120 Phần 5 Kết luận và đề nghị  I.Kết luận Từ các kết quả thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: 1- Phương pháp và kỹ thuật định danh ổn định, có độ chính xác cao, đồng thời phù hợp với phương pháp phân tích microsatellite của Ngân hàng cacao thế giới ICGD, mở ra một triển vọng cho các ứng dụng tiếp theo của microsatellite. Lợi thế của phương pháp định danh trong đề tài là có thể áp dụng từ giai đoạn cây con còn đang được ươm trong nhà lưới, chưa có hoa hay quả để giúp cho việc nhận diện bằng kiểu hình, do vậy sẽ giúp loại bỏ kịp thời những cây con bị nhầm lẫn giống trước khi đem ra vườn trồng. 2- Xây dựng thành công dữ liệu microsatellite cho 21 dòng cacao bằng việc sử dụng 5 cặp primer được đánh dấu huỳnh quang là mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15 và mTcCIR18. Dữ liệu này sẽ giúp cho việc định danh nhanh (từ 3-5 ngày) và chính xác 21 dòng cacao khảo sát. 3- Tối ưu hóa phương pháp nhờ thực hiện thành công qui trình phản ứng multiplex PCR với 3 primer có cùng nhiệt độ bắt cặp 46 o C và được đánh dấu màu huỳnh quang khác nhau là: mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15. Do đó giúp tăng cao tính kinh tế nhờ giảm thời gian và chi phí thực hiện xuống ba lần. 4- Thiết lập được mối quan hệ di truyền giữa 21 dòng cacao khảo sát trên biểu đồ không gian 3 chiều, dựa vào kết quả phân tích microsatellite với 5 cặp primer có số al tương ứng như sau: mTcCIR7 có 3 loại al, mTcCIR8 có 8 loại al, mTcCIR11 có 8 loại al, mTcCIR15 có 8 loại al và mTcCIR18 có 7 loại al. Biểu đồ thể hiện rõ mối quan hệ di truyền gần hoặc xa giữa các quần thể và giữa các cá thể trong quần thể để hỗ trợ cho công tác lai tạo giống. 121 II.Đề nghị - Trong tương lai, triển khai áp dụng Microsatellite để phát hiện những tính trạng tốt trên cây cacao, đặc biệt là khả năng chịu hạn, chịu phèn, chịu mặn, phù hợp với điều kiện đất đai, khí hậu đặc trưng của một số vùng trồng cacao ở Việt Nam (như Tây Nguyên, đống bằng sông Cửu Long,…) - Tiếp tục áp dụng kỹ thuật microsatellite để lập hồ sơ kiểu gene cho các giống trong tập đoàn cacao của Đại Học Nông Lâm, phục vụ cho việc trao đổi dữ liệu, thông tin về đa dạng di truyền giữa các giống cacao tại Đại Học Nông Lâm với các giống cacao trên thế giới, đồng thời phục vụ cho công tác lai tạo giống. - Mỗi lần cài đặt lại bin set trong phần mềm Gene Mapper, kết quả có thể bị biến đổi, do đó cần phải kiểm tra lại các kết quả phân tích cũ trước khi muốn tiến hành so sánh với dữ liệu mới. - Trong quá trình lai tạo giống, nên chọn các cặp lai thuộc những quần thể có quan hệ di truyền xa nhau lai với nhau (như lai quần thể BR với quần thể QH hoặc BAL) để tăng ưu thế lai. Và ngược lại, không nên chọn lai những giống thuộc các quần thể có quan hệ di truyền gần nhau (như không nên lai quần thể QH với quần thể BAL). - Tương tự, khi lai tạo giống trong cùng một quần thể nên chọn những cá thể có quan hệ di truyền xa nhau (như lai cá thể PBC154 với các cá thể còn lại trong quần thể PBC), không nên chọn lai những cá thể có quan hệ di truyền gần nhau (như lai cá thể CT1 với CT8 trong quần thể CT). 122 Phần 6 Tài liệu tham khảo  TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang-1999. Di truyền phân tử - Những nguyên tắc căn bản trong chọn giống cây trồng- Nhà xuất bản Nông nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh, 278 trang. 2. Hoàng Thị Liễu- 2004 - Phân tích mức độ đa dạng di truyền và xây dựng phương pháp nhận diện một số giống cacao trên cơ sở kỹ thật PCR. Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Nông học, Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam,63 trang. 3. Hồ Huỳnh Thùy Dương- 1997- Sinh học phân tử - Nhà xuất bản giáo dục, 301 trang. 4. Nhữ Văn Thụ- 2002- Microsatellite- Viện chăn nuôi tổng hợp- Sáng chế mới, công nghệ mới. TIẾNG NƯỚC NGOÀI 1. A.McLauchlan, R.J.Henry, P.G.Isaac, K.J.Edwards- 2001- Microsatellite analysis in cultivated hexaploid wheat and wild wheat relatives- Chapter10. 2. Beckmann, J.S. and Weber, J.l. -1992- Survey of human and rat microsatellites- Gemonics 12: pp 627 – 631. 3. Borislav Kobiljski, Steve Quarrie, Jane Kirby- 2002- Genetic diversity of the Novi Sad wheat core collection revealed by microsatellite- Cellular and molecular biology letters- Volume 7. 4. JC Motamayor, AM Risterucci, M Health and C Lanaud- 2003- Cacao domestication II: progenitor germplasm of the Trinitario cacao cultivar. 5. JC Motamayor, AM Risterucci, PA Lopez, CF Ortiz, A Moreno and C Lanaud- 2002- Cacao domestication I: the origin of the cacao cultivated by the Mayas. 6. J-D Swanson, A.C.Lee and M.J.Guiltinan- USDA Cacao DNA Fingerprinting- Ring Test Results from Penn State Iniversity. 123 7. Johansson, M., Ellegren, H. and Andersson, L 1992- Cloning and characterisation of highly polymorphic porcine microsatellites- Journal of Heredity 83, 196–198. 8. Juan Carlos Motamayor- 1999- Genetic diversity of cacao (Theobroma cacao L.) cultivated by the Mayas. 9. Kemp, S.J., Brezinsky, L. and Teale, A.J. -1993- A panel of bovine, ovine and caprine polymorphic microsatellites- Animal Genetics 24, 363–365. 10. Kwok, S., Kellog, D.E. McKinney, N., Spasic, D., Goda, L., Levenson, C., and Sninsky, J.J 1990- Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction: Human Immunodeficiency Virus 1 model studies- Nucleic Acids Res. 18:999-1005. 11. L.A.Motilal, M.Boccara-Ingenic Newsletter, Issue No.9- 2004- Screening and evaluation of SSR primers in gel systems for the detection of off-types in cocoa field genebanks. 12. Lagercrantz, U., Ellegren, H. and Andersson, L 1993- The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates- Nucleic Acids Research 21, 1111. 13. Love, J.M., Knight, A.M., McAleer, M.A. and Todd, J.A 1990- Towards construction of a high-resolution map of the mouse genome using PCR- analysed microsatellites- Nucleic Acids Research 21, 1111–1115. 14. Lanaud, C., Risterucci, A.M., Pieretti, I., Falque, M., Bouet, A. and Lagoda, P.J.L 1999- Isolation and characterisation of microsatellites in Theobroma cacao L- Molecular Ecology 8: pp 2141 - 2152 15. M.Rossetto- Centre for plant conservation genetics, Southern Cross University, Australia- 2001- Sourcing of SSR markers from related plant species- Chapter14. 16. Ma, Z.Q., Roder, M. and Sorrells, M.E 1996- Frequencies and sequence characteristics of di-, tri-, and tetra-nucleotide microsatellites in wheat- Genome 39, 123–30. 124 17. Morgante M. and Olivieri A.M. (1993) PCR- Amplified microsatellites as markers in plant genetics- Plant Journal 3: pp 175 - 182 18. Murray, V., Monchawin, C. and England, P.R 1993- he determination of the sequences in the shadow bands of dinucleotide repeat PCR- Nucleic Acids Research 21, 2395–2398. 19. N.Harker- Centre for plant conservation genetics, Southern Cross University, Australia- 2001- Collection, reporting and storage of microsatellite genotype data- Chapter17. 20. Powell, W., Morgante, M., Andre, C., Hanafey, M., Vogel, J., Tingey, S. and Rafalski, A 1996- The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis- Molecular Breeding 2, 225–238. 21. Ranjana Bhattacharjee, Maria Kolesnikova, Allen, Peter Aikpokpodion, Sundat Taiwo, Ivan Ingelbrecht- 2004 - An improved semiautomated rapid method of extracting genomic DNA for molecular marker analysis in cocoa (Theobroma cacao L.)- Plant molecular biology reporter 22. 22. Röder, M.S., Plaschke, J., Konig, S.U., Borner, A., Sorrells, M.E., Tanksley, S.D. and Ganal, M.W 1995- Abundance, variability and chromosomal location of microsatellites in wheat- Molecular and General Genetics 246, 327–33. 23. Saghai Maroof, M.A., Biyashev, R.M., Yang, G.P., Zhang, Q. and Allard, R.W. (1994)- Extraordinarily polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity, chromosomal locations, and population dynamics- Proceedings of the National Academy of Sciences USA 91, 5466–5470. 24. Suggs, S.V., Hirose, T., Miyake, E.H., Kawashima, M.J., Johnson, K.I., and Wallace, R.B.,- 1981- Using Purified Genes, in ICN-UCLA Symp- Developmental Biology- Vol. 23, Brown, D.D. Ed., Academic Press, New York, 683. 125 25. T.A.Holton- Centre for plant conservation genetics, Southern Cross University, Australia- 2001- Plant genotyping by analysis of microsatellite- Chapter 2. 26. T.Pugh, O.Fouet, A.M.Risterucci, P.Brottier, C.Lanaud- 2004- A new cacao linkage map based on codominant markers: development and integration of 201 new microsatellite markers- Original Paper. 27. Tautz, D 1989- Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers- Nucleic Acids Research 17, 6463–6471. 28. Wu, K.S. and Tanksley, S.D-1993- Abundance, polymorphism and genetic mapping of microsatellites in ric- Molecular and General Genetics 241, 225– 235. 29. Xiao, J., Li, J., Yuan, L., McCouch, S.R. and Tanksley, S.D-1996- Genetic diversity and its relationship to hybrid performance and heterosis in rice as revealed by PCR-based markers- Theoretical and Applied Genetics 92, 637–643. 30. Yang, G.P., Saghai-Maroof, M.A., Xu, C.G., Zhang, Q. and Biyashev, R.M. -1994- Comparative analysis of microsatellite DNA polymorphisms in landraces and cultivars in rice- Molecular and General Genetics 245, 187– 194. TRANG WEB 1. http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/microsatellite.html Microsatellite DNA methodology 2. http://www.icg.rdg.ac.uk/public_html/ssr-helpfile.htm Microsatellite help file. 3. http://uwadmnweb.uwyo.edu/zoology/mcdonald/molmark/lectures/PopGen/P opGen6/PopGen6.html Population Genetics VI: Introduction to microsatellites: from theory to lab. Practice 4. http://www.intl-pag.org/13/abstracts/PAG13_P123.html A Monte Carlo analysis on the number of microsatellite markers to estimate genetic diversity variability in cacao (Theobroma cacao L.) 5. http://www.eppendorfna.com/applications/pcr_appl_primer.asp?SX=NF& 126 General notes on primer design in PCR 6. http:// www.icgd.rdg.ac.uk International Cocoa Germplasm Database . vào kết quả phân tích microsatellite với 5 cặp primer có số al tương ứng như sau: mTcCIR7 có 3 loại al, mTcCIR8 có 8 loại al, mTcCIR11 có 8 loại al, mTcCIR15 có 8 loại al và mTcCIR 18 có 7 loại. Chí Minh, 2 78 trang. 2. Hoàng Thị Liễu- 2004 - Phân tích mức độ đa dạng di truyền và xây dựng phương pháp nhận di n một số giống cacao trên cơ sở kỹ thật PCR. Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Nông. http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method /microsatellite. html Microsatellite DNA methodology 2. http://www.icg.rdg.ac.uk/public_html/ssr-helpfile.htm Microsatellite help file. 3. http://uwadmnweb.uwyo.edu/zoology/mcdonald/molmark/lectures/PopGen/P opGen6/PopGen6.html