41 Bảng 3.4. Thí nghiệm 1. Các mẫu thực hiện Thành phần (25 μl/ống) Chu trình nhiệt TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 Taq buffer 10 X 1,5 mM MgCl 2 0,5 U Taq polymerase 100 μM dNTPs 20 ng primer (0,65 μl) (*) 20 ng DNA khuôn Thêm nước đến 25 μl. 94 o C – 4 phút. Lặp lại 45 chu kỳ: 94 o C – 1 phút; 33 o C – 1 phút(**); 72 o C – 2 phút. 72 o C – 10 phút. Giữ 4 o C. (*): Dung dịch primer sử dụng có nồng độ 10 pmol/μl. (**): Nhiệt độ bắt cặp được ước lượng bằng công thức Ta = Tm – 2 o C.  Thí nghiệm 2: Thực hiện giảm số chu kỳ nhiệt độ xuống còn 35 chu kỳ và giữ nguyên nồng độ các thành phần hoá chất như thí nghiệm 1 (bảng 3.5). Thực hiện với 4 primer: 1, 2, 9 và 11. Bảng 3.5. Thí nghiệm 2. Các mẫu thực hiện Thành phần (25 μl/ống) Chu trình nhiệt TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 Taq buffer 10 X 1,5 mM MgCl 2 0,5 U Taq polymerase 100 μM dNTPs 20 ng primer (0,65 μl) (*) 20 ng DNA khuôn Thêm nước đến 25 μl. 94 o C – 4 phút. Lặp lại 35 chu kỳ: 94 o C – 1 phút; 33 o C – 1 phút(**); 72 o C – 2 phút. 72 o C – 10 phút. Giữ 4 o C. 42  Thí nghiệm 3: Thực hiện tăng số chu kỳ nhiệt độ lên 37 chu kỳ, đồng thời giữ nguyên nồng độ các thành phần phản ứng như thí nghiệm 2 (bảng 3.6). Thực hiện với 4 primer: 1, 2, 9 và 11. Bảng 3.6. Thí nghiệm 3. Các mẫu thực hiện Thành phần (25 μl/ống) Chu trình nhiệt TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 Taq buffer 10 X 1,5 mM MgCl 2 0,5 U Taq polymerase 100 μM dNTPs 20 ng primer (0,65 μl) (*) 20 ng DNA khuôn Thêm nước đến 25 μl. 94 o C – 4 phút. Lặp lại 37 chu kỳ: 94 o C – 1 phút; 33 o C – 1 phút (**); 72 o C – 2 phút. 72 o C – 10 phút. Giữ 4 o C.  Thí nghiệm 4: Chúng tôi thực hiện 6 nghiệm thức thay đổi nồng độ các thành phần tham gia phản ứng (được trình bày trong bảng 3.7), đồng thời giữ nguyên chu trình phản ứng như thí nghiệm 3. Sử dụng primer 11, thực hiện với DNA của các mẫu TT1, TT4 và TT8. Chu trình phản ứng thí nghiệm 4: 94 o C – 4 phút. Lặp lại 37 chu kỳ: 94 o C – 1 phút; 33 o C – 1 phút; 72 o C – 2 phút. 72 o C – 10 phút. 4 o C – tùy ý. 43 Bảng 3.7. Thí nghiệm 4. TP MgCl 2 25 mM Taq poly- merase 5 U dNTPs 10 mM Primer Nƣớc và DNA template Thể tích hút (μl) Nồng độ cuối (mM) Thể tích hút (μl) Nồng độ cuối (U) Thể tích hút (μl) Nồng độ cuối (μM) Thể tích hút (μl) Lượng sử dụng (ng) NT1(ĐC) 1,5 1,5 0,1 0,5 0,25 100 0,65 20 2,5 μl Taq buffer 10x. Thêm nước sau cùng để đạt 25μl/ống. NT2 2 2 0,1 0,5 0,25 100 0,65 20 NT3 2 2 0,12 0,6 0,25 100 0,65 20 NT4 2 2 0,1 0,5 0,25 100 0,75 22 NT5 2 2 0,1 0,5 0,3 120 0,65 20 NT6 2 2 0,12 0,6 0,3 120 0,75 22 3.2.2.3. Kỹ thuật AFLP Thực hiện kỹ thuật AFLP với 8 mẫu DNA có chất lượng tốt (nồng độ DNA cao trên 100 ng/μl và tương đối sạch) là các mẫu: TT1, TT4, TT9, TT31, VT38, CĐ40, CĐ45, XM78.  Cắt giới hạn và gắn adapter: Kiểm tra phản ứng cắt DNA của enzyme: Sau khi có được DNA, bước đầu tiên là kiểm tra xem những enzyme cắt EcoRІ và MseІ có phù hợp với bộ gene đó hay không. Phản ứng cắt thử:  300 ng DNA bộ gene. NT 44  4 U enzyme EcoRI.  3 U enzyme MseI.  6 μl buffer 5 X. Để ở nhiệt độ phòng qua đêm hay ở 37 o C trong 2h, sau đó để 15 phút ở 70 o C. Điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5 %. Thực hiện phản ứng cắt giới hạn và gắn adapter: - Thực hiện biến tính adapter để bảo đảm các adapter hoàn toàn tách ra khỏi nhau:  Ủ ống chứa adapter ở 95 o C trong 5 phút.  Để nguội đến nhiệt độ phòng.  Ly tâm 1.400 vòng/phút. - Chuẩn bị hỗn hợp enzyme (cho 20 mẫu): Cho vào ống 200 μl:  2 μl buffer 5 X T4 DNA ligase có ATP.  2 μl 0,5 M NaCl.  1 μl BSA1mg/ml (làm loãng từ dung dịch gốc 10 mg/ml).  20 Unit MseI.  100 Unit EcoRI.  20 Weiss Unit T4 DNA ligase.  Cho thêm nước cất siêu sạch để được 40 μl. Trộn kỹ, ly tâm trong 10 giây. Luôn giữ trong đá. - Chuẩn bị phản ứng cắt và gắn: Cho vào ống 200 μl/phản ứng:  1 μl buffer T4 DNA ligase 10 X có ATP ( hay 2 μl đệm T4 DNA ligase 5 X có ATP).  1 μl NaCl 0,5 M.  0,5 μl BSA1mg/ml. 45  1 μl MseI adapter.  1 μl EcoRI adapter.  1 μl hỗn hợp enzyme đã chuẩn bị ở trên.  Cho thêm 0,5 μl mẫu (mẫu đối chứng cho 5,5 μl DNA từ KIT). Trộn kỹ, ly tâm 10 giây. Để ở nhiệt độ phòng qua đêm hay 37 o C trong 2 giờ.  Nhân bản tiền chọn lọc: Thành phần hỗn hợp phản ứng: - Pha loãng sản phẩm của phản ứng cắt và gắn adapter: Cho thêm 189 μl TE vào mỗi ống phản ứng cắt và gắn, bảo quản ở 4 o C hay –20 o C. - Trộn các thành phần sau trong ống 200 μl:  4 μl DNA đã cắt và pha loãng.  1 μl primer tiền nhân bản.  15 μl AFLP mix (P/N 402005). Chu trình nhiệt phản ứng nhân bản tiền chọn lọc: bảng 3.8. Bảng 3.8. Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân bản tiền chọn lọc. Nhiệt độ và thời gian Chu trình Nhiệt độ và thời gian Nhiệt độ và thời gian Thực hiện 20 chu kỳ. 72 o C 2 phút. 94 o C 20 giây. 56 o C 30 giây. 72 o C 2 phút. 60 o C 30 giây. 4 o C giữ tùy ý. Kiểm tra sản phẩm nhân bản tiền chọn lọc bằng gel agarose 1,5%. 46  Nhân bản chọn lọc: Để thực hiện bước này chúng tôi tiến hành chọn những tổ hợp primer EcoRI – MseI. Sau khi thực hiện phản ứng nhân bản chọn lọc xong, sản phẩm được điện di trên máy giải trình tự. Thành phần hỗn hợp phản ứng: - Chuẩn bị khuôn DNA:  10 μl sản phẩm tiền nhân bản.  190 μl đệm TE. Trộn kỹ, ly tâm 10 giây tốc độ thấp và giữ ở 4 o C. - Chúng tôi tiến hành thử nghiệm với 12 tổ hợp primer nhân bản chọn lọc:  MseI + CAA – EcoRI + ACT (phát màu xanh dương).  MseI + CAA – EcoRI + AAC (phát màu vàng).  MseI + CAA – EcoRI + AGG (phát màu xanh lá cây).  MseI + CAA – EcoRI + ACA (phát màu xanh dương).  MseI + CAA – EcoRI + AGC (phát màu vàng).  MseI + CAA – EcoRI + ACG (phát màu xanh lá cây).  MseI + CAG – EcoRI + ACT (phát màu xanh dương).  MseI + CAG – EcoRI + AAC (phát màu vàng).  MseI + CAG – EcoRI + AGG (phát màu xanh lá cây).  MseI + CAG – EcoRI + ACA (phát màu xanh dương).  MseI + CAG – EcoRI + AGC (phát màu vàng).  MseI + CAG – EcoRI + AAG (phát màu xanh lá cây). - Trộn hỗn hợp phản ứng:  3,0 μl sản phẩm nhân bản tiền chọn lọc đã pha loãng.  1,0 μl primer MseI + Cxx (5 μM). 47  1,0 μl primer EcoRI + Axx đánh dấu huỳnh quang (1 μM).  15,0 μl hổn hợp AFLP (P/N 402005). (Luôn để hỗn hợp trong đá) Chu trình nhiệt phản ứng nhân bản chọn lọc: bảng 3.9. Bảng 3.9. Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân bản chọn lọc. Nhiệt độ, thời gian Chu trình Số chu kỳ 94 o C, 2 phút. 60 o C, 30 phút. 4 o C, giữ tùy ý. 94 o C, 20 giây. 94 o C, 20 giây. 94 o C, 20 giây. 94 o C, 20 giây. 94 o C, 20 giây. 94 o C, 20 giây. 94 o C, 20 giây. 94 o C, 20 giây. 94 o C, 20 giây. 94 o C, 20 giây. 94 o C, 20 giây. 66 o C, 30 giây. 65 o C, 30 giây. 64 o C, 30 giây. 63 o C, 30 giây. 62 o C, 30 giây. 61 o C, 30 giây. 60 o C, 30 giây. 59 o C, 30 giây. 58 o C, 30 giây. 57 o C, 30 giây. 56 o C, 30 giây. 72 o C, 2 phút. 72 o C, 2 phút. 72 o C, 2 phút. 72 o C, 2 phút. 72 o C, 2 phút. 72 o C, 2 phút. 72 o C, 2 phút. 72 o C, 2 phút. 72 o C, 2 phút. 72 o C, 2 phút. 72 o C, 2 phút. 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 20 1 1  Điện di: Kết quả phản ứng nhân bản chọn lọc được điện di trên máy giải trình tự AB sequencer 3100. 48 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sau thời gian thực hiện các thí nghiệm chúng tôi thu được một số kết quả: 4.1. Phần điều tra và thu thập mẫu lá cây điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Sau giai đoạn thu thập mẫu chúng tôi có được 80 mẫu lá của những cây điều có những đặc điểm nổi bật và điển hình tại các địa phương thuộc tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu: Thành phố Vũng Tàu; Thị xã Bà Rịa; các huyện: Châu Đức, Long Điền, Long Đất, Tân Thành, Xuyên Mộc. Đặc điểm các mẫu được thống kê trong bảng 4.1 Bảng 4.1. Kết quả thu thập mẫu lá cây điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Đặc điểm cây chọn lấy mẫu Tỉ lệ % Năng suất Cao 79 % (63/80 mẫu) Thấp 21 % (17/80 mẫu) Hoa Ra nhiều hoa 90 % (72/80 mẫu) Ra ít hoa 10 % (8/80 mẫu) Ra hoa sớm 71 % (56/80 mẫu) Ra hoa muộn 29 % (24/80 mẫu) Ra hoa một đợt 55 % (44/80 mẫu) Ra hoa nhiều đợt 45 % (36/80mẫu) Hoa nở đồng loạt 59 % (47/80 mẫu) Hoa nở phân tán 41 % (33/80 mẫu) 49 Chùm Nhiều chùm 65 % (52/80 mẫu) Ít chùm 22 % (18/80 mẫu) Chùm có nhiều hạt 81 % (65/80 mẫu) Chùm có ít hạt 19 % (15/80 mẫu) Hạt To 73 % (58/80 mẫu) Nhỏ 27 % (22/80 mẫu) Thân và cành cây Sum suê 86 % (69/80 mẫu) Thưa thớt 14 % (11/80 mẫu) Hiện tƣợng rụng trái non Nhiều 22 % (18/80 mẫu) Ít 68 % (55/80 mẫu) Quả giả To 37 % (30/80 mẫu) Nhỏ 63 % (50/80 mẫu) Quả màu vàng 33 % (26/80 mẫu) Quả màu đỏ 67 % (54/80 mẫu) Quả ngon 23 % (18/80 mẫu) Quả dở 4 % (5/80 mẫu) Khả năng chống chịu sâu hại Cao 100 % (80/80 mẫu) Thấp 0 % (0/80 mẫu) Khả năng chống chịu bệnh Cao 76 % (62/80 mẫu) Thấp 24 % (18/80 mẫu) 50 Như vậy, thông qua điều tra và thu thập mẫu chúng tôi nhận thấy sự phân bố kiểu hình của cây điều ở tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu rất đa dạng. 4.2. Phần nghiên cứu và phân tích trong phòng thí nghiệm 4.2.1. Kết quả tách chiết DNA 4.2.1.1. Kết quả chung Chúng tôi thực hiện tách chiết DNA 80 mẫu lá điều thu thập được, kết quả có 55 mẫu đạt yêu cầu, đạt tỉ lệ khoảng 70 %. Chúng tôi chỉ sử dụng những mẫu DNA sau khi tách chiết điện di thấy có band và đo OD thấy giá trị OD từ 1,5 trở lên. Nồng độ DNA trung bình khoảng 70 – 80 ng/μl. Chất lượng DNA được chia làm 2 nhóm:  Tỉ số OD từ 1,5 – 1,8: Có chất lượng trung bình, có 16/55 mẫu, chiếm 29 %.  Tỉ số OD từ 1,8 – 2,2: Có chất lượng tốt, có 39/55 mẫu, chiếm 71 %. Kết quả được minh họa trên hình 4.1. Hình 4.1 Kết quả tách chiết DNA lá điều tươi trưởng thành. 4.2.1.2. Một số vấn đề tách chiết DNA ở lá điều  Đặc điểm: Sau khi tách chiết, DNA lá điều thường bị gãy nhiều (hình 4.1), có lẽ do tế bào lá điều có lớp thành tế bào dày và cứng, khó nghiền nên khi nghiền mạnh tay dễ làm gãy DNA. Lượng DNA thu được trong nghiên cứu này không cao, TT1 TT7 TT13 TT27TT33 CĐ45CĐ50 CĐ79 . Primer Nƣớc và DNA template Thể tích hút ( l) Nồng độ cuối (mM) Thể tích hút ( l) Nồng độ cuối (U) Thể tích hút ( l) Nồng độ cuối (μM) Thể tích hút ( l) L ợng sử. 94 o C – 4 phút. L p l i 45 chu k : 94 o C – 1 phút; 33 o C – 1 phút(* *); 72 o C – 2 phút. 72 o C – 10 phút. Giữ 4 o C. (* ): Dung dịch primer sử dụng có nồng độ 10 pmol/ l. (** ): Nhiệt độ. dNTPs 20 ng primer (0, 65 l) ( *) 20 ng DNA khuôn Thêm nước đến 25 l. 94 o C – 4 phút. L p l i 35 chu k : 94 o C – 1 phút; 33 o C – 1 phút(* *); 72 o C – 2 phút. 72 o C – 10 phút. Giữ 4 o C.