28 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thí nghiệm đƣợc tiến hành từ 1/3/2005 đến 1/8/2005 tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.1 Vật liệu 3.1.1 Trang thiết bị và dụng cụ 3.1.1.1 Trang thiết bị Tủ cấy, nồi hấp, kính hiển vi, máy đo pH, cân điện tử, máy nƣớc cất, máy lạnh 3.1.1.2 Dụng cụ Dao ghép, dao cắt mẫu, kẹp, đĩa cấy, kéo, đèn cồn, nhíp 3.1.2 Mẫu cấy Bƣởi dùng làm chồi ghép đƣợc lấy ở các nhà vƣờn trồng giống bƣởi có giá trị kinh tế cao (bƣởi Năm Roi ở Cần Thơ, bƣởi Da Xanh ở Bến Tre và bƣởi Đƣờng Lá Cam ở Đồng Nai). Bƣởi dùng làm gốc ghép đƣợc lấy từ các giống bƣởi có khả năng sinh trƣởng mạnh và sức chống chịu tốt nhƣ giống bƣởi Bồng ở Huế và giống bƣởi Xim Vang ở Đồng Nai. 3.1.3 Môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng MS là môi trƣờng đƣợc dùng trong thí nghiệm kết hợp với các nồng độ khác nhau của chất kích thích sinh trƣởng. Môi trƣờng dùng để ƣơm hạt nảy mầm: môi trƣờng MS với 7g agar và không có chất kích thích nảy mầm. Môi trƣờng dùng để giâm cành và lấy chồi ghép: môi trƣờng MS kết hợp với 7g agar và 3 mg/l BA cùng với 0.1 mg/l NAA. Môi trƣờng dùng để nuôi cây sau khi ghép: môi trƣờng MS với nồng độ đƣờng cao 75 g/l kết hợp với chất kích thích ra rễ 0.5 mg/l. Môi trƣờng đƣợc chuẩn bị và hấp khử trùng ở 121 0 C, áp suất 1 atm, trong 25 phút. 29 Thành phần môi trƣờng MS (Murashige&Skoog, 1962) Bảng 3.1: Thành phần môi trƣờng MS (Murashige & Skoog) 3.2 Điều kiện nuôi cấy Cây ghép đƣợc đặt ở điều kiện nhiệt độ là 25 0 C – 28 0 C , ánh sáng đèn huỳnh quang (cƣờng độ ánh sáng: 50 – 100 µmol m -2 s -1 ), ẩm độ 60 – 65%, với thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày đêm. Đa lƣợng KNO 3 1900 mg/l NH 4 NO 3 1650 mg/l MgSO 4 . 7H 2 O 370 mg/l CaCl 2 .2H 2 O 440 mg/l KH 2 PO 4 170 mg/l FeSO 4 .7H 2 O 27.8 mg/l Na 2 EDTA 37.3 mg/l Vi lƣợng MnSO 4 .4H 2 O 22.3 mg/l KI 0.83 mg/l H 3 BO 3 6.2 mg/l ZnSO 4 .7H 2 O 8.6 mg/l CuSO 4 .5H 2 O 0.025 mg/l Na 2 MoO 4 .2H 2 O 0.25 mg/l CoCl 2 .6H 2 O 0.025 mg/l Vitamine Nicotinic acid 0.5 mg/l Pyridoxine-HCl 0.5 mg/l Thiamine-HCl 0.1 mg/l myo-Inositol 100 mg/l Aminoacid Glycine 3.0 mg/l Agar Agar 7 g/l Đƣờng Sucrose 75 g/l 30 Đối với giai đoạn tạo cây con làm gốc ghép thì hạt đƣợc ƣơm trong điều kiện tối hoàn toàn cho đến khi hạt nảy mầm thì chuyển ra điều kiện ở phòng nuôi cây bình thƣờng. 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Bố trí thí nghiệm Thực hiện thí nghiệm vi ghép trên cây bƣởi với 3 yếu tố đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Yếu tố 1: Gốc ghép với 2 loại là gốc bƣởi Bồng và gốc bƣởi Xim Vang. Yếu tố 2: Chồi ghép với 3 loại là chồi bƣởi Năm Roi, chồi bƣởi Da Xanh và chồi bƣởi Đƣờng Lá Cam. Yếu tố 3: Cách ghép, có 3 cách ghép là cách ghép hàm ếch (E), cách ghép mặt cắt (M) và cách ghép chữ T ngƣợc (T). Tổ hợp 3 yếu tố ta có 18 nghiệm thức với 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức tiến hành trên 5 cây, mỗi cây đƣợc nuôi cấy trong một ống nghiệm. Tổng cộng có 18*3*5 = 270 cây. Bảng 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm NT Gốc ghép Chồi ghép Cách ghép 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Xim Vang (XV) Năm Roi (NR) Năm Roi (NR) Năm Roi (NR) Da Xanh (DX) Da Xanh (DX) Da Xanh (DX) Đƣờng Lá Cam (ĐLC) Đƣờng Lá Cam (ĐLC) Đƣờng Lá Cam (ĐLC) E T M E T M E T M Bồng (B) Năm Roi (NR) Năm Roi (NR) Năm Roi (NR) Da Xanh (DX) Da Xanh (DX) E T M E T 31 15 16 17 18 Da Xanh (DX) Đƣờng Lá Cam (ĐLC) Đƣờng Lá Cam (ĐLC) Đƣờng Lá Cam (ĐLC) M E T M Ghi chú: NT: Nghiệm thức 3.3.2 Chỉ tiêu theo dõi Thí nghiệm đƣợc theo dõi với các chỉ tiêu sau: (a) Tỷ lệ sống của cây vi ghép Cây vi ghép sống: là cây vi ghép (chồi trên gốc ghép) còn xanh và có mô sẹo hình thành nơi vết cắt sau 7 ngày vi ghép. Tỷ lệ sống của cây vi ghép (%) = (số cây vi ghép sống/tổng số cây vi ghép)*100. (b) Số chồi bật mầm của cây vi ghép Chồi mới đƣợc hình thành: là chồi mới bật lên từ chồi ghép ban đầu khi cây vi ghép còn sống (sau 7 ngày vi ghép). Tỷ lệ chồi mới đƣợc hình thành (%) = (số chồi mới đƣợc hình thành/số cây vi ghép sống). (c) Chiều cao chồi cây vi ghép (mm) Chiều cao chồi của cây vi ghép là chiều cao của chồi ghép đƣợc ghép lên gốc ghép. Tốc độ tăng trƣởng chiều cao (mm/7 ngày) = (chiều cao chồi 28 ngày sau vi ghép) – (chiều cao chồi 21 ngày sau vi ghép)/7 ngày. (d) Số lá của chồi ghép Số lá của chồi ghép là số lá có trên chồi ghép của cây vi ghép. Tốc độ ra lá (lá/7 ngày) = (số lá 28 ngày sau vi ghép) – (số lá 21 ngày sau vi ghép)/7 ngày 3.3.3 Xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý dựa trên phần mềm Statgraphics 7.0 và Excel 3.3.4 Quy trình thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc thực hiện theo quy trình sau: 32 Hình 3.1: Vi giâm cành bƣởi Da Xanh trên môi trƣờng MS a. Chuẩn bị chồi ghép Chồi bƣởi đƣợc nuôi cấy in vitro bằng phƣơng pháp vi giâm cành để tạo chồi ghép, dùng dao mổ cắt lấy đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc từ 0.1 – 1 mm, cắt nhọn phần gốc. Các cành non của các giống bƣởi dùng tạo chồi đƣợc cắt bỏ hết lá, cắt từng đoạn 2 – 3 cm, cho vào erlen rửa sạch bằng nƣớc xà phòng loãng, sau đó rửa sạch xà phòng bằng nƣớc cất nhiều lần. Đƣa mẫu vào tủ cấy vô trùng, lắc với cồn 70 0 trong 1 phút. Rửa sạch cồn bằng nƣớc cất vô trùng. Xử lý bằng nƣớc javel trong 30 phút, sau đó rửa sạch bằng nƣớc cất vô trùng. Cành mẫu sau đó đƣợc cắt bỏ cuống lá và hai đầu của phần thân đã bị chất khử trùng tẩy trắng và cắm các cành đó vào môi trƣờng MS có BA 3 mg/l + NAA 0.1 mg/l, cho phần cuống hƣớng lên trên, chồi ngủ phải nằm trên mặt môi trƣờng. 33 Hình 3.3: Hạt bƣởi Bồng đã khử trùng Nách lá chứa chồi Đỉnh sinh trƣởng Lá đầu tiên Biểu bì Biểu bì Mạch dẫn Mạch dẫn Hình 3.2: Cấu trúc chồi đỉnh Nuôi mẫu ở điều kiện ánh sáng 2000 lux, chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ 25 o C. Sau 3 tuần, các chồi ngủ bật mầm đƣợc tách ra và lấy chồi đỉnh nuôi trong môi trƣờng MS có BA 2 mg/l, sau 7 ngày lấy đỉnh sinh trƣởng để ghép. b. Chuẩn bị gốc ghép Gốc ghép đƣợc tạo ra bằng cách gieo hạt, cây mầm tạo ra đƣợc dùng làm gốc ghép. Hạt lấy trực tiếp từ trái chín, rửa sạch bằng nƣớc xà phòng loãng, sau đó rửa lại nhiều lần bằng nƣớc cất cho đến khi sạch hết lớp nhớt bám trên vỏ hạt, rồi cho vào erlen vô trùng, chuyển vào tủ cấy. Ngâm hạt trong cồn 70 0 trong 2 – 3 phút, sau đó rửa sạch cồn bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Xử lý hạt bằng dung dịch nƣớc javel trong 30 phút. Rửa sạch lại bằng nƣớc cất khoảng 3 lần cho đến khi không còn mùi javel nữa. 34 Hình 3.4: Gốc ghép với ba cách ghép mắt cắt, chữ T ngƣợc và ghép vào lỗ trên thân (hàm ếch) Từng hạt đƣợc tách lớp vỏ trấu, vỏ lụa sau đó gieo vào các ống nghiệm Cây mầm cao 5 – 8 cm có thể chọn làm gốc ghép. Gốc ghép ở độ tuổi từ 14 – 20 ngày sau khi nảy mầm thì đƣợc cắt bỏ phần thân trên và rễ sao cho phần thân trên hai lá mầm còn khoảng 3 cm và phần rễ còn rễ trụ dài khoảng 2 cm. Gốc ghép đó đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS có 75 g đƣờng và chất kích thích sinh trƣởng NAA 0.5 mg/l, sau 1 tuần gốc ghép sẵn sàng để ghép. c. Thực hiện vi ghép  Tạo chồi ghép: Chồi ghép là các đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc 0,1 – 1 mm đƣợc cắt từ đỉnh chồi của các giống bƣởi NR, DX và ĐLC sau khi nuôi cấy trong ống nghiệm.  Tạo gốc ghép: Các cây mầm B và XV đƣợc tạo ra trong ống nghiệm đƣợc cắt bỏ phần trụ trên lá mầm để lại phần thân cao khoảng 2 – 3 cm mang 2 lá mầm và rễ. Dùng dao nhọn cắt vào đƣờng kính thân, nơi vòng tƣợng tầng khoảng 1 mm chiều sâu, đặt chồi ghép vào. Mỗi cách cắt gốc ghép sẽ tạo ra một cách ghép khác nhau. Có các cách ghép chủ yếu sau: Ghép áp mặt cắt (M): đặt mắt ghép trực tiếp lên bề mặt vết cắt, ngay trên vòng tƣợng tầng. Ghép chữ T ngƣợc (T): dùng lƣỡi dao cắt vết ghép hình chữ T ngƣợc, chân chữ T đẻ lộ vùng tƣợng tầng là nơi đặt mắt ghép. Ghép hàm ếch (E): tạo vết ghép lõm hình hàm ếch sâu đến vùng tƣợng tầng, mắt ghép đặt vào đáy hàm ếch.  Ghép: chồi ghép đƣợc ghép lên vị trí cắt trên gốc ghép, tạo nên cây vi ghép. 35 d. Nuôi cây ghép Vi ghép là một kỹ thuật phối hợp giữa ghép và nuôi đỉnh sinh trƣởng. Cây vi ghép đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS có bổ sung 0.5 mg/l NAA, nồng độ đƣờng là 7,5%, agar đƣợc dùng 7 g/l. Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tỷ lệ sống của cây vi ghép Kỹ thuật vi ghép tạo cây có múi sạch bệnh và có khả năng chống chịu điều kiện khắc nghiệt của thời tiết đã đƣợc nhiều tác giả khác nhau trong và ngoài nƣớc tiến hành. Mỗi tác giả thu đƣợc một kết quả khác nhau và tỷ lệ sống của cây đƣợc nâng dần lên thông qua các kỹ thuật ngày càng tối tân hơn và việc dùng các chất kích thích khác nhau. Sau 4 tuần thí nghiệm, chúng tôi thu đƣợc kết quả sau: Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến tỷ lệ sống của cây vi ghép NT Số cây vi ghép Số cây vi ghép sống Tỷ lệ sống của cây vi ghép (%) T1, 7 NSG T2, 14 NSG T3, 21 NSG T4, 28 NSG T1, 7 NSG T2, 14 NSG T3, 21NSG T4, 28 NSG 1 15 15 15 15 15 15 15 15 12 14 10 13 11 14 10 13 11 13 8 13 100 100 100 100 80,00 ab 93,33 a 66,67 ab 86,67 ab 73,33 abc 93,33 a 66,67 abc 86,67 ab 73,33 abcd 86,66 ab 53,33 bcd 86,66 ab 2 3 4 36 5 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 12 11 9 11 11 13 14 12 14 12 12 12 13 12 10 9 7 8 9 13 14 11 14 11 11 10 11 10 8 8 7 7 6 12 14 8 14 10 10 8 8 7 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 80,00 ab 73,33 ab 60,00 b 73,33 ab 73,33 ab 86,67 ab 93,33 a 80,00 ab 93,33 a 80,00 ab 80,00 ab 80,00 ab 86,67 ab 80,00 ab 66,67 abc 60,00 bc 46,67 c 53,33 c 60,00 bc 86,67 ab 93,33 a 73,33 abc 93,33 a 73,33 abc 73,33 abc 66,67 abc 73,33 abc 66,67 abc 53,33 bcd 53,33 bcd 46,67 cd 46,67 cd 40,00 d 80,00 abc 93,33 a 53,33 bcd 93,33 a 66,67 abcd 66,67 abcd 53,33 bcd 53,33 bcd 46,67 cd 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Ghi chú: NT: Nghiệm thức T1, 7 NSG: Tuần 1, 7 ngày sau ghép. T2, 14 NSG: Tuần 2, 14 ngày sau ghép. T3, 21 NSG: Tuần 3, 21 ngày sau ghép. T4, 28 NSG: Tuần 4, 28 ngày sau ghép. Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức 0.05 dựa theo trắc nghiệm DUNCAN. Qua bảng ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến tỷ lệ sống của cây vi ghép có thể nhận xét sau: Đối với gốc ghép  Ở tuần 1 (từ ngày 1 đến ngày thứ 7 sau vi ghép), các cây vi ghép sống toàn bộ (100%) và không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các loại cây vi ghép đƣợc tạo ra. Điều này có thể đƣợc giải thích do chồi ghép đƣợc Hình 4.1: Cây vi ghép hình thành rễ mới sau 21 ngày 37 Hình 4.2: Cây vi ghép ở tuần thứ 3 (XV-NR-M): gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Năm Roi, cách ghép mặt cắt (M) nuôi cấy trƣớc một thời gian trên môi trƣờng có chất kích thích sinh trƣởng BA, dinh dƣỡng đƣợc chồi ghép hấp thụ có thể nuôi chồi ghép trong những ngày đầu vi ghép mà không bị ảnh hƣởng bởi dinh dƣỡng của gốc ghép.  Tuần thứ 2 (từ ngày 8 đến 14 sau vi ghép), tỷ lệ sống của cây vi ghép có giảm so với tuần 1 chứng tỏ có sự liên kết giữa chồi ghép và gốc ghép để hình thành hệ thống mạch dẫn. Gốc ghép XV đạt 76,29% sống và gốc ghép B đạt 84,44%, tuy nhiên sự khác biệt về tỷ lệ sống của hai loại gốc ghép này là không có ý nghĩa về mặt thống kê.  Sau 21 ngày vi ghép tỷ lệ sống của cây vi ghép có giảm và đều giảm ở cả hai loại gốc ghép. Sau 28 ngày vi ghép tỷ lệ sống của cây vi ghép đã ổn định, gốc ghép XV đạt 60% tỷ lệ sống và gốc ghép B đạt 77%. Chúng tôi nhận thấy rằng các cây vi ghép bị mất từ ngày 21 đến ngày 28 chủ yếu là do bị nhiễm nấm (điều kiện khách quan). Sự khác biệt về tỷ lệ sống của hai loại gốc ghép này là sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê và thấy rằng gốc ghép bƣởi B cho tỷ lệ sống 77% tốt hơn gốc ghép XV 60%. Đối với chồi ghép  Tỷ lệ thành công của cây vi ghép chủ yếu phụ thuộc vào tỷ lệ sống của chồi ghép. Nhận thấy ở tuần 1 tỷ lệ sống của chồi ghép đều đạt 100% và lý do nhƣ đã giải thích ở trên. Sự khác biệt về tỷ lệ sống của cây ghép ở tuần 2 (NR: 83,33%, DX: 82,22%, ĐLC: 75,56%) không có ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên tỷ lệ sống của cây vi ghép ở tuần 3 lại có sự khác biệt về mặt thống kê, chồi NR: 81,11% và chồi DX: 75,56% tỷ lệ sống, tuy nhiên chồi ghép ĐLC chỉ đạt 61,12%.  Nhìn chung cả ba loại chồi ghép đều giảm tỷ lệ sống nhƣng có sự khác biệt của ba loại chồi ghép này, sự khác biệt này do nhiều điều kiện tác động mà trong đó sự tiếp xúc . 73,33 abcd 86,66 ab 53 ,33 bcd 86,66 ab 2 3 4 36 5 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 12 11 9 11 11. tiêu sau: (a) Tỷ lệ sống của cây vi ghép Cây vi ghép sống: là cây vi ghép (chồi trên gốc ghép) còn xanh và có mô sẹo hình thành nơi vết cắt sau 7 ngày vi ghép. Tỷ lệ sống của cây vi ghép. kết quả sau: Bảng 4. 1: Ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến tỷ lệ sống của cây vi ghép NT Số cây vi ghép Số cây vi ghép sống Tỷ lệ sống của cây vi ghép (%) T1, 7 NSG T2, 14 NSG T3,