71 điều của tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu có tính đa dạng di truyền ở mức từ trung bình đến trung bình khá. Chúng tôi nhận thấy quần thể điều tại huyện Tân Thành có mức độ phân bố rộng nhất, đồng thời có mức độ tương đồng di truyền cao nhất, thể hiện ở điều có nhiều mẫu hoàn toàn giống nhau (hướng mũi tên). Quần thể cây điều tại huyện Xuyên Mộc cũng có mức độ đa dạng di truyền khá cao, đồng thời có bản chất di truyền giống với quần thể điều của huyện Tân Thành. Quần thể điều ở huyện Châu Đức có mức độ đa dạng khá cao, biểu hiện ở mức độ phân bố phân tán rộng trên cây di truyền, đồng thời bản chất di truyền cũng khá gần với quần thể điều ở huyện Tân Thành. Như vậy, với mức độ đa dạng di truyền cao cho thấy quần thể điều của các huyện Châu Đức, Tân Thành, Xuyên Mộc khá đa dạng, đồng thời có mức độ tương đồng di truyền cao với các quần thể điều của các huyện khác cho thấy quần thể điều của các huyện Châu Đức, Tân Thành, Xuyên Mộc có thể có khả năng thích nghi cao với những điều kiện canh tác của các huyện khác nói riêng và của toàn tỉnh nói chung. Công tác chọn giống nên tập trung tại 3 huyện này, nếu có khả năng chọn được giống điều tốt nhất tại 3 huyện này thì khả năng phổ biến giống tốt nhất này trên địa bàn toàn tỉnh có thể rất lớn. Tính đa dạng di truyền của các đặc điểm nổi bật có liên quan đến hiệu quả kinh tế cũng được đánh giá là trung bình, vì vậy có thể nói, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu có tiềm năng lớn để phát triển cây điều có chất lượng cao và đồng đều trên địa bàn toàn tỉnh, rất thuận lợi cho các công việc phổ biến kỹ thuật canh tác. Công việc sau thu hoạch cũng thuận lợi hơn do sử dụng công nghệ đồng bộ để chế biến hạt điều, sủ dụng một loại tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng nhân điều thành phẩm, góp phần làm tăng và ổn định giá trị nhân điều thành phẩm. 4.2.2.10. Hạn chế của kết quả đánh giá đa dạng di truyền bằng kỹ thuật PCR – RAPD Kết quả đánh giá đa dạng di truyền chưa thực sự chính xác và đầy đủ, bắt nguồn từ những nguyên nhân sau:  Số lượng mẫu thu thập được chưa đủ để thể hiện thực tế, chưa mang tính đại diện cao. 72  Kết quả ly trích DNA không tốt, chỉ thực hiện phản ứng PCR – RAPD cho 50 mẫu, thu được kết quả của 41 mẫu. Các mẫu không tách chiết được DNA chủ yếu thuộc huyện Châu Đức và Xuyên Mộc, làm ảnh hưởng đến kết quả chung do đây là 2 huyện có diện tích trồng điều nhiều nhất tỉnh.  Phản ứng PCR – RAPD chưa hoàn thiện.  Do những hạn chế của kỹ thuật điện di bằng agarose không cho độ phân tách cao, độ dài của các band có thể không bằng nhau nhưng không thể phân biệt được bằng mắt thường nên có thể nhận định sai độ dài của band. 4.2.3. Kết quả thực hiện kỹ thuật AFLP trên một số mẫu DNA lá điều 4.2.3.1. Kết quả cắt giới hạn và gắn adapter (hình 4.20) Hình 4.20. Kết quả phản ứng cắt và gắn adapter. Chúng tôi thấy có dấu hiệu sự cắt và gắn adapter một số đoạn có kích thước khác nhau trải dài trên bản điện di. Số lượng các đoạn tạo ra có thể là rất lớn. 4.2.3.2. Kết quả phản ứng nhân bản tiền chọn lọc (hình 4.21) TT1 TT31 CD40 TT78 TT4 TT9 VT38 CD45 ĐC 73 Hình 4.21. Kết quả phản ứng nhân bản tiền chọn lọc. Trên bản điện di có dấu hiệu sự nhân bản tiền chọn lọc một số phân đoạn. 4.2.3.3. Kết quả thực hiện phản ứng nhân bản chọn lọc Sử dụng máy giải trình tự gene AB Applied Biosystem 3100 điện di sản phẩm phản ứng nhân bản chọn lọc. Các đoạn DNA được nhân bản được hiển thị dạng peak đồng thời cho ta biết độ dài của đoạn. Kết quả được minh họa trên hình 4.23. Hình 4.22. Kết quả AFLP điện di trên máy AB sequencer 3100. Kết quả điện di AFLP cho thấy có sự khác biệt rõ ràng giữa các mẫu, các đoạn nhân bản chọn lọc được tạo ra có thể phân biệt với nhau đến từng nucleotide, giúp phát TT1 TT31 CD40 XM78 TT4 TT9 VT38 CD45 74 hiện sự khác biệt rất rõ ràng mà phương pháp điện di truyền thống không thể có được. Chiều dài các đoạn tạo ra có độ tin cậy lớn do mức độ lặp lại hoàn toàn giống nhau giữa các mẫu cao, được ước lượng bằng cách so sánh vị trí tương đối của các đoạn nhân bản chọn lọc với thang chuẩn. Tuy nhiên vẫn còn nhiều những đoạn ngắn khoảng dưới 100 basepairs (không được lấy làm kết quả do không có độ tin cậy cao), cho thấy kỹ thuật AFLP trên DNA cây điều vẫn còn phải được tiến hành hoàn thiện hơn nữa. 4.2.3.4. Phân tích kết quả AFLP trên một số mẫu DNA lá điều Kết quả cho thấy có 4 tổ hợp primer cho số band nhiều nhất, được trình bày trong bảng 4.4. Bảng 4.4. Kết quả thực hiện AFLP trên một số mẫu DNA lá điều. Tổ hợp primer nhân bản chọn lọc Tổng số band tạo ra Band đồng hình Band đa hình MseI + CAA – EcoRI + ACT (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + AGG (Green) 36 1 (2,8 %) 35 (97,2 %) MseI + CAA – EcoRI + ACA (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + ACG (Green) 14 1 (7,3 %) 13 (92,7 %) Từ kết quả AFLP chúng tôi nhận thấy một số điều sau:  Tổng số band tạo ra của kỹ thuật AFLP nhiều hơn hẳn so với kỹ thuật RAPD, do đó làm tăng khả  Các đoạn tạo ra có chiều dài ngắn, dưới 500 basepairs.  Có thể phân biệt được những đoạn chỉ hơn kém nhau đến 1 nucleotide, điều này làm tăng độ tin cậy năng chính xác khi phân tích kết quả để đánh giá đa dạng di truyền.của kết quả. 75  Mức độ phát hiện các band đa hình cao hơn nhiều so với kỹ thuật RAPD. Theo kết quả điện di giải trình tự (danh sách các band của các tổ hợp primer nhân bản chọn lọc được trình bày trong phụ luc), chúng tôi nhận thấy một số band đặc biệt:  Với 4 mẫu TT4, TT9, VT38 và CD45 thực hiện với tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ nhất gồm: MseI + CAA – EcoRI + ACT (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + AGG (Green), kết quả thu được 36 band, trong đó chúng tôi nhận thấy các band 127 base pairs, 224 base pairs, 255 base pairs, 307 base pairs và 309 base pairs chỉ có ở mẫu CD45, có thể là chỉ thị phân tử cho tính trạng quả nhỏ ở mẫu CD45. Band 223 base pairs chỉ có ở mẫu VT8, có thể là chỉ thị phân tử của tính trạng ít hạt chỉ có ở mẫu VT8. Band 456 base pairs chỉ có ở mẫu TT4, có thể là chỉ thị phân tử của tính trạng quả rất nhỏ, còn xanh mà đã già chỉ có ở mẫu TT4.  Với 4 mẫu TT1, TT31, CD40 và XM78 thực hiện với tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ hai gồm: MseI + CAA – EcoRI + ACA (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + ACG (Green), kết quả thu được 14 band, trong đó chúng tôi nhận thấy band 181 base pairs và band 254 base pairs chỉ có ở mẫu TT31 có thể là chỉ thị phân tử của tính trạng quả vàng của mẫu TT31. Các band này nếu được tiếp tục nghiên cứu (giải trình tự,…) có thể cho một số thông tin quan trọng liên quan đến tính trạng hạt to và một số tính trạng khác. Chúng tôi đã tiến hành phân tích đa dạng di truyền của từng tổ hợp primer khác nhau. Sử dụng phần mềm NTSYS chúng tôi xây dựng được 2 cây di truyền như hình 4.23 và 4.25:  Hình 4.23 là cây di truyền của 4 mẫu TT4, TT9, VT38 và CD45 thực hiện với tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ nhất gồm 2 tổ hợp: MseI + CAA – EcoRI + ACT (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + AGG (Green). 76 Hình 4.23. Cây di truyền kết quả AFLP tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ nhất. Qua hình 4.23 chúng tôi nhận thấy mức độ tương đồng di truyền của các mẫu đã hạ thấp xuống chỉ còn từ 37 % – 61 %, đồng thời các mẫu đều thuộc các nhánh riêng biệt, điều này cho ta thấy mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu TT4, TT9, VT38 và CD45 là khá cao. Chúng tôi tiến hành so sánh với mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu này khi thực hiện bằng kỹ thuật RAPD (hình 4.24). Hình 4.24. Cây di truyền của 4 mẫu TT4, TT9, VT38, CD45 thực hiện RAPD. Chúng tôi nhận thấy mức độ tương đồng di truyền của 4 mẫu TT4, TT9, VT38, CD45 thực hiện RAPD khá cao, từ 70 % – 90 %, cao hơn hẳn so với khi sử dụng kỹ thuật AFLP. Như TT9 và VT38 giống nhau tới 90 % theo RAPD, nhưng chỉ 61 % theo AFLP. Như vậy, mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu TT4, TT9, VT38, CD45 thực hiện theo kỹ thuật AFLP cao hơn so với kỹ thuật RAPD. 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 Coefficient TT4 CD45 TT9 VT38 0,37 0,43 0,49 0,55 0,61 Coefficient TT4 CD45 TT9 VT38 77  Hình 4.25 là cây di truyền của 4 mẫu TT1, TT31, CD40 và XM78 thực hiện với tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ hai gồm 2 tổ hợp: MseI + CAA – EcoRI + ACA (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + ACG (Green). Hình 4. 25. Cây di truyền kết quả AFLP tổ hợp thứ hai. Tương tự như tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ nhất, mức độ tương đồng di truyền của 4 mẫu TT1, TT31, CD40 và XM78 từ 45 % - 65 %, đồng thời thuộc 4 nhánh khác nhau, cho thấy mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu này khá cao. Chúng tôi cũng thực hiện so sánh với mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu này khi thực hiện bằng kỹ thuật RAPD (hình 4.26). Hình 4.26. Cây di truyền của 4 mẫu TT1, TT31, CD40, XM78 thực hiện RAPD. Chúng tôi cũng nhận thấy mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu TT1, TT31, CD40, XM78 thực hiện theo kỹ thuật AFLP cao hơn so với thực hiện theo kỹ thuật RAPD do nhận thấy mức độ tương đồng di truyền của RAPD cao hơn so với AFLP. 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 Coefficient TT1 CD40 XM78 TT31 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 Coefficient TT1 XM78 TT31 CD40 78 4.2.3.5. Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật AFLP so với kỹ thuật RAPD Sau khi so sánh kết quả của kỹ thuật AFLP với kết quả cảu kỹ thuật RAPD, bước đầu chúng tôi nhận định những đặc điểm nổi bật của kỹ thuật AFLP so với kỹ thuật RAPD là:  Tổng số sản phẩm khuếch đại tạo ra của kỹ thuật AFLP nhiều hơn hẳn so với kỹ thuật RAPD.  Mức độ phát hiện đa hình của kỹ thuật AFLP cao hơn hẳn so với kỹ thuật RAPD do có khả năng phân biệt độ dài các đoạn rất cao.  Kỹ thuật AFLP có khả năng đánh giá mức độ đa dạng di truyền với độ tin cậy cao hơn nhiều so với kỹ thuật RAPD.  Kỹ thuật AFLP có khả năng tốt hơn trong việc phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao hơn so với kỹ thuật RAPD. Tuy nhiên khi tiến hành kỹ thuật AFLP có một số khó khăn hơn so với kỹ thuật RAPD, đó là quy trình tiến hành mất nhiều thời gian, chi phí cao và máy móc thiết bị phức tạp khó thao tác. 79 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Qua quá trình thực hiện các thí nghiệm trên, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 5.1.1. Phần thu thập mẫu Thu thập được mẫu lá từ 80 cá thể nổi trội và đã thu thập các dữ liệu có liên quan của tất cả các cá thể này. 5.1.2. Phần tách chiết DNA Chúng tôi đã tiến hành tách chiết 80 mẫu lá thu thập được, kết quả thu được 55 mẫu cho nồng độ DNA trung bình khoảng 70 – 80.ng/μl. Chúng tôi nhận thấy DNA lá điều sau khi tách chiết thường bị gãy nhiều, nồng độ DNA thấp và rất khó tách được DNA của lá điều non. 5.1.3. Phần kỹ thuật RAPD, đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử Nói chung, phản ứng PCR – RAPD sử dụng primer 11 mà chúng tôi thực hiện là khá ổn định, khả năng nhân bản cao. Đã nhận biết được những band có độ dài khoảng 550 base pairs, 600 base pairs, 700 base pairs, 750 base pairs, 900 base pairs, 1050 base pairs, 1200 base pairs, 1400 base pairs, 1600 base pairs, 1900 base pairs và 2300 base pairs, trong đó các bands khoảng 550 base pairs, 900 base pairs và 1050 base pairs là các band đặc trưng khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD với primer 11. Hai band 600 base pairs và 700 base pairs khá đặc biệt, có thể tiếp tục nghiên cứu để sử dụng như là các chỉ thị phân tử cho những tính trạng liên quan. Bước đầu chúng tôi nhận định tính đa dạng di truyền của cây điều được trồng tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu ở mức trung bình đến trung bình khá. Theo sơ đồ cây di truyền thì hệ số tương đồng di truyền biến động từ 0,53 – 1, điều này đồng nghĩa với nhận định là quần thể cây điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu có mức độ tương đồng về di 80 truyền khá cao, mức độ tập trung giống cao, vì vậy rất thuận lợi cho công tác phân loại giống và phổ biến kỹ thuật canh tác, phát triển mạnh diện tích canh tác những giống có chất lượng cao hay tìm kiếm những cá thể nổi trội để lai tạo giống mới với chất lượng tốt hơn hẳn các giống hiện có. 5.1.4. Phần kỹ thuật AFLP Quá trình xây dựng phương pháp tiến hành kỹ thuật AFLP trên cây điều chúng tôi nhận thấy 4 tổ hợp primer nhân bản chọn lọc cho nhiều band với mức độ xuất hiện đa hình rất cao, gồm:  MseI + CAA – EcoRI + ACT (màu xanh dương).  MseI + CAA – EcoRI + AGG (màu xanh lá cây).  MseI + CAA – EcoRI + ACA (màu xanh dương).  MseI + CAA – EcoRI + ACG (màu xanh lá cây). Bước đầu chúng tôi nhận thấy kết quả đánh giá đa dạng di truyền dựa trên kỹ thuật RAPD và AFLP có sự khác nhau rõ rệt, trong đó kỹ thuật AFLP cho kết quả tốt và có độ tin cậy cao hơn hẳn kỹ thuật RAPD, ngoài ra khả năng nhận diện chỉ thị phân tử của kỹ thuật AFLP tốt hơn và đáng tin cậy hơn 5.2. Đề nghị 5.2.1. Về phƣơng hƣớng phát triển canh tác điều ở tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Dựa trên những kết luận được rút ra, chúng tôi đề nghị các ban ngành có liên quan đến ngành nông nghiệp nói chung và đến việc quy hoạch phát triển cây điều nói riêng của tỉnh cần tiến hành khảo sát tình hình canh tác cây điều trên địa bàn tỉnh ở quy mô lớn, từ đó rút ra được tình hình canh tác cây điều của tỉnh để tiến hành phổ biến kỹ thuật canh tác đem lại hiệu quả kinh tế cao cho nông dân trồng điều, và quan trọng hơn là đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều, tìm được giống điều tốt nhất và phù hợp nhất cho điều kiện canh tác của tỉnh. Ngoài ra còn có thể tìm được nguồn gene của những cá thể hay giống điều tốt và ổn định để làm nguyên liệu cho những nghiên cứu về lai tạo giống. Chỉ khi nào đánh giá được đầy đủ tính đa dạng di truyền của cây điều tỉnh nhà mới có thể vạch ra chiến lược phát triển cây điều phù hợp, tránh được tình trạng phát triển tự phát như hiện nay. . thuật AFLP so với kỹ thuật RAPD Sau khi so sánh kết quả của kỹ thuật AFLP với kết quả cảu kỹ thuật RAPD, bước đầu chúng tôi nhận định những đặc điểm nổi bật của kỹ thuật AFLP so với kỹ thuật RAPD. nhận thấy mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu TT1, TT31, CD40, XM 78 thực hiện theo kỹ thuật AFLP cao hơn so với thực hiện theo kỹ thuật RAPD do nhận thấy mức độ tương đồng di truyền của RAPD cao. thuật RAPD l :  Tổng số sản phẩm khuếch đại tạo ra của kỹ thuật AFLP nhiều hơn hẳn so với kỹ thuật RAPD.  Mức độ phát hiện đa hình của kỹ thuật AFLP cao hơn hẳn so với kỹ thuật RAPD do có