41 3.3.5 Giải trình tự sản phẩm RT-PCR Để kiểm tra độ đặc hiệu của sản phẩm RT-PCR, có 2 mẫu sản phẩm RT-PCR dương tính trên điện di, 1 của cây bệnh, 1 của chồi dứa thương phẩm (không có triệu chứng bệnh) được đem giải trình tự. Do hạn hẹp về thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi không thể trực tiếp tiến hành giải trình tự nên gửi mẫu sản phẩm RT-PCR sang công ty Macrogene – Hàn Quốc để thực hiện. Sau đó, trình tự sẽ được so sánh với dữ liệu của đoạn gene mã hóa cho HSP 70 của PMWaV-1 trên GenBank bằng các phần mềm Clustal X 1.83 và BLAST. 3.3.6 Giám định chồi giống dứa Áp dụng quy trình đã xây dựng được, tiến hành giám định trên 3 giống dứa Thái Lan, Trung Quốc, Lâm Đồng, mỗi giống gồm 30 mẫu chồi giống dứa thương phẩm được lấy ngẫu nhiên từ các nông trường. Tất cả được thực hiện phản ứng RT-PCR và điện di. 42 Phần 4 KẾT QUẢ – THẢO LUẬN 4.1 Kết quả ly trích RNA Sau khi tiến hành ly trích RNA tổng số của mẫu dứa, sản phẩm ly trích được điện di trong MOPS buffer 1X để kiểm chứng xem có thu được RNA hay không. Kết quả kiểm tra sản phẩm RNA sau ly trích được thể hiện qua hình sau: Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm ly trích RNA Chú thích: Giếng 1: Mẫu RNA không biến tính Giếng 2: Mẫu RNA biến tính Khi ly trích RNA thực vật, sản phẩm chiếm đại đa số là 2 tiểu phần ribosome 18S và 28S. Các loại RNA khác như mRNA, RNA virus có rất ít nên khi điện di, hầu như không thể thấy được các sản phẩm này, chỉ có thể thấy được 2 vạch 28S và 18S. Vì vậy, 2 vạch sản phẩm 28S, 18S được xem như là dấu hiệu nhận biết của RNA thực vật. Hình 4.1 cho thấy sản phẩm RNA ly trích được có chứa 2 vạch tương ứng với các ribosome 28S và 18S. Trong đó, ở giếng 2, mẫu RNA được làm biến tính với nhiệt trước khi điện di nên các sợi RNA duỗi ra và di chuyển trong gel chậm hơn giếng 1. Như vậy, kết quả trên cho thấy đã ly trích được RNA tổng số từ mẫu dứa. 28 S 18 S 1 2 43 4.2 Kết quả xây dựng quy trình RT-PCR 4.2.1 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của primer Cặp primer 225, 226 được chúng tôi khảo sát các đặc tính cơ bản và các cấu trúc thứ cấp bằng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer (http://www.scitools.idtdna.com/scitools/Applications/OligoAnalyzer/ ). Việc khảo sát các đặc tính cơ bản của cặp primer cho kết quả như sau Bảng 4.1: Các đặc tính cơ bản của cặp primer 225, 226 Primer 225 Primer 226 Trình tự Số Nu % GC Tm 5'-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3' 20 50 % 57,3 o C 5'-CGCACAAACTTCAAGCAATC-3' 20 45 % 55,7 o C Các thông số này của cặp primer 225, 226 hoàn toàn phù hợp với các yêu cầu cơ bản để một cặp primer hoạt động hiệu quả trong phản ứng RT-PCR như: nhiệt độ bắt cặp của 2 primer không cách xa nhau, số Nu tối ưu trong khoảng 10 - 25 Nu, và % GC mỗi primer ở 20 - 80 %. Tiếp theo là việc khảo sát khả năng hình thành các cấu trúc thứ cấp của primer, một yếu tố có ảnh hưởng lớn đến kết quả của phản ứng RT-PCR. Các cấu trúc này bao gồm cấu trúc kẹp tóc (hairpin loop – hình thành từ sự bắt cặp giữa các base trong cùng một primer), homo dimer (hai primer giống nhau tự bắt cặp), hetero dimer (primer xuôi bắt cặp với primer ngược). Nếu primer có các cấu trúc thứ cấp này bền vững thì primer sẽ kém hoạt động, hiệu quả của phản ứng PCR sẽ giảm đáng kể. Để xác định độ bền vững của các cấu trúc thứ cấp, người ta sử dụng chỉ số năng lượng tự do (Delta G, kcal/mole). Theo hãng IDT, các cấu trúc thứ cấp có năng lượng tự do lớn hơn -9 kcal/mole sẽ hầu như không ảnh hưởng đến hoạt động của phản ứng PCR, còn các cấu trúc có năng lượng tự do nhỏ hơn -9 kcal/mole đòi hỏi phải cung cấp một nhiệt độ khá cao mới có thể phá vỡ chúng. 44 Kết quả khảo sát các cấu trúc thứ cấp của cặp primer 225, 226 cho thấy: - Primer 225 có 1 cấu trúc kẹp tóc, 4 cấu trúc homo dimer. - Primer 226 có 1 cấu trúc kẹp tóc, 8 cấu trúc homo dimer. - Hai primer có 7 cấu trúc hetero dimer (Phụ lục 1) Trong đó, các cấu trúc có năng lượng tự do Delta G thấp nhất là: Bảng 4.2: Các cấu trúc thứ cấp mang năng lượng tự do thấp nhất Cấu trúc thứ cấp Delta G (kcal/mol) Kẹp tóc Homo dimer (Primer 225) Homo dimer (Primer 226) Hetero dimer 5' CGCACAAA || ::C 3' CTAACGAACTT 5' ACAGGAAGGACAACACTCAC || : : :: 3' CACTCACAACAGGAAGGACA 5' CGCACAAACTTCAAGCAATC ||| ::: 3' CTAACGAACTTCAAACACGC 5' ACAGGAAGGACAACACTCAC : |||| 3' CTAACGAACTTCAAACACGC - 0,21 - 1,6 - 3,54 - 5,12 Tất cả các cấu trúc thứ cấp kể trên đều có năng lượng tự do lớn hơn -9 kcal/mole nên sẽ không gây ảnh hưởng gì đáng kể đến hoạt động của cặp primer 225, 226 trong phản ứng RT-PCR. Sau đó, cặp primer 225, 226 được kiểm tra độ đặc hiệu cho PMWaV-1 bằng công cụ BLAST của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ). Chương trình này dò tìm trên cơ sở dữ liệu của các ngân hàng gene để tìm ra tất cả các gene có trình tự tương đồng với cặp primer này. Kết quả BLAST cho thấy có 3 đoạn gene có vị trí tương đồng với cặp primer 225, 226 45 Bảng 4.3: Kết quả phân tích BLAST của 2 primer 225, 226 Số Nu tương đồng STT Tên trình tự Primer 225 Primer 226 1 gi|18253957|gb|AF414119.1|AF414119 Pineapple mealybug wilt associated virus-1, complete cds 20/20 20/20 2 gi|22227|emb|X63205.1|ZMCAB48 Zea mays cab48 gene for chlorophyll a/b binding protein precurso 18/20 3 gi|62630081|gb|AC122311.6| Mus musculus BAC clone RP23-298B23 from chromosome 6, complete sequence 18/20 Chú thích: : không có vị trí tương đồng. Trong đó, hai trình tự 2 và 3 chỉ có vị trí tương đồng với 1 trong 2 primer, chỉ duy nhất trình tự 1, PMWaV-1, là có 2 vị trí tương đồng hoàn toàn với cặp primer 225, 226 nằm trên đoạn gene mã hóa cho HSP 70 (Phụ lục 2). Như vậy, về mặt lý thuyết, cặp primer 225, 226 hoàn toàn đặc hiệu và phù hợp cho phản ứng RT-PCR phát hiện PMWaV-1. 4.2.2 Kết quả xác định chu trình nhiệt tối ưu Ở bước đầu thực hiện phản ứng RT-PCR, chúng tôi đã thực hiện quy trình RT-PCR theo Sether và cộng sự, (2001) (chu trình 2). Tuy nhiên, trong quá trình thí nghiệm, có lẽ do không phù hợp với hóa chất của bộ kit Access RT-PCR System (Promega) mà chúng tôi sử dụng nên quy trình này cho hiệu quả khuếch đại không như mong đợi. Vì vậy, chúng tôi khảo sát lại trên 5 quy trình RT-PCR như đã trình bày ở phần phương pháp thực hiện. 5 chu trình trên được khảo sát với cùng 1 mẫu RNA ly trích từ cây bệnh và cho kết quả sau: 46 Hình 4.2: Sản phẩm RT-PCR của 5 chu trình nhiệt Chú thích: L: ladder Giếng 1, 2, 3, 4, 5: lần lượt là sản phẩm RT-PCR của các chu trình nhiệt 1, 2, 3, 4, 5. Kết quả trên cho thấy chu trình nhiệt của Sether (chu trình 2) đã khuếch đại được đoạn gene mong muốn 589 bp. Tuy nhiên, hiệu quả khuếch đại của chu trình này không cao, phản ứng chủ yếu xảy ra sự bắt cặp không chuyên biệt nên kết quả điện di cho thấy cường độ sáng của vạch sản phẩm phụ rất lớn, trong khi vạch sản phẩm chính lại khá mờ. Sự thay đổi nhiệt độ bắt cặp của chu trình 2 cũng không cho kết quả tốt hơn. Ở chu trình 1, nhiệt độ bắt cặp quá thấp nên không xảy ra sự bắt cặp chuyên biệt, phản ứng chỉ tạo sản phẩm phụ. Ở chu trình 3, nhiệt độ bắt cặp cao hơn giúp ít xảy ra sự bắt cặp không chuyên biệt nên lượng sản phẩm phụ ít đi. Tuy nhiên, với nhiệt độ này, phản ứng RT-PCR xảy ra khó khăn hơn và tạo ra lượng sản phẩm chính ít hơn chu trình 2. Với chu trình 4, nhiệt độ bắt cặp 58 o C là quá cao cho cặp primer 225, 226 nên sự khuếch đại chuyên biệt hầu như không xảy ra. 589 bp L 1 2 5 3 4 500 bp 1.500 b p 47 Trong 5 chu trình, chu trình 5 cho sự khuếch đại đặc hiệu cao nhất, vạch sản phẩm phụ mờ, còn vạch sản phẩm chính rất sáng và rõ nét. Chu trình này được xây dựng dựa trên phương pháp Touchdow PCR của Don và ctv (1991) (trích dẫn bởi McPherson M.J. và Moller S.G., 2000). Phương pháp này rất hữu hiệu cho các phản ứng PCR có lượng bản sao ban đầu của mẫu thấp. Trong đó, 10 chu kỳ đầu được thiết lập với nhiệt độ bắt cặp cao (58 o C), giúp tăng sự chuyên biệt của phản ứng, nhân bản chính xác đoạn DNA mong muốn. Khi lượng bản sao mục tiêu đã tăng lên đến mức cần thiết, các chu kỳ sau được thiết lập với một điều kiện thuận lợi hơn (bắt cặp ở 54 o C), giúp phản ứng khuếch đại xảy ra dễ dàng hơn. Như vậy, kết quả trên cho thấy chu trình 5 là chu trình thích hợp nhất cho phản ứng RT-PCR phát hiện PMWaV-1 với các hóa chất mà chúng tôi sử dụng. 4.2.3 Kết quả khảo sát nồng độ primer thích hợp Sau khi đã xác định được yếu tố chính của phản ứng RT-PCR là quy trình nhiệt, chúng tôi tiến hành xác định các yếu tố khác để tối ưu hóa phản ứng RT-PCR. Tỷ lệ primer – RNA mẫu ảnh hưởng rất lớn đối với phản ứng RT-PCR, vì vậy, cần phải xác định tỷ lệ primer – RNA thích hợp để thu được kết quả tối ưu. Đối với quy trình đang thiết lập, việc xác định nồng độ RNA sau khi ly trích rất khó thu được kết quả chính xác nên chúng tôi chỉ thay đổi nồng độ primer để làm thay đổi tỷ lệ primer – RNA. Có 3 nồng độ primer được chọn khảo sát là 1 mM, 0,8 mM và 0,6 mM. Các sản phẩm đều được thực hiện với RNA trên cùng một mẫu bệnh và cho kết quả điện di sản phẩm RT-PCR như sau: 48 Hình 4.3: Kết quả khảo sát nồng độ primer thích hợp Chú thích: L: Ladder (-) : Đối chứng âm Giếng 1: sản phẩm RT-PCR với nồng độ primer 1 mM Giếng 2: sản phẩm RT-PCR với nồng độ primer 0,8 mM Giếng 3: sản phẩm RT-PCR với nồng độ primer 0,6 mM Kết quả điện di trên cho thấy, với 2 nồng độ primer 1 mM và 0,8 mM phản ứng RT-PCR đều cho vạch sản phẩm chính sáng và rõ nét, nhưng nồng độ 0,8 mM cho lượng sản phẩm phụ ít hơn. Còn ở nồng độ 0,6 mM, lượng primer quá ít nên phản ứng cho hiệu quả khuếch đại thấp. Như vậy, nồng độ primer 0,8 mM chính là nồng độ thích hợp nhất. 4.2.4 Kết quả khảo sát số chu kỳ tối ưu cho phản ứng RT-PCR . Vì số lượng bản sao RNA của virus trong RNA thực vật rất thấp nên số chu kỳ cho một phản ứng RT-PCR thông thường là 40 – 45 chu kỳ. Do đó, chúng tôi đã tiến hành khảo sát trên 5 mức 41, 42, 43, 44 và 45 chu kỳ để tìm số chu kỳ thích hợp nhất. Kết quả của thí nghiệm này cho thấy như sau: 500 bp L (-) 1 2 3 589 bp 49 Hình 4.4: Kết quả khảo sát số chu kỳ RT-PCR thích hợp Chú thích: L: Ladder Giếng 1: sản phẩm RT-PCR với 41 chu kỳ Giếng 2: sản phẩm RT-PCR với 42 chu kỳ Giếng 3: sản phẩm RT-PCR với 43 chu kỳ Giếng 4: sản phẩm RT-PCR với 44 chu kỳ Giếng 5: sản phẩm RT-PCR với 45 chu kỳ Kết quả điện di ở hình 4.4 cho thấy tất cả 5 chu kỳ được khảo sát đều cho kết quả đặc hiệu, thu được vạch sản phẩm mong muốn 589 bp. Các phản ứng có số chu kỳ ít cho sản phẩm chính hơi mờ. Còn ở các phản ứng có số chu kỳ cao, tuy vạch sản phẩm chính rõ hơn nhưng lượng sản phẩm phụ cũng được khuếch đại lên theo. Như vậy, tính đặc hiệu của các phản ứng khuếch đại không tăng lên. Tuy nhiên, quy trình RT-PCR trên được xây dựng với mục đích phát hiện PMWaV-1 trên những mẫu chồi với lượng bản sao RNA virus ban đầu rất thấp nên chúng tôi quyết định chấp nhận lượng sản phẩm phụ cao để tăng độ nhạy cho phản ứng. Vì vậy, mức 45 chu kỳ được chọn là mức thích hợp nhất cho phản ứng RT-PCR. L 1 2 3 4 5 589 bp 500 bp 50 Trong suốt quá trình xây dựng quy trình RT-PCR trên, ngoài vạch sản phẩm chính 589 bp, còn xuất hiện thêm 1 vệt sản phẩm phụ kích thước khoảng 100 bp. Bên cạnh đó, ở các phản ứng đối chứng âm (giếng (-), hình 4.3) không thấy có sản phẩm khuếch đại, chứng tỏ trong quá trình thao tác không xảy ra sự ngoại nhiễm. Như vậy, chúng tôi tạm lý giải điều này là do các nguyên nhân sau: - Primer dư tạo thành các dimer. - Hỗn hợp phản ứng RT-PCR thừa các sản phẩm Mg 2+ , dNTP, RNA mẫu. - Trên RNA của cây dứa (thu được chung với của PMWaV-1 trong quá trình ly trích RNA tổng số) có những đoạn trình tự cũng gần như bổ sung với cặp primer 225, 226 nên trong phản ứng, ngoài đoạn HSP 70 của PMWaV-1 thì đoạn trình tự này cũng được nhân bản. Tuy nhiên, trên GenBank không có dữ liệu về trình tự các đoạn RNA của cây dứa nên chúng tôi không thể kiểm tra lại giả thuyết này. Việc khử các vạch sản phẩm không chuyên biệt trên đòi hỏi phải mất khá nhiều thời gian và hóa chất nên trong khuôn khổ hạn hẹp của đề tài, chúng tôi chưa thực hiện được việc này. Tuy nhiên, lượng sản phẩm phụ đã được làm giảm đi nhiều, còn sản phẩm chính đã đạt được mức khuếch đại cần thiết để có thể đánh giá chính xác sự hiện diện của PMWaV-1. Như vậy, có thể kết luận quy trình RT-PCR được xây dựng hoàn toàn đủ độ tin cậy trong việc phát hiện PMWaV-1. Hình 4.5: Sơ đồ phản ứng RT-PCR phát hiện PMWaV-1 . PMWaV-1. Như vậy, có thể kết luận quy trình RT-PCR được xây dựng hoàn toàn đủ độ tin cậy trong việc phát hiện PMWaV-1. Hình 4. 5: Sơ đồ phản ứng RT-PCR phát hiện PMWaV-1 . mức 45 chu kỳ được chọn là mức thích hợp nhất cho phản ứng RT-PCR. L 1 2 3 4 5 58 9 bp 50 0 bp 50 Trong suốt quá trình xây dựng quy trình RT-PCR trên, ngoài vạch sản phẩm chính 58 9. tăng lên. Tuy nhiên, quy trình RT-PCR trên được xây dựng với mục đích phát hiện PMWaV-1 trên những mẫu chồi với lượng bản sao RNA virus ban đầu rất thấp nên chúng tôi quy t định chấp nhận