51 trung bình khoảng 70 – 80 ng/μl, có thể do lá điều có nhiều chất thứ cấp khác như polyphenol, polypeptide,…gây khó khăn cho quá trình tách chiết. Một số mẫu có nồng độ DNA rất thấp (khoảng 30 ng/μl trở xuống) đều là của những mẫu lá non hay những lá đã trưởng thành nhưng còn mềm.  Khó khăn: Khó tách DNA từ lá điều còn non. Trong 80 mẫu thực hiện có 25 mẫu lá non cho kết quả tách chiết DNA không tốt (giá trị OD cao hơn 1,8 nhưng nồng độ DNA rất thấp, khi điện di không thấy kết quả). Lặp lại việc tách 25 mẫu lá non trên khoảng 2 – 3 lần nhưng vẫn không cho kết quả. Điều này có thể do lá non đang trong thời kỳ sinh trưởng mạnh nên nồng độ các hợp chất thứ cấp nhiều, ảnh hưởng không tốt đến việc tách chiết DNA, ngoài ra trong lá non hàm lượng nước cao làm cho số lượng DNA trong lá non ít hơn lá trưởng thành (hình 4.2). Hình 4.2 Kết quả tách chiết DNA lá điều tươi còn non  Biện pháp khắc phục: Đối với lá điều trưởng thành: Chúng tôi cũng đưa ra một số lưu ý khi thực hiện quá trình tách chiết: - Bước 1: Bước này cần phải giữ cho lá không bị khô trước khi nghiền, công đoạn nghiền phải đều tay, không nghiền mạnh. Sử dụng máy vortex khuấy trộn kỹ ở tốc độ thấp, khoảng 600 – 1.000 vòng/phút. TT16 TT20TT23 TT26TT28 TT30 52 - Bước 2: Thêm 500 μl chloroform : isoamylalcohol (24:1), sau đó có thể dùng máy vortex khuấy trộn ở tốc độ thấp như bước 1 hay chỉ cần đảo nhẹ trong khoảng 10 phút để hạn chế gãy DNA. - Bước 3: Chỉ nên hút khoảng 500 μl dịch ở bên trên, tránh chạm đầu tip vào phần ngăn cách giữa 2 pha vì đây là phần chứa nhiều protein bị loại bỏ. - Bước 4: Chỉ nên hút khoảng 250 – 300 μl dịch trích. - Bước 5: Thêm vào 250 μl dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –20 o C trong khoảng 1 giờ (nên để qua đêm). Nên lấy tỉ lệ DNA : dung dịch isopropanol lạnh = 1 : 1. - Bước7: Cho vào 300 μl TE 1 X, ủ 37 o C trong 1 giờ. Có thể chỉ để khoảng 30 phút vì mục đích của bước này chỉ để cho DNA tan ra. - Bước 11: Lặp lại bước 10, để khô cặn, hòa tan cặn trong 100 μl TE 1 X, ủ ở 37 o C trong 30 phút, phải để thật khô, không còn ethanol trong kết tủa DNA do ethanol ảnh hưởng xấu tới DNA và phản ứng PCR. Đối với lá điều non: Có thể tăng nồng độ các hóa chất có tác dụng làm kết tủa protein, peptide, polyphenol,…như CTAB, mercaptroethanol, chloroform,… và tăng lượng mẫu lá. 4.2.2. Kết quả thực hiện kỹ thuật RAPD, bƣớc đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền và nhận diện một số band có thể là chỉ thị phân tử 4.2.2.1. Kết quả thí nghiệm 1: Thực hiện theo quy trình của các tác giả nƣớc ngoài Bước đầu chúng tôi đã thực hiện theo quy trình của Samal và ctv (2002) đưa ra nhưng không thấy kết quả với cả 4 primer đã dùng. Kết quả PCR – RAPD với primer 11 được trình bày trên hình 4.3. 53 Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD primer 11 của thí nghiệm 1. Chúng tôi nhận định có thể do việc sử dụng hóa chất khác nguồn gốc nên việc áp dụng theo quy trình của các tác giả trên là không phù hợp. Mặt khác chúng tôi nhận thấy việc thực hiện tới 45 chu kỳ là quá nhiều, vì vậy chúng tôi đưa ra thí nghiệm 2 có 35 chu kỳ phản ứng và nồng độ các thành phần của phản ứng được giữ nguyên. 4.2.2.2 . Kết quả thí nghiệm 2: Giảm số chu kỳ xuống còn 35 chu kỳ và giử nguyên thành phần hoá chất nhƣ thí nghiệm 1 Sau khi thực hiện PCR – RAPD thu được kết quả với primer 1 và primer 11, trong khi primer 2 và 9 không có kết quả (hình 4.4). (A) (B) Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD của thí nghiệm 2 với primer 11 (A) và primer 2 (B). Chúng tôi nhận thấy phản ứng PCR với primer 1 và primer 11đã có sản phẩm nhưng mờ, không thể hiện được bản chất của kỹ thuật RAPD là cho nhiều band với TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 54 khả năng nhân bản lớn do sử dụng primer ngẫu nhiên, vì vậy chúng tôi thực hiện thí nghiệm 3: tăng số chu kỳ phản ứng lên 36 và 37 chu kỳ và giữ nguyên nồng độ các hoá chất. Đối với primer 2 và 9 không thấy kết quả, chúng tôi tiếp tục thực hiện với thí nghiệm 3. 4.2.2.3. Kết quả thí nghiệm 3: Tăng số chu kỳ lên 37 chu kỳ và giữ nguyên thành phần hoá chất nhƣ thí nghiệm 1 Thực hiện phản ứng PCR qua 37 chu kỳ, với primer 1 và 11, số band xuất hiện nhiều hơn song còn mờ trong khi với primer 2 và 9 vẫn không có kết quả (hình 4.5). (C) (D) Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD của thí nghiệm 3 với primer 11 (C) và primer 2 (D) Với primer 2 và 9 chúng tôi nhận thấy không có khả năng nhân bản DNA lá điều đã thu thập được, vì vậy chúng tôi không sử dụng 2 primer này ở các bước nghiên cứu tiếp theo. Với primer 1 và 11 chúng tôi nhận thấy primer 11 cho số band nhiều hơn và các band sáng hơn, do đó chúng tôi chọn primer 11 để tiến hành tiếp. Chúng tôi đã thử số chu kỳ nhiều hơn với primer 11song kết quả cũng không tốt hơn. Vì vậy chúng tôi tiến hành thí nghiệm 4 bằng cách thay đổi nồng độ các hóa chất phản ứng và giữ nguyên 37chu kỳ. Chúng tôi nhận định vấn đề chủ yếu nằm ở việc tối ưu hóa nồng độ của MgCl 2 , nồng độ của Taq polymerase, dNTPs, primer, vì vậy chúng tôi đưa ra 5 nghiệm thức (NT) thay đổi nồng độ của MgCl 2 kết hợp với việc thay đổi nồng độ của TT1TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 55 Taq polymerase, dNTPs, primer và 1 nghiệm thức giữ nguyên nồng độ các chất như ở thí nghiệm 3 để làm đối chứng (ĐC). 4.2.2.4 . Kết quả thí nghiệm 4: Thay đổi thành phần hóa chất, thực hiện phản ứng PCR qua 37 chu kỳ Tiến hành trên 3 mẫu TT1, TT4 và TT8, chúng tôi thu được kết quả, được trình bày trong hình 4.6. (E) (F) Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD của thí nghiệm 4 với primer 11 (E) và (F). Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 TT1 TT4 TT8 TT1 TT4 TT8 TT1 TT4 TT8 Nghiệm thức 4 Nghiệm thức 5 Nghiệm thức 6 TT1 TT4 TT8 TT1 TT4 TT8 TT1 TT4 TT8 56 Chúng tôi nhận thấy sau khi tăng nồng độ của MgCl 2 , phản ứng PCR có hiệu quả hơn nhiều, các nghiệm thức NT2, NT3, NT4, NT5, NT6 xuất hiện nhiều band hơn hẳn so NT1 và độ sáng của các band cũng tăng lên rõ rệt. Chúng tôi thấy NT5 và NT6 cho kết quả tốt hơn cả, trong khi NT6 tăng cả MgCl 2 , Taq polymerase, dNTPs và primer thì NT5 chỉ tăng MgCl 2 và dNTPs, đồng thời sau một vài lần thực hiện lặp lại NT5 chúng tôi thấy NT5 cho kết quả khá ổn định, do đó chúng tôi thống nhất chọn NT5 để thực hiện phản ứng PCR – RAPD cho tất cả các mẫu ly trích được DNA. Quy trình thực hiện phản ứng PCR – RAPD được trình bày trong bảng 4.2. Bảng 4.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR – RAPD. Thành phần hóa chất (25 μl/ống) Chu trình nhiệt Taq buffer 10 X 2 mM MgCl 2 0,5 U Taq polymerase 120 μM dNTPs 20 ng primer11 20 ng DNA khuôn. Thêm nước để đạt 25 μl. 94 o C – 4 phút. Lặp lại 37 chu kỳ: 94 o C – 1 phút; 33 o C – 1 phút; 72 o C – 2 phút. 72 o C – 10 phút. 4 o C – giữ. 4.2.2.5. Kết quả thực hiện kỹ thuật PCR – RAPD trên các mẫu DNA thu đƣợc Khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD với 50 mẫu DNA, kết quả có 41/50 mẫu có kết quả, đạt tỉ lệ 82 %. Những mẫu không có kết quả, khi so sánh với kết quả tách chiết DNA chúng tôi nhận thấy những mẫu này có nồng độ DNA rất thấp (dưới 30 ng/μl), vì vậy chúng tôi nghi ngờ rằng trong khi hút DNA để thực hiện PCR – RAPD, do nồng độ quá thấp nên đã không hút đủ lượng DNA cần thiết. Các kết quả điện di được trình bày trong hình 4.7, 4.8 và 4.9. 57 Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT1 – TT13. Hình 4.7 là kết quả điện di các mẫu từ TT1 – TT13 cho thấy có 3 band đồng hình và 6 band đa hình. Band đồng hình là những band có ở tất cả các mẫu, band đa hình là những band có ở mẫu này mà không có ở mẫu kia. Trên hình 4.7 ta thấy mẫu TT1 không có band 750 base pairs, 2300 base pairs, TT5 không có band 1600 base pairs, TT6 không có band 1600 base pairs. Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT14 – TT25 Từ hình 4.8 chúng tôi nhận thấy có mẫu TT24 và TT25 cho kết quả không tốt, vì vậy chúng tôi không sử dụng làm kết quả đánh giá đa dạng di truyền. TT14 TT15 TT17TT19 TT21 TT22 TT24 TT25 La Kết quả PCR – RAPD không tốt TT01 TT04 TT05 TT06 TT07 La TT08 TT09 TT10 TT11 TT12 TT13 Band khó xác định Band đa hình Band đồng hình 58 Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT27 – XM79. Chúng tôi chia hình 4.9 ra thành 2 hình cho dễ phân tích: hình 4.9A và 4.9B. Hình 4.9A Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT27–CD53. Khi sử dụng kỹ thuật RAPD với 11 primer để đánh giá tính đa dạng di truyền của các giống điều (Samal và ctv, 2002) thì với primer 11 đã thu được 11 band trong đó có 9 band đa hình và 2 band đồng hình, điều này chứng tỏ primer 11 cho kết quả có tính đa hình cao và khá ổn định [7] [15]. TT TT TT TT TT VT CD CD La CD CD CD CD BR BR BR CD 27 29 31 33 36 38 39 40 41 43 44 45 46 49 50 53 Band đa hình 59 Hình 4.9B Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR– RAPD các mẫu từ XM61– M79. Vì một số band khó nhận biết bằng mắt thường nên chúng tôi sử dụng công cụ Detectband của phần mềm Quantity One 4.2.1 trong máy Geldoc để phát hiện band. Hình 4.10 Màn hình phát hiện band các kết quả PCR – RAPD. Chúng tôi đã phát hiện được 3/11 band đồng hình, chiếm tỉ lệ khoảng 27,3 % tổng số các band được phát hiện, có độ dài khoảng 550 base pairs, 900 base pairs và 1050 base pairs. La CĐ CĐ CĐ CĐ BR BR BR TT La XM XM XM XM XMXMXMXM a 41 43 44 45 46 49 50 53 61 64 70 72 76 77 78 79 60 Đối với tất cả các mẫu đã thực hiện thành công phản ứng PCR – RAPD có 8/11 band đa hình được phát hiện, chiếm tỉ lệ 72,7 % tổng số các band được phát hiện. Đặc điểm của các band đa hình được trình bày trong bảng 4.3. Bảng 4.3. Các band đa hình và mối liên quan với các đặc điểm của cây lấy mẫu. Các band Số lƣợng mẫu có Những đặc điểm chung của những cây có tạo band đa hình 600 base pairs 17/41 mẫu, tỉ lệ 41 %. Có đến 16/17 mẫu là của những cây cho rất nhiều hoa, ra hoa sớm và năng suất rất cao, vì vậy chúng tôi giả thuyết có thể band 600base pairs là chỉ thị phân tử của những tính trạng ra hoa sớm, rất nhiều hoa và năng suất rất cao. 700 base pairs 2/41 mẫu, tỉ lệ 5 %. Mẫu CĐ39 và CĐ41 giống nhau và khá đặc biệt so với những mẫu khác, trong đó có tính trạng trái đỏ, rất ngon nhưng ít hạt. Chúng tôi giả định có thể band 700base pairs này là chỉ thị của tính trạng trái đỏ và rất ngon. 750 base pairs 35/41 mẫu, tỉ lệ 85 %. Chưa xác định. 1200 base pairs 25/41 mẫu, tỉ lệ 61 %. Chưa xác định. 1400 base pairs 27/41 mẫu, tỉ lệ 66 %. Chưa xác định. 1600 base pairs 26/41 mẫu, tỉ lệ 63 %. Chưa xác định. 1900 base pairs 35/41 mẫu, tỉ lệ 85 %. Chưa xác định. 2300 base pairs 30/41 mẫu, tỉ lệ 73 %. Chưa xác định. Khi điện di bằng gel agarose, độ dài của các band sẽ không thật sự chính xác do những hạn chế của gel agarose. Những band trên bản điện di có thể không hoàn toàn bằng nhau nhưng không thể phát hiện bằng mắt thường. Có thể giải trình tự của . quả thực hiện kỹ thuật RAPD, bƣớc đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền và nhận di n một số band có thể l chỉ thị phân tử 4.2.2.1. Kết quả thí nghiệm 1: Thực hiện theo quy trình của các tác. vortex khuấy trộn kỹ ở tốc độ thấp, khoảng 60 0 – 1.000 vòng/phút. TT 16 TT20TT23 TT26TT28 TT30 52 - Bước 2: Thêm 500 l chloroform : isoamylalcohol (2 4:1 ), sau đó có thể dùng máy vortex. (nên để qua đêm). Nên l y tỉ l DNA : dung dịch isopropanol l nh = 1 : 1. - Bước 7: Cho vào 300 l TE 1 X, ủ 37 o C trong 1 giờ. Có thể chỉ để khoảng 30 phút vì mục đích của bước này chỉ để