose Cellobiose Glucose C 1 C x -glucozitase β 22 Mỗi đơn vị mắt xích chứa một nhóm cacboxyl ở vị trí C 6 , các nhóm axit này tồn tại ở dạng tự do hay dưới dạng liên kết ester (như metyl ester). Trong pectin tự nhiên có khoảng ¾ số nhóm axit bị metyl hóa. Các nhóm hydroxyl ở C 2 và C 3 của mỗi đơn vị mắc xích có thể bị ester hóa một phần bởi axit acetic hoặc axit phosphoric. Một phần nhóm axit không ester hóa tham gia tạo liên kết ngang với ion canxi và magie. O COOH OH O O COOH OH OH O O COOH OH OH O O OH Hình 2.3: Cấu trúc của axit polygalacturonic. 2.3.4 Giới thiệu enzyme pectinase i. Nhóm hydrolase Gồm có enzym pectinesterase và enzym polygalacturonase  Pectinesterase (PE) Theo H. lineviver, pectinesterase có ái lực với nhóm metoxy ở vị trí 5 lớn hơn với các nhóm metoxy ở vị trí 3 và 7. Hình 2.4: Sơ đồ phân cắt của enzym pectinesterase. COOCH 3 COOCH 3 COOCH 3 COOH COOCH 3 COOCH 3 COOH 1 2 3 4567 COOCH 3 8 COOCH 3 9 II I II Như vậy, sự phân cắt nhóm metoxy sẽ xảy ra một cách tuần tự bắt đầu từ nhóm −COOH tự do. Kết quả tạo thành axit pectinic hoặc axit pectic và rượu metanol. 23  Polygalacturonase (PG) PG còn có tên gọi là poly-α-1,4-galacturonit glucanohydrolase. PG là enzym xúc tác sự phân cắt các liên kết glucozit 1-4 ở trong các mạch của pectin . PG là một phức hệ enzym gồm nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao khi tác dụng với cơ chất. Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác động trên cơ chất, H.Deuel và E.Stutz (1958) đã chia ra như sau: 9 Polymetilgalacturonase (PMG):Enzym tác dụng trên axit polygalacturonic đã được metoxyl hóa (tức là pectin). Enzym này thường có tên gọi hệ thống là poly-α-1-4-galacturonic metil esteglucanohydrolase và có mã số 3.2.1.11. PMG lại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào khả năng phân cắt liên kết ở trong hay ở cuối mạch của pectin là: Endoglucosidase-polymetilgalacturonase kiểu I (endo-PMG-I) và Exo- glucosidase-polimetilgalacturonase kiểu III (exo-PMG-III). 9 Poligalacturonase: Enzym này tác dụng trên axit pectic hoặc axit pectinic, chia thành hai nhóm nhỏ: Endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II (endo-PG-II) và Exoglucosidase-polymetilgalacturonase kiểu IV (ex-PG- IV)  Nhóm Transeliminase (TE) Nhóm enzym này mới được tìm ra cách đâu không lâu. Nhóm enzym này phân cắt phi thủy phân chất pectin với sự tạo ra nối kép ở trong gốc galacturonic giữa nguyên tử carbon thứ 4 và thứ 5. Khi đứt liên kết α-1-4 bởi transeliminase thì hydro từ nguyên tử carbon thứ 5 của gốc axit galacturonic này được chuyển đến nguyên tử carbon thứ nhất của gốc axit galacturonic khác. Phản ứng xảy ra dễ dàng trong môi trường trung tính hoặc kiềm yếu. Hình 2.5: Sơ đồ phân cắt của enzym transeliminase. O OH OH H H H H O O COOH OH OH H H O H O H C OH OH O H H H H OH O H 3 C O H C OH OH H H H O O H 3 C O C O H 3 C 24 Transeliminase tác dụng được trên pectin cũng như trên axit pectic. Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng có thể phân thành những nhóm enzym sau: 9 Pectin − traseliminase có tên gọi hệ thống là poli α-1-4 galacturonit- metilesterglucano-liase và mã số là 4.2.99.8. Những enzym tác dụng trên pectin và axit pectinic. Các enzym này lại phân thành: Endo- pectintranseliminase kiểu I ( Endo-PTE-I) và Exo-pectintransemilinase kiểu III ( Exo–PTE–III). 9 Poligalacturonat–transeliminase có tên gọi hệ thống là poli α-1-4 D- galacturonit glucanoniase và mã số là 1.2.99.3. Đây là những enzym tác dụng trên axit pectinic và axit pectic. Enzym này lại chia làm 2 loại: Endo polygalacturonat-transeliminase kiểu II (Endo-PGTE-II) và Exopolygalacturonat-transeliminase kiểu IV (Exo-PGTE-IV). 25 PHẦN 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Thời gian thực hiện : từ ngày 15/3/2005 đến 15/7/2005 Địa điểm thực hiện : đề tài được nghiên cứu và thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh hoá thuộc Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 NGUYÊN LIỆU 3.2.1 Trái cacao Trái ca cao tươi được lấy từ huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre. Trước khi lấy hạt để lên men trái ca cao được lưu trữ ở nơi thoáng mát trong 7 - 9 ngày. Mục đích của quá trình này là giúp cho lớp cơm nhầy bao quanh hạt giảm đi giúp làm giảm độ ẩm của khối lên men sau này. Sau khi lưu trữ hạt được tách khỏi trái tươi. Sau khi tách hạt cần phải ủ ngay và không được lưu quá 20 ngày (Phạm Hồng Đức Phước, 2004). 3.2.2 Giống vi sinh vật Chủng được sử dụng là Aspergillus niger được lấy từ hai nguồn: ¾ Nguồn thứ nhất: từ phòng thí nghiệm công nghệ sinh học bộ môn Công nghệ sinh học đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh ¾ Nguồn thứ 2: từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Khoa học tự nhiên Chủng Aspergillus niger Thuộc nhóm: Aspergillus niger Giống: Aspergillus Họ: Aspergillaceae 26 Giống đưa vào nghiên cứu được bảo quản trong môi trường PGA giữ ở nhiệt độ 4 o C. 3.2.3 Nguyên liệu làm môi trường Malt: là thành phần chính của môi trường malt để nuôi cấy nấm mốc. Malt rất giàu đường và các khoáng chất cho sự phát triển của nấm mốc. Malt được sử dụng trong thí nghiệm này là loại malt đã được xay nát dùng để sản xuất bia lấy từ khoa Công nghệ thực phẩm trường Cao đẳng công nghiệp thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh Cám: trong cám gạo có chứa nhiều chất dinh dưỡng giúp cho nấm mốc phát triển tốt như: protein, lipid, tro, cellulose; các loại khoáng Na, Ca, K, Zn, Fe và các loại vitamin. Cám được sử dụng trong thí nghiệm là cám gạo được mua tại chợ Bình Tây thành phố Hồ Chí Minh. Trấu: được đưa vào môi trường với mục đích tạo độ thoáng, xốp, tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển tốt. Đồng thời theo một số nghiên cứu cho thấy trấu là nhân tố kích thích hệ enzyme cellulase rất tốt ở các loài nấm mốc. Trong thí nghiệm này trấu được mua từ chợ Kim Biên thành phố Hồ Chí Minh là loại trấu khô, không bị mục nát, không lẫn nhiều các tạp chất khác Cà rốt: là thành phần kích thích sự tổng hợp của enzyme pectinase. Cà rốt sử dụng trong thí nghiệm này được lấy từ nông trường Sông Hậu. Agar: sử dụng agar của công ty đồ hộp Hạ Long Muối sunfat amon (NH 4 ) 2 SO 4 là nguồn đạm bổ sung cho sự phát triển bình thường của nấm mốc. 3.3 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 3.3.1 Môi trường thạch malt Chúng tôi sử dụng môi trường malt để cấy truyền và phục hồi giống. Cách tiến hành làm môi trường Malt như sau 27 Lấy 200 g malt đã được xay nát cho vào becher 1000 ml. Thêm nước cất cho đủ 1000 ml. Đặt becher trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 55 o C trong 1 giờ, sau đó tăng lên 65 o C trong 1 giờ sau. Trong quá trình thủy phân dịch malt được khuấy trộn để tăng khả năng thủy phân tinh bột. Quá trình thủy phân tinh bột tạo một lớp nước có màu nâu đục phía trên. Khi kết thúc quá trình thủy phân ta gạn thu phần dịch malt có màu nâu đục ở phía trên. Lọc qua bông gòn thấm nước để loại bỏ một số tạp chất còn sót lại. Dịch malt sau khi lọc được bổ sung agar với hàm lượng 18 ‰ thể tích dịch malt Đun sôi dịch malt và agar trên bếp ở nhiệt độ không quá cao và tiến hành khuấy liên tục tránh hiện tượng caramel hóa Chuẩn bị ống nghiệm sạch, cho vào mỗi ống khoảng 3 ml dịch malt Làm nút bằng bông gòn y tế không thấm nước và bao đầu ống nghiệm bằng giấy báo. Đem thanh trùng ở 121 o C, 1 atm, trong 15 phút Đặt nghiêng ống nghiệm tạo môi trường thạch nghiêng. Giữ môi trường malt ở nhiệt độ 4 o C 3.3.2 Môi trường nhân giống Chúng tôi sử dụng môi trường nhân giống có thành phần môi trường được lấy theo kết quả nghiên cứu của thạc sĩ Lê Hồng Phú trong luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme pectinase và cellulase từ Aspergillus niger và ứng dụng để xử lý vỏ cà phê trong sản xuất phân hữu cơ”. Môi trường này đã được xác định là thích hợp cho sự sinh tổng hợp enzyme cellulase và pectinase của Aspergillus niger. Cụ thể nuôi cấy trên môi trường nhân giống có thành phần: cà rốt 9 %, trấu 15 %, cám 75 % và (NH 4 ) 2 SO 4 1 %, độ ẩm 64 %, thời gian 40 giờ. 28 Cách thực hiện môi trường nhân giống: Cấy Asp. niger trên môi trường thạch malt Thêm 10ml nước cất vào mỗi ống 48 giờ; 34,5 o C Dùng que cấy mài nhẹ trên mặt thạch tách bào tử Cân 75% cám, 9% cà rốt, 15% trấu, 1% (NH 4 )SO 4 Thêm nước (V ml), trộn đều và cho vào erlen Thanh trùng ở 121 o C, 1atm, 20 phút Lưu trữ ở nhiệt độ 34,5 o C tron g 40 g iờ Trộn đều Thể tích nước cất thêm vào (V ml) khi trộn các thành phần của môi trường nhân giống theo công thức: V ml = 64%.m – (w 1 .m 1 + w 2 .m 2 + w 3 .m 3 + 10) Trong đó: V ml: lượng nước thêm vào để trộn các thành phần môi trường nhân giống 64%: độ ẩm của môi trường nhân giống m: khối lượng môi trường nhân giống w 1 , w 2 , w 3 : độ ẩm của các thành phần cám gạo, trấu và cà rốt m 1 , m 2 , m 3 : khối lượng của các thành phần cám gạo, trấu và cà rốt 10: thể tích nước cất thêm vào để tách bào tử Asp. niger từ môi trường thạch malt 3.3.3 Chế phẩm sinh học Mục đích của việc tạo chế phẩm là tạo môi trường dinh dưỡng cho nấm mốc phát triển, dễ sử dụng, và dễ bảo quản 29 Aspergillus niger sau khi được nhân giống trên môi trường bán rắn được trộn với bột mì rang vàng. Thêm nước cất để chỉnh độ ẩm của môi trường chế phẩm về độ ẩm mong muốn. Chế phẩm sau đó được đưa vào bịch nylon có sử dụng bông gòn làm nút. Mục đích của việc sử dụng bông gòn làm nút để giúp cho môi trường chế phẩm ở trạng thái hiếu khi nhưng vẫn không làm phát tán bào tử Asp. niger ra ngoài môi trường. Chế phẩm sau đó được cất giữ trong tủ ấm ở nhiệt độ 34,5 o C trong 3 ngày. 3.4 DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 3.4.1 Dụng cụ và thiết bị Máy khúc xạ kế Cân phân tích Máy đo mật độ quang OD Tủ sấy Tủ ấm Tủ lạnh Bình hút ẩm Máy đo pH Bình tam giác Máy xay Bercher Erlen Pipette Bình định mức Ống đong Phễu lọc Que cấy Các loại chai lọ đựng hóa chất Đũa thủy tinh Bể điều nhiệt Máy vortex 30 Máy lắc mẫu Máy ép thủy lực Máy khuấy từ Tủ hấp Bình Kjeldahl 3.4.2 Hóa chất cho phân tích Nước cất NaOH HCl CMC (sodium carboxymethyl – cellulose) H 2 SO 4 Cồn (C 2 H 5 OH) 96 o Thuốc thử anthrone Antron Glucose C 6 H 12 O 6 Saccharose Phenol Thuốc thử orcinol Dextrin Acid acetic DNS (dinitrosalicylic acid) Pectin ZnSO 4 Pectinase Iod Ag(NO 3 ) Ete ethylic H 2 O 2 KNaC 4 H 4 O 6 .4H 2 O . C x . Các vi sinh vật sinh trưởng trên cellulose phức tạp có trật tự sắp xếp cao thì tổng hợp cả hai C 1 và C x . Trong tự nhiên người ta cũng tìm thấy có hiện tượng phối chéo tức là C 1 sinh. từ hai nguồn: ¾ Nguồn thứ nhất: từ phòng thí nghiệm công nghệ sinh học bộ môn Công nghệ sinh học đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh ¾ Nguồn thứ 2: từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại. ty đồ hộp Hạ Long Muối sunfat amon (NH 4 ) 2 SO 4 là nguồn đạm bổ sung cho sự phát triển bình thường của nấm mốc. 3.3 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 3.3.1 Môi trường thạch malt Chúng