80 Kết quả được thể hiện trên máy tính, nhờ đó chúng ta có thể xác định được chính xác kích thước của al, loại trừ những băng lặp lại (stuter DNA) hoặc thêm một nucleotide A,… 2.5.6.Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng primer PCR Cách phổ biến nhất để phát hiện microsatellite là thiết kế primer PCR đặc trưng cho một locus trong genome. Vì vậy 1 cặp primer PCR có thể áp dụng cho mọi cá thể trong loài, và cho những sản phẩm khuếch đại có kích thước khác nhau phụ thuộc vào chiều dài khác nhau của trình tự microsatellite. Hình 2.6 : Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số. Hai primer PCR (2 mũi tên màu xám) được thiết kế nằm ở vùng bảo toàn nằm 2 bên trình tự microsatellite. Nếu không có đoạn lặp lại nào, sản phẩm PCR sẽ có chiều dài là 100bp. Vì vậy, dựa vào kích thước của sản phẩm PCR chúng ta có thể tính được số lần lặp lại của dinucleotide “CA” trong mỗi trình tự microsatellite (như trong ví dụ này “CA” có 8 lần lặp lại với chiều dài sản phẩm PCR là 116bp). Primer microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi al) đối với từng cá thể trong loài. Điều này có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng flanking- vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế primer- được bảo tồn trong quá trình di truyền của loài. Vùng flanking rất quan trọng vì nó giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể. 81 Hình 2.7 : Vùng flanking ở 2 bên trình tự microsatellite. Sản phẩm PCR sau đó được phân tích bằng điện di trên gel hoặc trên capillary, bằng cách nào thì chúng ta cũng xác định được kích thước của sản phẩm PCR đồng thời đếm được số lần lặp lại của các nucleotide trên mỗi al. Thông thường sản phẩm PCR có 2 band, 1 band chính và 1 band phụ nhỏ hơn band chính 2bp (Murray và ctv., 1993). Sự xuất hiện của band phụ là do quá trình trượt lỗi của DNA polymerase (Tautz,1989), band phụ có thể gây trở ngại cho việc xác định kích thước chính xác của band chính, nhưng band phụ cũng có thể được xem như 1 dấu hiệu để nhận biết sản phẩm khuếch đại đúng là microsatellite. Hình 2.8 :Dữ liệu microsatellite phân tích bằng điện di trên gel với band chính màu đen và band phụ màu xám. MW: thang chuẩn để xác định kích thước sản phẩm PCR. 82 Hình 2.9 : Dữ liệu microsatellite phân tích tự động bằng điện di trên cappilary của máy giải trình tự DNA. Vị trí của các peak trên trục ngang tương ứng với kích thước của sản phẩm PCR và chiều cao của peak biểu thị tổng lượng sản phẩm PCR. Band chính tạo ra các peak cao hơn band phụ. MW: thang chuẩn để xác định kích thước sản phẩm PCR. 2.5.6.1.Khả năng chuyển đổi primer microsatellite giữa các loài Rất nhiều microsatellite được tìm thấy ở các vùng tương ứng ở cùng gen ở các loài khác nhau. Rất nhiều tài liệu đã công bố sự bảo tồn của microsatellite ở các bộ gene của các loài động vật có vú như ở trâu, bò, hươu, cừu, dê. Do đó có thể áp dụng kết quả nghiên cứu từ trâu sang bò hay các loài khác và ngược lại. Khả năng sử dụng cùng loại primer microsatellite giữa các loài khác nhau phụ thuộc vào sự di truyền ổn định của trình tự microsatellite và mức độ bảo tồn (hay giống nhau) của vùng flanking (nằm ở 2 bên trình tự microsatellite) trong quá trình tiến hóa của loài. Khả năng chuyển đổi primer microsatellite giữa các loài khác nhau sẽ làm tăng giá trị của những primer đó, tuy nhiên số loài có khả năng chuyển đổi primer microsatellite cũng rất giới hạn (Roder và ctv., 1995). Khi áp dụng những cặp primer microsatellite của loài này cho loài khác, chu trình PCR thường phải được biến đổi để thu được kết quả tốt. Thông thường nhiệt độ bắt cặp sẽ giảm xuống từ 2-5 o C tùy theo mức độ xa hay gần trong quan hệ tiến hóa của những loài đó. Dayanadan và ctv.(1997) đã phát hiện ra rằng những 83 primer có số lượng GC cao sẽ dễ áp dụng từ loài này sang loài khác mà không cần biến đổi chu trình PCR và ngược lại. 2.5.6.2.Thiết kế primer microsatellite Nếu chúng ta muốn áp dụng phương pháp microsatellite để nghiên cứu di truyền ở một loài nào đó thì trước tiên hãy thử áp dụng phân tích với primer microsatellite của những loài có quan hệ di truyền gần gũi với loài đó. Trong trường hợp không tìm được primer microsatellite của những loài thân thuộc, chúng ta có thể tự thiết kế primer microsatellite, bằng các bước sau: 1- Ly trích để thu DNA tổng số. 2- Phân cắt toàn bộ genome thành những đoạn DNA có kích thước trung bình từ 300-600bp bằng enzyme cắt giới hạn. 3- Chèn những đoạn DNA được cắt ở trên vào plasmid để tạo nhiều bản sao DNA, loại plasmid thường được sử dụng ở đây là PUC19 vì vị trí cắt của plasmid này đã được xác định rõ. 4- Chuyển các plasmid lên màng nylon. 5- Dùng các probe để lai với màng, probe là những oligonucleotide chứa trình tự microsatellite quan tâm (VD: (AC) 10 ), và đã được đánh dấu phóng xạ hoặc huỳnh quang. 6- Phát hiện và nuôi cấy những dòng vi khuẩn chứa plasmid cho kết quả dương tính khi lai với probe. 7- Dùng enzyme cắt giới hạn để thu lại các đoạn DNA được chèn trong plasmid, tiến hành phân tích các đoạn DNA này trên agarose gel 1%. 8- Dùng phương pháp lai Southern với các probe như trên để phát hiện lại một lần nữa các đoạn DNA chứa trình tự microsatellite quan tâm. 9- Đem giải trình tự và xác định microsatellite cũng như trình tự vùng flanking nằm ở 2 bên trình tự microsatellite, đây là vùng để thiết kế primer. 10- Chọn ra những trình tự microsatellite phù hợp nhất để thiết kế primer (thông thường phải có ít nhất 8 lần lặp lại) tùy theo mục đích nghiên cứu. 11- Tổng hợp cặp primer đặc hiệu cho từng locus, thông thường từ 20-30 bp nằm trong vùng flanking và không được nằm ngay sát với trình tự microsatellite. Primer forward được đánh dấu huỳnh quang, và màu huỳnh quang của sản phẩm khuếch đại bởi primer sẽ được phát hiện bằng tia laser khi đưa vào phân tích trình 84 tự. 2.5.7.Ưu, khuyết điểm của phương pháp microsatellite so với các phương pháp khác - Phương pháp microsatellite hiệu quả hơn phương pháp RFLP ở chỗ đòi hỏi lượng DNA phân tích ít hơn, mức độ đa hình cao hơn và thêm vào đó là khả năng phân tích tự động bằng máy giải trình tự. - Primer microsatellite có thể được trao đổi dễ dàng giữa các nhà nghiên cứu vì mỗi locus có mang trình tự microsatellite đều được phát hiện bởi những cặp primer thích hợp. Primer microsatellite cũng dễ áp dụng từ loài này sang loài khác hơn phương pháp AFLP. - Phương pháp microsatellite cho kết quả phân tích tính đa hình chính xác hơn, với mức độ đa hình cao gấp 7 lần so với phương pháp RAPD (Kraic và ctv., 1998). - Hiện nay, microsatellite là công cụ chủ yếu và đang thay thế phương pháp RFLP trong nghiên cứu lập bản đồ di truyền ở thực vật. Ngoài ra, sự kết hợp giữa phương pháp microsatellite và phương pháp AFLP sẽ giúp cho việc xây dựng bản đồ di truyền một cách chi tiết. - Đặc tính đồng trội (co-dominant) của microsatellite là một ưu điểm trong nghiên cứu lập bản đồ di truyền, trong khi RAPD và AFLP không có đặc tính này. - Powell và ctv., (1996) đã tiến hành thí nghiệm kiểm tra hiệu quả của các loại marker di truyền RFLP, RAPD, AFLP và Microsatellite trong phân tích di truyền trên cây đậu tương thông qua 2 chỉ tiêu: phân tích mức độ dị hợp và tỉ số multiplex (số loci phân tích được trong một lần thí nghiệm). Kết quả là marker microsatellite phân tích được mức độ dị hợp cao nhất (0.60), và marker AFLP cho tỉ số multiplex cao nhất. - Hạn chế của phương pháp microsatellite là không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau, điều này là do microsatellite có tỉ lệ đột biến quá cao dẫn đến 2 trở ngại. Thứ nhất, trình tự vùng flanking ở 2 bên vùng microsatellite thường khác nhau giữa các loài do đột biến, vì vậy khó có thể áp dụng primer microsatellite của loài này cho loài khác. 85 Thứ hai, do tỉ lệ đột biến cao nên khi 2 loài có cùng kết quả phân tích với 1 trình tự microsatellite, ví dụ như AC 19 , chúng ta cũng không thể kết luận rằng 2 loài đó có cùng nguồn gốc tổ tiên ban đầu, vì có thể 1 loài phân ly từ tổ tiên của chúng là AC 18 rồi đột biến thành AC 19 , còn 1 loài phân ly từ tổ tiên của chúng là AC 20 rồi đột biến thành AC 19. 2.5.8.Ứng dụng của microsatellite Microsatellite được phát hiện và mô tả lần đầu ở người (Litt và Luty, 1989; Weber và May, 1989). Những phát hiện tương tự nhanh chóng được tìm thấy ở các loài động vật có vú như: chuột (Love và ctv.,1990), heo (Johansson và ctv., 1992) và gia súc (Kemp và ctv., 1993). Việc ứng dụng microsatellite trong nghiên cứu di truyền ở cây trồng mới được thực hiện trong khoảng thời gian gần đây nhưng kết quả ứng dụng rất thành công do mức độ đa hình phát hiện bởi microsatellite cao hơn bất kỳ marker phân tử nào khác (Saghai Maroof và ctv.,1994; Powell và ctv., 1996). Do đó, microsatellite là một công cụ rất đắc lực trong nghiên cứu đa dạng di truyền của cây trồng ( Yang và ctv., 1994; Xiao và ctv., 1996). Những cây trồng được nghiên cứu dựa trên microsatellite gần đây nhất bao gồm: gạo (Wu và Tanksley,1993), lúa mì (Saghai Maroof và ctv.,1994), lúa mạch (Roder và ctv.,1995), thông (Karhu và ctv., 2000) và cacao (Juan Carlos Motamayor và ctv., 2002). Người ta nghiên cứu được rằng tần số xuất hiện của những vùng microsatellite ở thực vật thấp hơn động vật từ 5 đến 10 lần (Lagercrantz và ctv., 1993; Powell và ctv., 1996). Mặc dù tần số microsatellite trên DNA tế bào thực vật thấp hơn động vật (Wang và ctv., 1994) nhưng các trình tự microsatellite có trong DNA lục lạp là nguồn marker rất hữu ích trong nghiên cứu tính đa hình, được áp dụng để phân loại 13 dòng Glycine (Powell và ctv., 1995). Những marker microsatellite trong lục lạp được đánh giá là công cụ đắc lực trong nghiên cứu sự phát sinh giống, loài và phân loại theo nguồn gốc địa lý (Doyle và ctv., 1998). Microsatellite cũng được phát hiện trong DNA của ti thể và đã được áp dụng nghiên cứu chuyển đổi giữa 15 loài (Soranzo và ctv., 1999). Nhờ những tính chất của một marker, microsatellite được áp dụng trong nhiều lĩnh vực như: lập bản đồ gen, nghiên cứu những gen liên quan đến bệnh di 86 truyền, giám định pháp y, phân tích để tìm ra bố mẹ, xác định phả hệ, xác định cấu trúc quần thể, đặc biệt là áp dụng trong việc xác định cấu trúc và liên kết giữa các cá thể, cấu trúc quần thể của các loài có nguy cơ bị thu hẹp hoặc phát triển, xác định mức độ đồng huyết của quần thể, xác định các vị trí liên quan đến tính trạng số lượng (QTL)…Các thông tin về microsatellite đa al của một locus cũng như trên nhiều locus có thể được phân tích bằng các phương pháp thống kê để đưa ra nhiều thông tin bổ ích về cấu trúc quần thể, phả hệ, các gen liên quan đến năng suất và chất lượng sản phẩm, gen chống bệnh,v.v. Người ta đã phát triển và sử dụng phương pháp xác định microsatellite trong việc đánh giá mức độ cận huyết của các cá thể và các quần thể, đồng thời áp dụng trong việc nghiên cứu cấu trúc quần thể. Trước tiên là việc đánh giá giá trị trung bình dị hợp tử cho mỗi cá thể thông qua dữ liệu microsatellite. Tiếp theo là việc xác định các kiểu đột biến của microsatellite. Nghiên cứu quá trình đột biến của microsatellite nhiều tác giả đã đưa ra phương pháp xác định mức độ thân cận của các quần thể. Khoảng cách về chiều dài của các al microsatellite chứa thông tin về khoảng cách di truyền giữa các quần thể, phản ánh thời gian từ khi 2 quần thể tách nhau ra. Những tính toán về khoảng cách di truyền giữa các quần thể có thể giúp chúng ta tính tương quan về thời gian kể từ khi 2 quần thể còn tồn tại là một. Khi 2 quần thể tách biệt nhau về mặt di truyền, 2 quá trình đột biến và phân ly dẫn đến tần số các al khác nhau rõ rệt. 2.6.Các công trình nghiên cứu có liên quan 2.6.1.Kiểm tra tính đồng nhất di truyền của Theobroma cacao L. bằng microsatellite marker Trong những nghiên cứu của tổ chức USDA về DNA cacao , người ta đã xác định được 15 cặp primer microsatellite: mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR40, mTcCbIR33, mTcCIR1, mTcCIR60, mTcCIR22, mTcCIR24, mTcCIR15, mTcCIR11, mTcCIR12, mTcCIR26, mTcCIR37, mTcCIR6, mTcCIR8 có hiệu quả trong việc nhận dạng di truyền các cá thể cacao thu nhận từ ngân hàng gen cacao Quốc tế ở Trinidad. 87 Lượng thông tin về tính đa hình thay đổi trong khoảng 0.42 đến 0.82 với giá trị trung bình là 0.67 trong số 15 loci. Tính dị hợp thay đổi trong khoảng từ 0.51 đến 0.79. Xác suất đồng nhất tích lũy của 15 loci thay đổi từ 7.87x10 -5 và 1.485x10 -9 , phụ thuộc vào nguồn gốc di truyền của quần thể. Kết quả này cho thấy xác suất phù hợp ngẫu nhiên giữa 2 kiểu gen thì không đáng kể. Vì vậy, sự phối hợp 15 cặp primer SSR trên đủ cho việc nhận diện các cá thể cacao. Sử dụng 15 cặp primer này người ta đánh giá được mức độ nhầm lẫn tên của 3 quần thể cacao thu nhận từ rừng mưa nhiệt đới Amazone vào thập niên 50. Kết quả cho thấy chỉ 2-3% tổng số cây bị đặt tên sai. Hơn nữa, người ta cũng xác minh lại nguồn gốc của những cây này bằng cách so sánh dữ liệu SSR của cây với những cây lân cận trong khu vực. Do vậy, SSR marker là phương pháp hiệu quả và tin cậy trong việc nhận diện cá thể cacao bằng đặc trưng phân tử. (Tham khảo tại: http://www.icg.rdg.ac.uk/public_html/ssr-helpfile.htm) 2.6.2.Nghiên cứu fingerprinting DNA cacao sử dụng microsatellite marker Tại Đại Học Penn State của Mỹ, các tác giả J-D Swanson, A.C.Lee và J.Guiltinan đã sử dụng 15 microsatellite primer trên (trong đó, 6 primer đầu tiên có nhiệt độ bắt cặp 51 o C, 9 primer còn lại có nhiệt độ bắt cặp 46 o C) trong nghiên cứu fingerprinting 8 giống cacao từ trung tâm nghiên cứu cacao ở Trinidad, bao gồm: PA30 T1, LX31, PA30 T10, GU114P, PA T5, GS4/4A, LCTEEN 68-1 và IMC47. DNA được ly trích bằng Quiagen DNeasy kit. Sản phẩm PCR được phân tích trên máy đọc trình tự tự động ABI 3100. Mỗi mẫu được lặp lại thí nghiệm 3 lần. Kết quả 11 primer cho kết quả khuếch đại tốt, chỉ 4 primer (mTcCIR40, mTcCIR33, mTcCIR12, mTcCIR6) không cho kết quả sau nhiều lần thí nghiệm. Kết quả phân tích fingerprinting cho dữ liệu nhị phân được trình bày trong bảng 2.1. (Tham khảo tại: USDA Cacao DNA Fingerprinting- Ring Test Results from Penn State Iniversity) Bảng 2.1: Kết quả phân tích fingerprinting Primer Kích thư ớcđoạn DNA (bp) 1 2 3 4 5 6 7 8 mTcCIR7 118-120 0 1 1 0 1 1 1 1 88 mTcCIR7 132-133 1* 1 0 0 0 0 1 0 mTcCIR7 134 1* 0 1 1 1 1 1 1 mTcCIR7 138-139 0 1 0 0 0 0 1* 0 mTcCIR7 143-144 0 1* 0 0 0 0 1* 0 mTcCIR7 153-155 1* 1 1 1 0 0 0 1 mTcCIR7 156-158 1 1 1 0 1 1 0 1 mTcCIR7 162-163 0 0 0 0 0 1 0 0 mTcCIR7 168 0 0 0 1* 0 0 0 0 mTcCIR7 190 1* 0 1 1* 1 1 0 0 mTcCIR37 144 1* 0 0 0 0 1* 0 1 mTcCIR37 159-160 1* 0 0 0 0 0 0 1* mTcCIR37 163 0 0 0 1 0 0 1 0 mTcCIR37 165 0 0 0 1* 0 0 1 1* mTcCIR60 190-191 0 0 1* 0 1 1 0 1* mTcCIR60 193 0 0 0 0 0 0 1 0 mTcCIR60 208-210 1 1 1 1* 1 1 0 1 mTcCIR60 211-213 1 1 1 1 0 0 1 1 mTcCIR60 221 0 1 0 1* 1* 1* 1* 1 mTcCIR1 127 0 0 1 1 0 0 0 0 mTcCIR1 129-131 1 1 1* 1 1 0 1 1* mTcCIR1 143 0 1* 0 1 1 1 1* 1* mTcCIR1 150 0 1 1 1 1 1* 1* 1* mTcCIR11 129-130 0 1 1* 0 0 0 0 0 mTcCIR11 141 0 1 1* 1* 0 1* 0 0 mTcCIR11 253-254 1 1* 1* 0 1 1 1 0 mTcCIR11 272 0 0 0 0 0 1* 0 0 mTcCIR11 288 0 0 0 0 1 0 0 0 mTcCIR11 298-300 0 0 1 1 0 1* 1* 0 mTcCIR11 308 1 1 0 0 0 0 0 1 mTcCIR11 314 0 1* 0 1 0 0 1 1 mTcCIR11 324 0 0 1* 0 1 1* 0 1 Primer Kích thư ớcđoạn DNA 1 2 3 4 5 6 7 8 mTcCIR18 320 0 1* 1* 0 0 0 0 0 mTcCIR18 330 0 0 1 0 0 0 0 0 89 mTcCIR18 332 0 0 0 0 1 1 0 0 mTcCIR18 334 0 0 1 0 1 0 0 0 mTcCIR18 342 1 1 0 1 0 0 1 1 mTcCIR18 344 1 1 0 1 0 0 1 1 mTcCIR18 354 0 0 0 0 0 1 0 0 mTcCIR22 120 1* 0 0 0 0 0 0 0 mTcCIR22 290 0 0 1 0 0 0 0 0 mTcCIR22 307-308 0 0 1 0 0 0 0 0 mTcCIR22 314 1* 1 0 0 1 1 1* 0 mTcCIR24 182 0 0 0 0 1* 0 0 0 mTcCIR8 239 0 1 0 0 0 1* 0 0 mTcCIR8 257-258 1* 1 0 0 0 0 0 1 mTcCIR8 264-266 1* 0 1 0 1 1 0 1 mTcCIR8 274-175 0 0 1 1 0 0 0 0 mTcCIR8 282-283 1 0 0 0 0 0 0 0 mTcCIR8 292 0 0 0 0 1 0 0 0 mTcCIR15 203 0 0 1 0 0 1 1* 0 mTcCIR15 221 0 0 1 0 0 0 1* 0 mTcCIR15 233 0 0 1 0 0 0 0 0 mTcCIR15 239 0 1 0 0 0 0 0 1 mTcCIR15 249-251 0 0 1 1 1* 0 1 1 mTcCIR15 284-285 1 0 0 0 0 0 0 0 mTcCIR15 300 1 0 0 0 0 0 0 0 mTcCIR26 292 0 0 0 1 0 0 0 0 mTcCIR26 294-296 0 1* 1 0 1* 1 mTcCIR26 301 1 1 0 0 0 1 1 1 mTcCIR26 303 0 0 1 0 0 0 0 0 Trong đó: 1: kết quả điện di có hiện diện một band. 0: kết quả điện di không có band nào. *: primer chỉ cho kết quả khuếch đại 2 trong 3 lần lặp lại thí nghiệm. Kí hiệu của 8 giống phân tích microsatellite theo thứ tự từ 1 đến 8: . các phương pháp khác - Phương pháp microsatellite hiệu quả hơn phương pháp RFLP ở chỗ đòi hỏi l ợng DNA phân tích ít hơn, mức độ đa hình cao hơn và thêm vào đó l khả năng phân tích tự động bằng. microsatellite và phương pháp AFLP sẽ giúp cho việc xây dựng bản đồ di truyền một cách chi tiết. - Đặc tính đồng trội (co-dominant) của microsatellite l một ưu điểm trong nghiên cứu l p bản đồ di. trong phân tích di truyền trên cây đậu tương thông qua 2 chỉ tiêu: phân tích mức độ dị hợp và tỉ số multiplex (số loci phân tích được trong một l n thí nghiệm). Kết quả l marker microsatellite