21 Sether D.M. và Hu J.S., (2002) còn nghiên cứu thấy nếu không có sự hiện diện của rệp thì dù cây có mang PMWaV cũng không xuất hiện triệu chứng bệnh. Từ đó, các ông đặt giả thuyết rằng bệnh héo đỏ đầu lá khi phát sinh có liên quan đến chất độc trong nước bọt của rệp - rệp sáp không chỉ là trung gian lây truyền bệnh mà còn là nguyên nhân gây bệnh. Bên cạnh rệp sáp, một loại côn trùng khác cũng ảnh hưởng đến sự lây lan và phát tán của bệnh héo đỏ đầu lá là kiến. Kiến và rệp có thể sống cộng sinh với nhau. Kiến ăn các chất mật do rệp tiết ra, đổi lại kiến làm tổ cho rệp và tha rệp đi phát tán khắp nơi. Nhờ có các tổ do kiến tạo ra, rệp được bảo vệ khá chắc chắn trước sự ảnh hưởng của thời tiết. Với sự cộng sinh này, kiến thúc đẩy sự phát tán rệp, từ đó làm lây lan virus gây bệnh. Có 3 loại kiến chính trên những vùng trồng dứa sống cộng sinh với rệp sáp: Pheidole megacephala (kiến đầu to), loài này chiếm ưu thế ở những vùng có cao độ dưới 700 m; Iridomyrmex humilis (kiến Argentina), loài này sống ở vùng có cao độ trên 600m và ở những vùng đất thấp, khô ráo thì Solenopsis germinata (kiến lửa) là loài nổi trội nhất (Rohrbach K.G. và ctv, 1988) Hình 2.6: Sự cộng sinh giữa kiến đầu to ( Pheidole megacephala ) và rệp sáp (Nguồn: http://www2.ctahr.hawaii.edu/ t-star/mealybug.htm) Mealybug 22 * Biện pháp phòng trừ Để phòng trừ bệnh héo đỏ đầu lá, theo Nguyễn Văn Kế (2002), cần áp dụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp như: - Chọn giống từ vùng ít bệnh. - Khử chồi bằng cách nhúng vào dung dịch thuốc trừ sâu như: Bi58, Supracid trong 5 phút, dựng đứng chồi lên cho thuốc tác dụng vào tận nách lá. - Trước khi trồng, khử đất bằng Diazon để trừ kiến và các ổ rệp. Làm sạch cỏ và các cây dứa của mùa trước còn sót lại để hạn chế chỗ ẩn nấp của rệp và kiến. - Trong quá trình dứa phát triển cần theo dõi phun thuốc trừ rệp và kiến. Tuy nhiên, những biện pháp này chỉ có tác dụng kiểm soát trung gian gây bệnh, tránh bệnh lây lan, phát tán chứ không thể phòng trừ bệnh triệt để. 2.5 Một số nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá trên thế giới và ở Việt Nam Tuy bệnh héo đỏ đầu lá đã xuất hiện từ rất lâu trên thế giới, nhưng mãi đến gần đây, các nghiên cứu về bệnh mới đạt được những thành tựu mong muốn. - Năm 1989, German và Gunasinghe đã tìm thấy những thể tương tự như Closterovirus ở những cây dứa bị héo đỏ đầu lá ở Hawaii và đặt tên là Pineapple closterovirus (PCV). - Kháng thể đa dòng (Polyclonal Anti-body – PAb) sản xuất ở Hawaii (Ullman D.E. và ctv, 1989) và Australia (Wakmen W. và ctv, 1995) được dùng để phát hiện PCV. Tuy nhiên, PAb cũng tương tác với protein của dứa nên không đem lại kết quả chính xác với kỹ thuật ELISA. - Năm 1996, Hu, Sether và Ullman đã thiết kế kháng thể đơn dòng (Monoclonal Anti-body) cho PMWaV. Tuy nhiên, thí nghiệm thiếu độ nhạy cần thiết nên phải dùng những mẫu rễ và lá giàu virus mới thu được kết quả. 23 - Năm 1997, Hu và cộng sự áp dụng phương pháp TBIA vào việc test PCV cho thấy kể cả cây có triệu chứng bệnh lẫn cây không có triệu chứng bệnh đều mang virus. - Năm 1998, Hu, Sether và Ullman tìm thấy PMWaV trên rệp sáp Dysmicoccus brevipes và Dysmicoccus neobrevipes . Xác định được rệp sáp là trung gian lây truyền PMWaV. - Năm 2001, Sether và cộng sự xác định được PMWaV gồm 2 dòng: PMWaV-1 và PMWaV-2. Bộ gene của chúng đã được giải trình tự và phân loại. Cũng trong nghiên cứu này, các mẫu dứa thu thập từ 17 nước trên thế giới đã được test PMWaV với kỹ thuật TBIA và RT-PCR với kết quả 100% các quốc gia trong thí nghiệm đều có dứa nhiễm PMWaV. - Năm 2002, Sether và Hu chứng minh cây mang PMWaV nhưng không có rệp sáp thì không xuất hiện bệnh. Tác giả đã đề ra giả thuyết độc tố trong nước bọt của rệp sáp cũng là một tác nhân cần thiết để gây bệnh. Tiến hành xử lý nhiệt để khử PMWaV trên các chồi dứa mang virus. Ở Việt Nam, nhìn chung chưa có nhiều nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá. Các thí nghiệm chỉ dừng lại ở bước xác định mối liên quan giữa mật độ rệp với mức độ bệnh trên dứa và thống kê tình hình phân bố bệnh ở một số địa phương. - Theo nghiên cứu của Phan Gia Tân (1984), trên giống dứa Queen, nếu chỉ có 6% số cây có rệp và mỗi cây có 1 – 10 con rệp thì cây chưa bị nhiễm bệnh hoặc nhiễm rất nhẹ. Với 90 – 92% cây có rệp và lượng rệp lẫn ấu trùng trên mỗi cây là 51 – 200 con thì cây bị nhiễm bệnh ở mức độ trung bình. Với 92% cây có rệp và mật độ ấu trùng trên 300 con/cây thì cây bị nhiễm bệnh nặng. - Một số thống kê về tình hình bệnh đỏ đầu lá của trường Đại học Nông Lâm TP.HCM cho thấy bệnh héo đỏ đầu lá xuất hiện ở các vùng được nghiên cứu với tỷ lệ bệnh cao: ở Bến Lức – Long An, Tân Phước – Tiền Giang và Đức Trọng – Lâm Đồng, tỷ lệ bệnh lần lượt là 9.3%, 8.1% và 4.1%. Còn tỷ lệ bệnh ở các nông trường: nông trường Phạm Văn Hai, nông trường Lê Minh Xuân – Tp.HCM và nông trường Thọ Vực – Đồng Nai lần lượt là 6%, 7% và 12.1% (Phạm Văn Khánh, 2003, Võ Thị Thúy Huệ, 2003, và Võ Thị Mỹ Hân, 2004). 24 Như vậy, hiện nay bệnh héo đỏ đầu lá đã xuất hiện ở nước ta với mật độ rộng và tỷ lệ cao, khi gặp điều kiện có thể lây lan thành dịch, gây thiệt hại lớn cho người trồng. Bên cạnh đó chúng ta vẫn chưa có biện pháp phòng trừ bệnh hữu hiệu mà chỉ có thể hạn chế bệnh bằng cách khống chế những nguồn trung gian gây bệnh. Tuy nhiên với những vùng chuyên canh quy mô lớn hàng trăm, hàng ngàn hecta thì các phương pháp như: trồng giãn cách xa giữa các luống, dùng thuốc trừ rệp, kiến không có tính khả thi cao. Vì vậy với những dự án đầu tư lớn cho cây dứa hiện nay (chương trình 3 cây, 3 con của thành phố Hồ Chí Minh) thì rất cần phải xây dựng một quy trình phòng trừ bệnh thật sự hiệu quả. Từ thành quả của những nghiên cứu đã được thực hiện trên thế giới, ta có thể đề ra một mô hình phòng trừ bệnh héo đỏ đầu lá như sau: 1. Xử lý nhiệt chồi dứa để khử PMWaV. 2. Test các chồi đã xử lý nhiệt để xác định những mẫu sạch PMWaV. 3. Nhân nhanh các mẫu sạch virus bằng phương pháp nuôi cấy mô để tạo nguồn chồi giống sạch bệnh, cung cấp cho người trồng. Với mô hình trên, các chồi giống sạch virus khi trồng sẽ không phát bệnh dù có xuất hiện rệp sáp. Vậy nếu xử lý nhiệt tốt và có một phương pháp phát hiện PMWaV thật chính xác thì ta sẽ phòng chống được bệnh héo đỏ đầu lá thật sự hữu hiệu, nâng cao năng suất của cây dứa, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho xã hội 2.6 Các phương pháp chẩn đoán PMWaV Từ các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá đã thực hiện trên thế giới cho thấy, hiện nay có 3 phương pháp chính để chẩn đoán PMWaV-1 trên cây dứa. - Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay): năm 1978, Clark và Adam đã lần đầu tiên áp dụng thành công phương pháp này để chẩn đoán bệnh virus hại khoai tây. Phương pháp này hoạt động dựa trên nguyên tắc kháng nguyên – kháng thể. Hiện nay đây là phương pháp huyết thanh hiện đại và nhanh chóng để chẩn đoán các bệnh virus. 25 - Phương pháp TBIA (Tissue Bloting Immuno Assay): phương pháp này được Lin và ctv sử dụng lần đầu tiên năm 1990 cũng hoạt động dựa trên nguyên tắc kháng nguyên – kháng thể. Phương pháp này có nhiều ưu điểm hơn ELISA vì nó không đòi hỏi phải chuẩn bị mẫu tỷ mỉ và có thể cung cấp thông tin về sự phân bố virus trong mẫu bệnh. - Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction): là phương pháp nhân nhanh mRNA, gồm 2 bước: mRNA của virus được phiên mã ngược thành cDNA, sau đó cDNA này sẽ được khuếch đại. Kỹ thuật cho phép phát hiện và phân biệt được nhiều dòng virus gần giống nhau. Các phương pháp trên đều có những ưu điểm riêng. Với ELISA, TBIA tuy giá thành cao, nhưng có thể thực hiện rất dễ dàng, nhanh chóng, rất thích hợp cho việc test cây đang trồng trên đồng ruộng với qui mô lớn. TBIA còn có thể cung cấp thông tin về sự phân bố của virus trong mẫu bệnh nên có thể ứng dụng tốt vào những nghiên cứu về đặc điểm của bệnh. Còn với phương pháp RT-PCR, tuy cần nhiều thời gian thực hiện nhưng giá thành thấp và chính xác hơn 2 phương pháp trên. RT-PCR đòi hỏi lượng mẫu bệnh cần thiết cho phản ứng ít hơn ELISA rất nhiều, nhưng lại có thể phát hiện được những mẫu có lượng virus ban đầu rất thấp. Như vậy, với mô hình cung cấp giống sạch bệnh tập trung mà đề tài hướng tới, một mô hình đòi hỏi một phương pháp chẩn đoán PMWaV-1 thật chính xác thì phương pháp RT-PCR là phương pháp phù hợp nhất. 2.7 Gene HSP 70 của PMWaV Heat shock protein 70 kD (HSP 70) là một nhóm protein đặc biệt của sinh vật. Chức năng ban đầu của chúng là giúp tái đóng xoắn các protein bị biến tính vì nhiệt, giúp sinh vật có thể tồn tại được ở những điều kiện khắc nghiệt bất thường. Cũng chính vì thế mà chúng được đặt tên là heat shock protein. Ngoài ra, chúng còn có một số chức năng khác như giúp các protein mới được tạo ra hình thành các cấu trúc bậc cao, vận chuyển protein xuyên qua các màng tế bào và riêng ở Closterovirus, HSP 70 là một thành phần của protein vỏ trong quá trình tạo virion của virus. (Dolja V.V. và ctv, 1999) 26 Gene mã hóa HSP 70 là một gene có tính bảo tồn cao ở nhiều loài. Đặc biệt với nhóm Closterovirus, đã có rất nhiều nghiên cứu dựa vào gene này để xây dựng cây phân loài. Vì vậy, đối với PMWaV, HSP 70 là một gene rất quan trọng. Đây là vùng gene chính cho các thí nghiệm khuếch đại gene để phát hiện PMWaV và cũng dựa vào HSP 70 mà PMWaV được phân ra thành 2 loài: PMWaV-1 và PMWaV-2 (Sether D.M. và ctv, 2001). 2.8 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một công cụ khá mới trong sinh học phân tử, do Karl Mullis và cộng sự phát minh 1985 và đã liên tục được hoàn thiện và phát triển trong thời gian gần đây. Kỹ thuật PCR cho phép khuyếch đại một đoạn DNA mong muốn lên nhiều lần để có thể phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp PCR chủ yếu dựa trên khả năng tự nhân đôi, biến tính, và hồi tính của DNA. 2.8.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR Dựa trên khả năng biến tính và hồi tính của DNA cùng với sự tìm ra enzyme Taq-polymerase (1 loại DNA polymerase chịu nhiệt), người ta đã thiết lập được hàng loạt các chuỗi phản ứng nhân đôi DNA in vitro trong một thời gian ngắn. Khi ta làm biến tính (đun nóng) để đoạn DNA tách ra thành 2 mạch đơn và cung cấp 2 mồi (primer) chuyên biệt gồm mồi xuôi và mồi ngược bắt cặp bổ sung với 2 đầu của đoạn DNA cần nhân lên thì Taq-polymerase sẽ tổng hợp nên 2 sợi DNA mới. Như vậy nếu phản ứng nhân đôi DNA trên được lặp lại liên tục nhiều lần thì ta sẽ thu được 1 lượng khuyếch đại rất lớn của đoạn DNA cần nghiên cứu. Phản ứng PCR gồm có nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 giai đoạn: - Giai đoạn 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), nhiệt độ được nâng lên 93 - 100 o C. Ở nhiệt độ này tất cả các mạch xoắn kép của DNA đều được tách ra. - Giai đoạn 2: là giai đoạn bắt cặp (hybridization), nhiệt độ phản ứng được hạ xuống thấp hơn nhiệt độ nóng chảy - Tm của các primer (là nhiệt độ mà tại đó 2 mạch của một sợi đôi DNA tách ra hoàn toàn) cho phép các primer bắt cặp với 27 DNA khuôn mẫu. Mức nhiệt độ dao động khoảng 40 - 70 o C, tuỳ thuộc vào Tm của các primer và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. - Giai đoạn 3: là giai đoạn kéo dài (extension), nhiệt độ được nâng lên 68 - 72 o C. Ở nhiệt độ này Taq - polymerase hoạt động tốt nhất để kéo dài các mạch DNA. Đoạn DNA nằm giữa 2 primer được tổng hợp. Cứ sau 1 chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên, từ 1 DNA khuôn mẫu sẽ tạo ra được 2 DNA mới. Và sau mỗi lần lặp lại sẽ làm tăng gấp đôi lượng DNA mẫu của lần trước (tăng theo cấp số nhân). Hình 2.7: Phản ứng PCR. Chú thích: (A): giai đoạn biến tính (B): giai đoạn bắt cặp (C): giai đoạn kéo dài Tổng số DNA khuếch đại sau phản ứng PCR được tính theo công thức: Tổng DNA khuếch đại = m * 2 n Với m là số bản sao ban đầu của DNA mẫu, n là số chu kỳ 28 2.8.2 Các yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR 2.8.2.1 Dung dịch đệm (Buffer) Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion (ionic strength) cần thiết cho phản ứng xảy ra. Nồng độ các chất, pH của dung dịch đệm tùy thuộc vào nguồn enzyme DNA polymerase được dùng. Các thành phần của một dung dịch đệm điển hình gồm: KCl, MgCl 2 , gelatin và Tris – HCl (pH 8,5 ở nhiệt độ phòng). 2.8.2.2 Mg 2+ Nồng độ Mg 2+ là yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR. Nó làm tăng hoạt động của DNA polymerase, tăng Tm của DNA và sự tương tác giữa primer - nhiệt độ. Nồng độ Mg 2+ trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên trong khoảng từ 0,5 đến 5 mM. Nồng độ MgCl 2 từ 1,5 đến 2 mM thường được xem là tối ưu, nhưng nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Nồng độ Mg 2+ cao sẽ làm phân tử dây đôi ổn định hơn, kềm hãm sự biến tính hoàn toàn của các sợi đôi, làm cho kết quả PCR ít đi. Sự dư thừa Mg 2+ còn làm cho hiện tượng bắt cặp giả xảy ra nhiều hơn. Hiện tượng này làm primer bắt cặp ở những vị trí không chuyên biệt trên DNA khuôn tạo ra những sản phẩm không mong muốn với số lượng khá lớn. Ngược lại nếu nồng độ Mg 2+ quá thấp (< 0.5 mM), thì quá trình kéo dài sẽ xảy ra không hoàn toàn, tạo ra những sản phẩm DNA ngắn hơn bình thường. Đó là do trong phản ứng PCR, Mg 2+ đóng vai trò Co – factor của Taq polymerase nên nếu lượng Mg 2+ quá thấp thì Taq polymerase sẽ không thể hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài (Bùi Chí Bửu, 1999). 2.8.2.3 Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs) Là nguyên liệu cần thiết cho phản ứng tổng hợp DNA. Hỗn hợp dNTPs gồm 4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP và thường được sử dụng ở nồng độ 20 - 200 µ M cho mỗi nucleotide. Điều quan trọng là chúng ta phải giữ cho nồng độ của cả 4 dNTPs bằng nhau vì sự mất cân bằng thành phần các nucleotide sẽ làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase. 29 2.8.2.4 Primer (đoạn mồi) Primer là một trong những yếu tố quan trọng nhất, ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả cũng như độ chuyên biệt của phản ứng PCR. Chọn primer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR và cần tuân theo một số nguyên tắc sau: - Primer cho 1 phản ứng PCR gồm có 1 primer xuôi (forward) và 1 primer ngược (reverse). Xuôi và ngược là so với chiều sao mã. Trong hầu hết các ứng dụng phản ứng PCR, 2 primer xuôi và ngược đều phải có nồng độ bằng nhau. - Trình tự của primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa 2 primer hay giữa 1 primer với chính nó (trình tự của chúng không được bổ sung nhau). - Tm của 2 primer không cách xa nhau. - Trình tự của primer phải đặc trưng cho trình tự của DNA được khuyếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen. Trình tự giữa 2 primer không nên quá lớn, phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự Nhân, 2001). 2.8.2.5 Taq – polymerase Là một DNA polymerase chịu nhiệt, được tách chiết từ một vi khuẩn suối nước nóng có tên là Thermus aquaticus . Taq - polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính của phản ứng PCR và hoạt động tối ưu ở 68 – 72 o C . Nồng độ enzyme Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0.5 – 5 đơn vị trên 100 µ l dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao có thể tạo ra những sản phẩm không chuyên biệt làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, phản ứng sẽ không có đủ lượng enzyme cần thiết để tạo ra sản phẩm PCR theo mong muốn (Bùi Chí Bửu, 1999). 30 2.8.2.6 Số lượng chu kỳ trong phản ứng PCR Số chu kỳ cho 1 phản ứng tùy thuộc vào số lượng bản sao ban đầu của mẫu. Ví dụ nếu lượng bản mẫu ban đầu là 10 5 thì cần 25 – 30 chu kỳ, nếu lượng bản mẫu là 10 2 – 10 3 thì số lượng chu kỳ là 35 – 40 . Trong thực tế không nên thiết lập số chu kỳ quá lớn cho 1 phản ứng PCR. Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, ở giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân của lượng mẫu, sau đó hiệu quả khuyếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: - Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng - Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng - Các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau (Phan Cự Nhân, 2001). 2.9 Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription PCR) RT-PCR là một kỹ thuật cho phép ta khuếch đại các đoạn mRNA (RNA thông tin) để làm cơ sở cho việc nghiên cứu về sự biểu hiện gene (sự sao mã tạo ra các mRNA của các gen) hay nghiên cứu các retrovirus (các loại virus mang thông tin di truyền là mRNA). RT-PCR hoạt động dựa trên cơ sở của kỹ thuật PCR nhưng trước khi thực hiện phản ứng khuếch đại, có thêm giai đoạn tổng hợp cDNA (complementary DNA) từ sợi mRNA khuôn. Giai đoạn này được thực hiện nhờ enzyme reverse transcriptase, enzyme phiên mã ngược được phân lập từ retrovirus. Nếu cung cấp một primer bắt cặp với mRNA, enzyme reverse transcriptase sẽ thực hiện phản ứng phiên mã ngược, tổng hợp nên một sợi DNA bổ sung với sợi mRNA khuôn, gọi là sợi cDNA. Sau khi được tạo ra, sợi cDNA sẽ được dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng khuếch đại DNA thông thường. (Bùi Trang Việt, 2002) . mật độ ấu trùng trên 30 0 con /cây thì cây bị nhiễm bệnh nặng. - Một số thống kê về tình hình bệnh đỏ đầu lá của trường Đại học Nông Lâm TP.HCM cho thấy bệnh héo đỏ đầu lá xuất hiện ở các vùng. của cây dứa, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho xã hội 2.6 Các phương pháp chẩn đoán PMWaV Từ các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá đã thực hiện trên thế giới cho thấy, hiện nay có 3 phương pháp. dứa hiện nay (chương trình 3 cây, 3 con của thành phố Hồ Chí Minh) thì rất cần phải xây dựng một quy trình phòng trừ bệnh thật sự hiệu quả. Từ thành quả của những nghiên cứu đã được thực hiện