43 4.3. Cô lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa Lấy 500 g mẫu khô, chiết với hệ Soxhlet trong 48 giờ với EtOH 70 %, sau đó lọc, dịch lọc được cô cạn dưới áp suất thấp còn 1lít, thêm một1 lít nước cất vào dịch lọc. 4.3.1. Điều chế các loại cao 4.3.1.1. Điều chế cao ete dầu hỏa Cho 1500 ml dung môi ete dầu hỏa vào 2 lít dung dịch mẫu thu được ở trên (chia thành 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều. Lúc này dung dịch trong bình gạn sẽ chia thành 2 lớp, thu phần dịch ở trên, làm khan với Na 2 SO 4 , cô cạn dưới áp suất thấp thu được cao ete dầu hỏa 5,6 g. 4.3.1.2. Điều chế cao CHCl 3 Phần dịch nước còn lại sau khi đã trích với ete dầu hỏa, cho 1500 ml dung môi CHCl 3 vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên dưới, làm khan với Na 2 SO 4 và cô cạn dưới áp suất thấp thu được cao CHCl 3 9,8 g. 4.3.1.3. Điều chế cao n-butanol Phần dịch còn lại sau khi đã trích với CHCl 3 , được tiếp tục cho 1500 ml n- butanol vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên trên, làm khan với Na 2 SO 4 , cô cạn dung dịch dưới áp suất thấp thu được cao n-Butanol 15,2 g. 4.3.1.4. Điều chế cao nƣớc Phần nước còn lại tiến hành cô cạn dưới áp suất thấp thu được cao H 2 O 25,7 g. Hiệu suất chiết suất của các loại dung môi được tính theo công thức: H = 500 A x 100 % Trong đó: - H : hiệu suất chiết suất. - A : Khối lượng cao thu được. - 500 : khối lượng mẫu ban đầu. Bảng 4.2: Hiệu suất chiết suất của các loại dung môi Loại dung môi Khối lượng cao thu được (g) Hiệu suất (%) Ete dầu hỏa 5,6 1,12 Chloroform 9,8 1,98 n-butanol 15,2 3,04 Nước 25,7 5,14 44 0 1 2 3 4 5 6 Ete dầu hỏa Chloroform n-butanol Nước % Biểu đồ 4.1: Hiệu suất chiết suất của các loại dung môi 4.3.2. Cô lập một số hợp chất từ cao ete dầu hỏa Cao ete dầu hỏa sau khi thu được, lấy 3 g để tiến hành chạy sắc ký cột, chất hấp phụ là silicagel, dung môi giải ly là hỗn hợp ete dầu hỏa và EtOAc với độ phân cực tăng dần. Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa cho 15 phân đoạn Ở phân đoạn 9 với dung môi giải ly Ete dầu : EtOAc 92 : 8 và phân đoạn 10 với dung môi giải ly E : EtOAc 90 : 10 sau khi cô cạn cho cặn màu vàng nhạt (0,235 g). Sắc ký lớp mỏng silicagel trên cặn này với hệ dung ly là CHCl 3 : E 9 : 1, thuốc thử hiện vết là H 2 SO 4 10 %/EtOH cho hai vết màu nâu đen, một vết đậm R f = 0,23 và một vệt mờ R f = 0,17. Kết quả sắc ký cột silicagel trên 3g cao ete dầu hỏa được tóm tắt ở bảng 4.3 Hiệu suất chiết suất (%) Ete dầu hỏa Chloroform n-butanol Nước 1,12 5,14 3,04 1,98 45 Bảng 4.3 : Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa (3g) Phân đoạn Dung ly Thể tích (ml) Trọng lượng cặn (mg) Sắc ký lớp mỏng Ghi chú 1 E(100%) 100 2 E:EtOAc 99:1 200 75 Vệt dài 3 E:EtOAc 98:2 200 86 Vệt dài 4 E:EtOAc 97:3 200 98 Vệt dài 5 E:EtOAc 96:4 200 112 Nhiều vết 6 E:EtOAc 95:5 200 153 Nhiều vết 7 E:EtOAc 94:6 200 256 Nhiều vết 8 E:EtOAc 93:7 200 190 Nhiều vết 9 E:EtOAc 92:8 400 116 2vết,R f =0,23;R f =0,17 Khảo sát 10 E:EtOAc 90:10 400 119 2vết,R f =0,23;R f =0,17 Khảo sát 11 E:EtOAc 85:15 600 142 Nhiều vết 12 E:EtOAc 80:20 600 155 Nhiều vết 13 E:EtOAc 70:30 200 120 Nhiều vết 14 E:EtOAc 60:40 600 114 Nhiều vết 15 E:EtOAc 50:50 400 250 Nhiều vết Ghi chú: E = Ete dầu hỏa; EtOAc = ethylacetate; EtOH = ethyl alcol Ở phân đọan 9,10 tiếp tục quá trình sắc ký cột lần 2 với hệ dung môi giải ly E : EtOAc 90 : 10 tới 85 : 15 thu được 5 phân đọan sau khi cô cạn dung môi phân đoạn 2 và 3 và kết tinh lại trong MeOH cho tinh thể hình kim màu trắng (64mg) đặt tên S. Sắc ký lớp mỏng silicagel trên cặn này với hệ dung ly là CHCl 3 : E 9 : 1, thuốc thử hiện vết là H 2 SO 4 10 %/EtOH cho một vết màu nâu R f = 0,23. 46 Sơ đồ 4.1: Tóm tắt quá trình sắc ký cột 3 g cao ete dầu hỏa Hình 4.1: Sắc ký bản mỏng cao ete dầu và hợp chất S Cao ete dầu hỏa Hợp chất S Sắc ký cột silicagel E : EtOAc 90 : 10 → 85 : 15 Cao ete dầu hỏa (3 g) Sắc ký cột silicagel E : EtOAc 100 % → 50 : 50 Thu đđược 15 phân đoạn Phân đoạn 9, 10 (0,235 g) Thu được 5 phân đoạn 1 – 5 Bay hơi dung môi và rữa sạch phân đoạn 2 và 3, kết tinh thu được hợp chất sạch S (64 mg) 47 4.3.3. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất S * Sắc ký lớp mỏng: giải ly bằng hệ dung môi cloroform:ete dầu 9:1, thuốc thử hiện hình là acid sulfuric 10%/EtOH, sấy bản ở 110 0 C cho một vết duy nhất màu nâu có giá trị Rf = 0,23. * Nhiệt độ nóng chảy 154-156 0 C (MeOH). * Phổ khối lƣợng MS (Phụ lục số 1) m/z: 414 (M + ); 329; 255; 213; 161; 145; 105; 81; 69. * Phổ hồng ngoại IR (phụ lục số 2) ν, cm -1 :3452,45 (dao động O–H); 2906,52; 2783,90 (Dao động C–H bão hòa);1662,98 (dao động C = C); 12,82,94 (dao động C – O). * Phổ 1 H-NMR, CDCl 3 , δ, ppm (phụ lục số 3) 5,35 (d, 5Hz, – CH =); 5,14 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz; – CH =); 5,03 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz; – CH=); 3,52 (t, >CH – O –); 0,68 – 1,02 H của 6 nhóm –CH 3 . * Phổ 13 C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT, CDCl 3 , δ, ppm (phụ lục số 4) 140,77 (>C =); 138,32 (– CH =);129,31 (– CH =); 121,73 (– CH =); 71,83 (CH – O –) Biện luận cấu trúc S: S cho phản ứng dương tính với các thuốc thử đặc trưng của triterpen và steroid như Liebermann Burchard, Salkowski và Noller. Từ các tín hiệu trên phổ IR (3452,45cm -1 ); 1 H-NMR (3,52ppm); 13 C-NMR (71,83 ppm) chứng tỏ S có nhóm – OH. Phổ 13 C-NMR và 1 H-NMR cho thấy S có hai nối đôi, trong đó 1 liên kết kiểu >C=CH và liên kết còn lại kiểu – CH = CH – . Phổ 13 C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT cho biết S có 3 carbon bậc bốn (>C<), 11 carbon bậc 3 (>CH –), 9 carbon bậc hai (– CH 2 –) và 6 carbon bậc 1 (– CH 3 ), từ đó công thức phân tử của S là C 29 H 48 O, điều này được khẳng định lại dựa trên phổ khối lượng (M + = 414). Độ bất bão hoà của S là 6, như vậy cấu trúc S có 4 vòng. Kết hợp với số nguyên tử carbon giúp ta khẳng định S là một hợp chất steroid. Phổ 1 H-NMR cho biết nối đôi – CH = CH – tồn tại dưới dạng trans (dựa vào các mũi cộng hưởng δ 5,13(dd, 8,5Hz; 14,5Hz) và δ 5,03 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz). Các nhận định ban đầu cho thấy S có thể là stigmasterol, khảo sát kỹ cường độ các mũi cộng hưởng tại các vị trí δ 5,35; δ 5,13 đến 5,03 và δ 3,52 cho thấy các giá trị tích phân gần bằng nhau, kết hợp với phổ 13 C- NMR (xuất hiện 42 tín hiệu cộng 48 hưởng) chúng tôi dự đoán S là hỗn hợp của stigmaterol và β-sitosterol với tỉ lệ 1:1, điều này dựa vào phổ 1 H NMR của các vị trí 5,35; 5,13; 5,03. Các số liệu phổ 13 C-NMR và DEPT của S được so sánh với các phổ tương ứng của stigmasterol và β-sitosterol. Kết quả so sánh phổ 13 C-NMR của hợp chất S với stigmasterol và β-sitosterol (phụ lục 5) cho thấy sự trùng khớp ở các vị trí của cả hai hợp chất. Như vậy S là hỗn hợp của stigmasterol và β-sitosterol. β-Sitosterol Stigmasterol Hình 4.2: Cấu trúc hóa học của β-Sitosterol và Stigmasterol 4.4. Thử nghiệm vi sinh Hai ống nghiệm thử dung môi vi khuẩn mọc làm đục môi trường, có tạo váng màu trắng trên bề mặt và có cặn trắng bên dưới ống nghiệm. Kết luận dung môi DMSO không ức chế sự phát triển của hai chủng vi khuẩn E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium ở tỉ lệ 0,06 ml/ 2 ml môi trường Đối với các loại cao ete dầu hỏa, cao n-butanol và cao nước các ống nghiệm thử nghiệm ở các nồng độ từ 100 đến 600μg/ml vi khuẩn làm đục môi trường có lắng cặn trắng ở dưới đáy. Kết luận: Cao ete dầu hỏa, cao n-butanol và cao nước không có khả năng ức chế hai chủng vi khuẩn E. coli và Salmonella tới nồng độ 600 μg/ml Đối với cao chloroform, với các nồng độ 400 – 600 μg/ml quan sát thấy môi trường không bị đục. HO CH 3 C 2 H 5 H CH 3 H 3 C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28, 29 H 5 C 2 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 H 3 C HO H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28,29 49 Bảng 4.4: Kết quả thử nghiệm các loại cao trong khoảng nồng độ 100-600 μg/ml Loại cao Ete dầu hỏa CHCl 3 n-butanol H 2 O Nồng dộ (μg/ml) E.coli Sal E.coli Sal E.coli Sal E.coli Sal 100 + + + + + + + + 200 + + + + + + + + 300 + + + + + + + + 400 + + – – + + + + 500 + + – – + + + + 600 + + – – + + + + Ghi chú: +:Môi trường bị đục –: Môi trường không bị đục. Tiến hành thử nghiệm tiếp tục ở các nồng độ với khoảng cách nhỏ hơn trong khoảng từ 300 – 400 μg/ml. Hình 4.3: Các ống nghiệm nồng độ trong khoảng 300 - 400 μg/ml trước khi đem ủ. Sau khi ủ, ở nồng độ 330 μg/ml E. coli không làm đục môi trường nuôi cấy. Còn đối với Salmnella thì không làm đục môi trường ở nồng độ 340 μg/ml. 310 320 330 340 350 360 370 380 390 (μ g/ml). 50 Bảng 4.5: Kết quả thử nghiệm cao chloroform trong khoảng nồng độ 300-400 μg/ml Nồng độ (μg/ml) E. coli Salmonella 310 + + 320 + + 330 – + 340 – – 350 – – 360 – – 370 – – 380 – – 390 – – Ghi chú: +: Môi trường nuôi cấy bị đục –: Môi trường nuôi cấy không bị đục Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm trên E. coli. Hình 4.5: Kết quả thử nghiệm trên Salmonella Bảng 4.6: Kết luận Vi khuẩn MIC (μg/ml) E. coli ATCC 25922 330 Salmonella typhimurium 340 310 320 330 340 350 360 370 380 390 (μ g/ml). 310 320 330 340 350 360 370 380 390 (μ g/ml) 51 Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. Kết luận 5.1. Khảo sát thành phần hóa học Đã sơ bộ phân tích thành phần hóa học các hợp chất có trong lá Xuân Hoa. Đã xác định được sự hiện diện của các cấu tử hữu cơ: flavonoid, tanin, terpenoid, saponin Từ 500g bột lá khô cây Xuân Hoa đã điều chế được cao ete dầu hỏa là 5,6g (hiệu suất 1,12%), cao chloroform 9,8g (hiệu suất 1,98%), cao n-butanol 15,2g (hiệu suất 3,04%) và cao nước 25,7g (hiệu suất 5,14%). Từ cao ete dầu hỏa đã tiến hành phân lập và thu được 64 mg hợp chất S (hiệu suất 2,13 % tính trên trọng lượng cao ete dầu hỏa). Cấu trúc của hợp chất được xác định dựa trên các phương pháp phổ nghiệm như khối phổ, phổ hồng ngoại, phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT. Hợp chấy S được nhận danh là hỗn hợp của Stigmasterol và β-sitosterol tỉ lệ 1 : 1. 5.2. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn trên hai đối tượng vi sinh là E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium với 4 loại cao: ete dầu hỏa, chloroform, n- butanol và cao nước. Kết quả cho thấy chỉ có cao chloroform có khả năng ức chế sự phát triển của hai chủng vi sinh vật trên. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chloroform đối với hai chủng vi sinh vật lần lượt: E. coli ATCC 25922 là 330 μg/ml và Salmonella typhimurium là 340 μg/ml. II. Đề nghị Trong khoảng thời gian ngắn làm khóa luận tốt nghiệp những kết quả thu được chỉ là những kết quả bước đầu. Nếu có thời gian, xin đề nghị tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để có thể tìm hiểu thêm về tác dụng sinh học và thành phần hóa học của cây Xuân Hoa. Đặt biệt là phân lập, xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ trên cao chloroform và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên một số dòng vi khuẩn đường ruột khác. Từ đó làm cơ sở cho việc chuẩn hóa và tạo ra chế phẩm có khả năng thay thế kháng sinh trong điều trị các bệnh nhiểm khuẩn đường tiêu hóa. . 51 Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. Kết luận 5.1. Khảo sát thành phần hóa học Đã sơ bộ phân tích thành phần hóa học các hợp chất có trong lá Xuân Hoa. Đã xác định được sự hiện diện của các. 8 E:EtOAc 9 3 :7 200 190 Nhiều vết 9 E:EtOAc 9 2:8 400 116 2vết,R f =0,23;R f =0, 17 Khảo sát 10 E:EtOAc 9 0:1 0 400 119 2vết,R f =0,23;R f =0, 17 Khảo sát 11 E:EtOAc 8 5:1 5 600. dụng sinh học và thành phần hóa học của cây Xuân Hoa. Đặt biệt là phân lập, xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ trên cao chloroform và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên một số dòng