1 Chƣơng 1 GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Trong những năm gần đây, cây điều (Anacardium occidental L.) đã và đang trở thành một cây công nghiệp mạnh, có giá trị kinh tế – xã hội cao của nước ta. Hằng năm, doanh thu từ cây điều đem về cho nước ta hàng trăm triệu USD, trở thành nước xuất khẩu nhân điều đứng thứ 2 thế giới, vượt qua Ấn Độ, chỉ đứng sau Brazil [4]. Bên cạnh đó, việc canh tác cây điều còn giúp nước ta giải quyết được những vấn đề xã hội khác như: phủ xanh đất trống đồi trọc, giải quyết việc làm, đem lại thu nhập ổn định cho người nông dân ở những vùng đất khô cằn, bạc màu,…Nước ta nằm trong vùng có khí hậu thuận lợi và có diện tích lớn đất phù hợp cho sự phát triển của cây điều, vì vậy chúng ta có tiềm năng lớn để phát triển mạnh cây điều. Tuy nhiên tình hình canh tác cây điều của nước ta nói chung và của tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu nói riêng không đạt tương xứng như tiềm năng, do đó năng suất bình quân còn thấp, không đồng đều và không ổn định cả về chất lượng và sản lượng, bắt nguồn từ việc phát triển cây điều một cách tự phát, không được đầu tư nghiên cứu nghiêm túc, đặc biệt là những nghiên cứu về các giống điều và kỹ thuật canh tác. Để có thể đề ra một chiến lược toàn diện phát triển cây điều, điều qua trọng là cần phải đầu tư cho công tác lai tạo, bảo tồn và phổ biến những giống điều có chất lượng vượt trội so với những giống hiện có. Muốn vậy trước hết phải đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của quần thể cây điều hiện có. Xuất phát từ yêu cầu đó, được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học–Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, dưới sự hướng dẫn của thầy TS. Bùi Minh Trí, chúng tôi thực hiện đề tài: “Bƣớc đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium occidental L.) tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP”. 2 1.2. Mục tiêu và yêu cầu 1.2.1. Mục tiêu  Thông qua kỹ thuật RAPD đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.  Xây dựng quy trình tiến hành kỹ thuật AFLP trên cây điều, làm cơ sở cho việc áp dụng kỹ thuật AFLP vào những nghiên cứu sâu rộng hơn về tính đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử trên cây điều cũng như trên những đối tượng nghiên cứu khác sau này. 1.2.2. Yêu cầu  Thu thập được mẫu lá của những cây điều có những đặc điểm nổi bật và điển hình dựa trên kiểu hình như: khả năng chịu hạn tốt hay không tốt, năng suất và chất lượng hạt cao hay thấp, có tính đề kháng với sâu bệnh cao hay thấp, ra hoa sớm hay muộn,…  Ly trích DNA có chất lượng tốt từ các mẫu lá thu được (được bảo quản lạnh) làm nguyên liệu cho kỹ thuật RAPD và AFLP.  Thực hiện thành công kỹ thuật RAPD từ đó đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, đồng thời nhận diện một số đoạn DNA có thể được sử dụng như những chỉ thị phân tử liên quan đến những tính trạng đáng quan tâm.  Thực hiện kỹ thuật AFLP trên một số mẫu DNA có chất lượng tốt, từ đó lựa chọn ra một vài tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thích hợp cho việc áp dụng kỹ thuật AFLP trên cây điều. 1.3. Hạn chế của đề tài  Những nghiên cứu phân loại giống điều tại Việt Nam chưa được thiết lập, đồng thời khó có khả năng nhận diện giống trong thực tế tại vườn nông hộ nên chỉ thực hiện lấy mẫu những cây điều có đặc điểm nổi bật và điển hình, không dựa trên đặc điểm phân loại giống.  Không có đủ điều kiện để thu thập lượng mẫu lớn. 3  Không có đủ điều kiện để thực hiện phản ứng PCR – RAPD với nhiều primer và tìm ra quy trình PCR – RAPD tối ưu.  Không có điều kiện để tiến hành kỹ thuật AFLP trên nhiều mẫu và với nhiều tổ hợp primer do chi phí thực hiện quá cao. 4 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về cây điều 2.1.1. Nguồn gốc cây điều Cây điều có tên khoa học là Anacardium occidentale L. Cây điều có nguồn gốc ở Brazil. Người Bồ Đào Nha là những người đầu tiên mang cây điều từ Brazil sang trồng ở châu Á và châu Phi trong công cuộc mở rộng thuộc địa của họ. Điều kiện tự nhiên ở châu Á phù hợp cho sự phát triển của cây điều. Ngày nay cây điều trải rộng trong ranh giới vĩ tuyến 25 o Bắc và 25 o Nam. Trước kia, cây điều được trồng chủ yếu để che phủ đất, chống xói mòn,…Mãi đến tận đầu thế kỷ 20 nhân điều mới thực sự trở thành nông sản có giá trị trên toàn thế giới [2][3]. 2.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây điều Cây điều là loài cây thân mộc vùng nhiệt đới, sống lâu năm (đến khoảng 30 – 40 năm hay cao hơn), chịu hạn tốt, có thể sinh trưởng và phát triển ở những vùng đất khô cằn, bạc màu mà những cây lương thực khác khó có thể sống nổi. 2.1.2.1. Thân và cành cây Thân thường cao khoảng 6 – 8 m, những nơi đất tốt có thể đến 10 – 12 m, đường kính vòng thân có thể đạt 40 – 50 cm. Chiều cao thân cây có liên hệ mật thiết với mật độ trồng. Nếu trồng với mật độ dày, thân cây tăng trưởng chiều cao mạnh nhưng cành nhánh nhỏ và ngắn, lá thưa thớt, không thể cho nhiều hoa và trái. Thông thường khoảng cách trồng phổ biến khoảng 8 – 10 m. Tán cây điều rộng, trung bình khoảng 10 m, có khi đạt 20 m [2]. 2.1.2.2. Hệ rễ Cây điều có rễ cọc và rễ ngang. Ở những vùng đất khô, mạch nước ngầm thấp, rễ cọc đâm xuống sâu để hút nước, do đó cây điều có khả năng chịu hạn cao và vững 5 chắc. Rễ cọc cây điều trên 5 tuổi có thể sâu khoảng 5 m. Hệ thống rễ ngang mọc cách mặt đất khoảng 12 cm. 2.1.2.3. Lá Lá cây điều thuộc loại lá đơn, nguyên. Lá thường có dạng thuôn hay hình trứng, đuôi lá thường hơi tròn. Lá non có màu xanh hay đỏ tía tùy giống, khi già có màu xanh thẫm. Theo Rao và Hassan (1957), thời gian trung bình từ khi ra lá non đến lá trưởng thành khoảng 20 ngày [3]. 2.1.2.4. Hoa và quả điều Hoa điều nhỏ, đài hợp, có năm cánh rời. Khi mới nở cánh hoa có màu trắng hay vàng có sọc đỏ, sau đó chuyển thành màu hồng sẫm. Hoa điều có hai loại: hoa đực và hoa lưỡng tính. Hoa đực gồm toàn nhị đực, hoa lưỡng tính có khoảng 8 – 12 nhị đực và có một nhụy cái ở chính giữa. Nhụy cái gồm một bầu noãn nằm dưới một vòi dài (dài và mập hơn nhị đực). Theo Copeland (1961), trong bầu noãn chứa một noãn duy nhất, nếu được thụ tinh sẽ phát triển thành hạt điều [2]. Hoa điều mọc thành từng chùm có từ vài chục đến 1 – 2 trăm hoa, gồm cả hoa đực và hoa lưỡng tính, trong đó hoa đực chiếm tỉ lệ cao, còn hoa lưỡng tính dao động từ 0 – 30 % tổng số hoa trong chùm. Số hoa lưỡng tính đậu quả tới chín cho thu hoạch khoảng 10 %. Những chùm hoa của đầu và cuối vụ thường nhiều hoa đực, những chùm hoa chính vụ có tỉ lệ hoa lưỡng tính cao. Tỉ lệ hoa lưỡng tính còn tùy thuộc vào từng cây khác nhau trong vườn. Bình quân tỉ lệ hoa lưỡng tính trong chùm khoảng 12 – 15 % [3]. Mùa hoa điều nở là mùa khô. Hoa điều thường nở từ tháng 11 kéo dài đến tận tháng 3 năm sau, tuy nhiên hoa nở rộ ở tháng 1 – tháng 2. Sự nở hoa có liên hệ mật thiết với nhiệt độ môi trường. Có sự chênh lệch về thời điểm nở hoa, ngay cả với những hoa cùng chùm. Hoa điều nở từ sáng sớm tới trưa, sau đó bắt đầu héo. Sau khi thụ phấn xong, quá trình thụ tinh bắt đầu: hạt phấn nảy nầm trên đầu núm nhụy cái đưa các tinh tử xuyên qua vòi nhụy vào bầu noãn để thụ tinh cho tế bào trứng. Thụ tinh xong bắt đầu quá trình hình thành và phát triển của hạt điều. Quả điều thật là phần mà ta hay gọi là hạt, phần gọi là quả thực ra do phần cuống phình to ra, gọi là quả giả. Hạt điều bao giờ cũng phát triển trước và nhanh hơn quả giả ở gần cuống. Khi hạt điều 6 tăng trưởng đến kích thước tối đa, có sự hình thành đầy đủ các bộ phận, bước vào giai đoạn chín lúc bấy giờ quả giả mới tăng trưởng mạnh [2]. Hạt điều có hình dạng giống quả thận, khi non có màu xanh, khi chín khô chuyển qua màu nâu xám hoặc xám hồng. Hạt điều ở nước ta thường dài 2,6 – 3,1 cm, dày 1,2 – 1,7 cm, nặng khoảng 3 – 7 g. Cấu tạo hạt điều gồm 3 phần rõ rệt:  Phần vỏ cứng: chiếm khoảng 60 % – 70 % trọng lượng hạt điều, trong đó phần dầu vỏ hạt chiếm 20 % – 22 % trọng lượng hạt.  Phần giữa: là lớp vỏ lụa, lúc còn non đóng vai trò cung cấp chất dinh dưỡng nuôi hạt, khi chín teo lại, chiếm khoảng 5 % trọng lượng hạt.  Phần trong cùng: là nhân hạt điều, chính là phôi hạt có đầy đủ chồi mầm, thân mầm và rễ mầm. Bộ phận có kích thước lớn của phôi là hai lá mầm có chứa nhiều chất dinh dưỡng để nuôi cây mầm khi mới mọc [3].  Sau khi thụ tinh xong không phải bất cứ hoa điều lưỡng tính nào cũng đều phát triển thành quả giả và hạt cho đến khi chín. Có nhiều khi hạt và quả giả chưa kịp chín đã rụng, gọi là hiện tượng rụng trái non. Tỉ lệ rụng trái non phụ thuộc vào từng cây, từng vụ, do nhiều nguyên nhân khác nhau như: di truyền, thời tiết bất thường, sâu bệnh, đất quá khô hoặc úng lầy, thiếu hụt chất dinh dưỡng nghiêm trọng. Sau khi trồng khoảng 2 – 3 năm, cây điều bắt đầu ra hoa kết trái. Năng suất giữa các cây trong cùng một vườn, giữa các năm, giữa các vườn điều với nhau thường khác nhau, phụ thuộc chủ yếu vào giống, kỹ thuật trồng và thời tiết. Năng suất hạt điều trung bình của nước ta khoảng 1,1 tấn/ha [4]. 2.1.3. Đặc điểm sinh thái của cây điều 2.1.3.1. Khí hậu Các yếu tố thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của cây điều :  Chế đô mưa: Theo Ohler (1979), lượng mưa thích hợp giới hạn từ 1.000 – 2.000 mm/năm, có một mùa mưa tập trung, không đến sớm, sau đó là một mùa khô kéo dài 4 – 6 tháng [2]. 7  Chế độ nhiệt: Thích hợp từ 20 o C – 37 o C, cực thuận ở 27 o C [9]. Một điều ảnh hưởng rõ rệt đến năng suất hạt điều là do sương muối. Khi có nhiều sương muối trùng với thời kỳ kết hạt non của cây, nhiều hạt non sẽ bị thối đen, năng suất giảm. Cây điều nước ta thường bị ảnh hưởng nhiều bởi sương muối.  Chế độ ánh sáng: Cây điều là cây ưa sáng hoàn toàn, thích hợp ở những vùng mà độ dài ngày và đêm bằng nhau và bầu trời quang đãng. Số giờ nắng khoảng 2000 h/năm [3].  Độ ẩm tương đối: Độ ẩm không khí thích hợp từ 65 % – 80 %. 2.1.3.2. Đất đai Cây điều có thể mọc trên nhiều loại đất khác nhau (đất đỏ, đất cát, đất xám phù sa cổ, đất sỏi đá,…), tuy nhiên muốn đạt năng suất cao đòi hỏi phải có tầng đất mặt sâu, thành phần cơ giới nhẹ, thoát nước tốt, pH đất từ 4,5 – 6,5. Vườn trồng phải được nhổ cỏ thường xuyên để cây phát triển tốt. 2.1.3.3. Mật độ trồng Thông thường mật độ trồng thích hợp là 10 m x 10 m, ở mật độ này cây điều phát triển tốt chiều cao và tán [3]. 2.1.4. Giống điều và các phƣơng pháp nhân giống Giống như các loại cây trồng từ hạt khác, cây điều có khả năng xảy ra thụ phấn chéo cao và phát tán rộng, vì vậy quần thể cây điều có tính đa dạng di truyền cao. Trong thực tế, ở Việt Nam có những giống điều chủ yếu như: PN1, MH4/5, MH5/4, BO1 (là giống điều ghép cao sản). Bên cạnh đó còn những giống điều khác chưa phân loại được [3]. Theo như kinh nghiệm của các nông dân, có 2 giống điều chủ yếu là: điều Ấn Độ có tán rộng, đọt non màu đỏ và cho năng suất rất cao song hay bị sâu hại trong khi điều Việt Nam có tán hẹp và đọt non màu xanh, năng suất không cao bằng điều Ấn Độ song khả năng chống chịu sâu hại cao. 2.1.4.1 . Đặc điểm thực vật học của các giống điều  Về hình dạng cây: Có cây thân cao và cây thân lùn. Giữa 2 dạng chính này còn có nhiều dạng trung gian phong phú. 8  Về màu sắc lá: Có giống có lá non màu nõn chuối và lá già màu xanh nhạt, có giống có lá non từ màu hồng đến đỏ tía và lá già màu xanh đậm.  Về hoa: Có giống hoa nở muộn, nở sớm chênh nhau 10 – 15 ngày, số lượng hoa trong mỗi chùm cũng khác nhau (có giống mỗi chùm chỉ có vài chục hoa, có giống lại có vài trăm hoa trên một chùm), tỉ lệ hoa đực/hoa lưỡng tính bình quân trong một chùm cũng thay đổi tùy giống (có giống có tỉ lệ hoa lưỡng tính thấp chỉ khoảng 5 % hay cũng có giống cao đến khoảng 30 %). Tỉ lệ hoa lưỡng tính sau khi nở và đậu thành trái cũng khác nhau, có khi nhiều khoảng 6 – 10 trái, ít chỉ 1 – 3 trái.  Về quả giả: Khác biệt ở màu sắc, hình dạng, kích cỡ, mùi vị quả giữa các giống. Có giống quả màu đỏ, màu hồng, màu vàng, đỏ sọc xanh. Có giống quả tròn, quả dài, quả to hay nhỏ. Có giống quả ngọt khi chín, có giống quả nhạt, khi ăn khé cổ do có nhiều tananh trong nước quả.  Về hạt và năng suất hạt: Khác biệt về hạt ở các đặc điểm như hình dạng, kích thước, trọng lượng, tỉ lệ nhân. Có giống hạt tròn mẩy, có giống hạt lép. Có giống hạt to và nặng, khi chín trọng lượng khô đạt đến 8 g/hạt (khoảng 127 – 132 hạt/kg), có giống hạt nhỏ, chỉ đạt 3,5 g/hạt (gần 300 hạt/kg). Có giống tỉ lệ nhân đạt 20 % trọng lượng hạt, cũng có giống đạt 30 % trọng lượng hạt. 2.1.4.2. Phƣơng pháp nhân giống cây điều Các phương pháp nhân giống điều chủ yếu là chiết, ghép, gieo hạt, tuy nhiên trong thực tế nông dân thường dùng phương pháp chọn cây điều mẹ tốt để lấy hạt làm giống. Ngoài ra, hiện nay nông dân thường mua cây giống cao sản từ những công ty giống. 2.1.5. Sản xuất điều trên thế giới Từ một cây mọc hoang dại ở vùng Đông Bắc Brazil, ngày nay cây điều được trồng ở nhiều nơi trên thế giới, chủ yếu ở những nước có nền nông nghiệp khá phát triển hay những nước đang phát triển. Hiện nay có khoảng 50 nước trồng điều trên toàn thế giới. Những nước sản xuất điều chủ yếu: Ấn Độ, Brazil, Việt Nam, Guinea- Bissau, Ivory Coast, Benin, Nigeria, Mozambique, Tanzania,… 9 Bảng2.1. Sản xuất nhân hạt điều của thế giới niên vụ 1997 và 2000 – 2001. ĐVT: tấn Nƣớc/khu vực 1997 2000 – 2001 Ấn Độ Brazil Việt Nam Tanzania Nigieria Mozambique Indonesia Guinea-Bissau Benin Các nuớc châu Phi nói tiếng Pháp Các nước khác 350.000 180.000 110.000 80.000 40.000 30.000 30.000 - - - 80.000 425.000 200.000 140.000 150.000 30.000 20.000 30.000 45.000 20.000 70.000 70.000 Cộng 900.000 1.200.000 Nguồn:[4]. Ngoài nhân điều là sản phẩm chính có giá trị kinh tế cao còn có dầu hạt điều (CNSL – Cashew nut shell liquid) – một sản phẩm tạo ra trong quá trình chế biến hạt điều lấy nhân xuất khẩu, chiếm khoảng 18 – 23 % trọng lượng hạt điều, có thành phần chính là acid anacardic và cardol. CNSL là một sản phẩm nguyên liệu đa năng, dùng cho công nghiệp hóa chất, chế tạo bố thắng, lớp phủ cho các bộ ly hợp, chế tạo các loại sơn,vecni, các loại nhựa,…Những nước sản xuất CNSL chủ yếu là Brazil, Ấn Độ, Mozambique, Tanzania,… Ngoài ra trái điều còn dùng làm nguyên liệu trong công nghiệp chế biến nước giải khát khá phát triển ở một số nước (Brazil, Ấn Độ,…). Gỗ điều dùng trong các ngành đồ gỗ mỹ nghệ và nội thất gia đình. Bên cạnh đó, cây điều còn có một số tác dụng chữa bệnh được một số nước sử dụng như: giảm đau, lợi tiểu, điều trị hen suyễn (Brazil), thuốc sát trùng (Peru),…[3]. 10 2.1.6. Sản xuất điều ở Việt Nam Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có khí hậu thuận lợi cho cây điều phát triển. Cây điều có thể đã được đưa vào nước ta từ thế kỷ 18 hay sớm hơn (Johnson, 1973) [2], nhưng mãi đến đầu những năm 1975, cây điều mới được trồng phổ biến để phủ xanh đất trống đồi trọc do bom đạn chiến tranh. Cho đến cuối thập kỷ 80 của thế kỷ 20 chúng ta mới bắt đầu xuất khẩu nhân điều [3]. Kể từ mốc thời gian đó đến nay, phát triển cây điều không phải lúc nào cũng thuận lợi, có những lúc người nông dân trồng điều đã phải chặt bỏ hết cả vườn điều để trồng tiêu, cà phê,… do giá điều quá thấp và mất mùa liên tục. Tuy nhiên hiện nay ngành trồng điều đã và đang phát triển mạnh, đạt được những thành tựu đáng ghi nhận. Năm 2004, cả nước có hơn 400.000 ha diện tích trồng điều, là năm cho sản lượng cao nhất của ngành điều từ trước đến nay, đã xuất khẩu được 107.000 tấn nhân điều, tăng 25 % so với năm 2003, giá trị kim ngạch xuất khẩu đạt 425 triệu USD, tăng 40 % so với năm 2003, trong đó thị trường Mỹ chiếm 41 %, Trung Quốc 20 %, Úc 10 %, còn lại là các thị trường khác. Năm 2004, Việt Nam chính thức trở thành nước xuất khẩu hạt điều đứng hàng thứ 2 thế giới, vượt qua Ấn Độ, chỉ đứng sau Brazil. Năm 2005, chỉ tiêu của ngành điều là sản xuất chế biến khoảng 450.000 tấn điều thô, xuất khẩu 110.000 tấn nhân điều, giá trị kim ngạch xuất khẩu đạt từ 430 – 450 triệu USD, phấn đấu hoàn thành kế hoạch trồng mới 50.000 ha điều cao sản và đến năm 2010, toàn bộ diện tích điều trên cả nước sẽ được thay bằng giống cao sản [4]. . tài: “Bƣớc đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium occidental L. ) tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP . 2 1. 2. Mục tiêu và yêu cầu 1. 2 .1. . 1. 2 .1. Mục tiêu  Thông qua kỹ thuật RAPD đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền và nhận di n chỉ thị phân tử của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.  Xây dựng quy trình tiến hành kỹ thuật.  Ly trích DNA có chất l ợng tốt từ các mẫu l thu được (được bảo quản l nh) l m nguyên liệu cho kỹ thuật RAPD và AFLP.  Thực hiện thành công kỹ thuật RAPD từ đó đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng