BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** CHU LÝ HẢI ANH KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở CÂY LÚA (Ozyra sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO Luận văn kỹ sƣ Chuyên Ngành: Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở CÂY LÚA (Ozyra sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành:Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. BÙI VĂN LỆ CHU LÝ HẢI ANH ThS. KIỀU PHƢƠNG NAM Khóa: 2002-2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY STUDYING EFFECT OF METHYLOBACTERIUM SP. ON MORPHOGENESIS OF IN VITRO RICE (Ozyra sativa L) Engineer Thesis Major: Biotechnology Research adviser Researcher BÙI VĂN LỆ, PROF, PhD CHU LÝ HẢI ANH KIỀU PHƢƠNG NAM, MSc Term: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 iv MỤC LỤC Trang CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU …………………………………………………………………… 1 TỔNG QUAN……………………………………………………………… 3 2.1 Giới thiệu về cây lúa…………………………………………………… 3 2.1.1 Vị trí phân loại……………………………………………………. 3 2.1.2 Nguồn gốc và phân bố…………………………………………… 4 2.1.3 Đặc điểm hình thái………………………………………………… 5 2.1.4 Đặc điểm hạt lúa………………………………………………… 6 2.2 Ứng dụng phƣơng pháp nuôi cấy mô trong cải tiến giống lúa……… 7 2.3 Phƣơng pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro………………………………10 2.3.1 Sự tái sinh mẫu cấy (sự tạo cơ quan)…………………………… 10 2.3.2 Sự tạo mô sẹo từ cơ quan………………………………………….11 2.3.3 Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy trên sự nuôi cấy tế bào…………………………………………………………….13 2.3.3.1 Môi trƣờng nuôi cấy………………………………………13 2.3.3.2 Các nhân tố vật lý…………………………………………13 2.3.3.3 Ảnh hƣởng của chất điều hòa tăng trƣởng thực vật……14 2.4 Ảnh hƣởng của vi sinh vật lên sự phát triển thực vật………………….14 2.5 Đặc điểm của chi Methylobacterium…………………………………… 15 2.5.1 Lịch sử phát hiện và phân loại…………………………………….15 2.5.2 Đặc điểm sinh thái………………………………………………….17 2.5.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa…………………………… 18 v 2.5.4 Các ứng dụng của vi khuẩn Methylobacterium sp……………… 19 2.5.4.1 Tƣơng tác với thực vật…………………………………… 19 2.5.4.2 Sinh tổng hợp auxin và cytokinin………………………….23 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP……………………………………………24 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu……………………………………….24 3.2 Vật liệu nghiên cứu……………………………………………………….24 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu………………………………………………24 3.2.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu………………………27 3.2.3 Mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy………………………………… 27 3.3.4 Nhân sinh khối và giữ giống vi khuẩn………………………… 27 3.3.5 Môi trƣờng nuôi cấy……………………………………………… 28 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………28 3.3.1 Tạo vật liệu khởi đầu (mô sẹo)…………………………………… 28 3.3.2 Nhân sinh khối vi khuẩn…………………………………………….30 3.3.3 Nội dung thí nghiệm…………………………………………………30 3.3.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20……………………………………… 30 3.3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20………………… 31 3.3.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20……………………………… 31 3.3.3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo mô sẹo của giống lúa VĐ20……………………………………………32 3.3.3.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20……………………………………………… 33 3.3.3.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20………………………………33 3.3.3.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20……………………………… 34 vi 3.3.3.8 Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tăng sinh mô sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………… 34 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………………36 4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………………………36 4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20……………………………………………38 4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………….43 4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo mô sẹo của giống lúa VĐ20………………………………………………………………….45 4.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20………………………………………………………………….47 4.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………….50 4.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………………53 4.8 Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tăng sinh mô sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………………… 55 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………………… 58 5.1 Kết luận…………………………………………………………………… 58 5.2 Đề nghị……………………………………………………………………….59 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vii CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : Dichlorophenoxy-acetic acid Aux : Auxin BAP : 6-Benzylamino-purin Cs : Cộng sự Cyt : Cytokinin MS : Murashige-Skoog MMS : Methanol mineral salts NAA : α-naphthalene acetic acid viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D đến kích thƣớc mô sẹo (cm) sau 4 tuần nuôi cấy……………………………………………………………………… 36 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến tỷ lệ tái sinh chồi từ mô sẹo……………………………………………………………………………….38 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến số chồi hình thành từ mô sẹo……………………………………………………………………………….40 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến tỷ lệ tái sinh và số rễ hình thành…43 Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lệ tạo sẹo của hạt lúa…………….45 Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến đƣờng kính mô sẹo…………………47 Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lế tái sinh chồi và số chồi hình thành từ mô sẹo…………………………………………………………………………50 Bảng 4.8: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lế tái sinh rễ và số rễ trên mẫu… 53 Bảng 4.9: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên sự tăng sinh mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy……………………………………………………………………………… 55 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Vi khuẩn có sắc tố hồng ngoại nhiễm vào môi trƣờng nuôi cây: A: Saintpaulia ionantha; B: Paulonia fortunei; C: Pacciflora sp. [8]………………………………….2 Hình 2.1: Oryza sativa L……………………………………………………… 6 Hình 2.2: Cấu trúc hạt lúa……………………………………………………….7 Hình 2.3: Methylobacterium sp. trên cây rêu (A), hình dạng tế bào vi khuẩn chụp qua kính hiển vi điện tử (B)…………………………………………………….17 Hình 2.4: Methylobacterium sp. chủng BJ001 nuôi cấy trên môi trƣờng thạch LB (A) vào môi trƣờng dịch thể LB (B) chụp qua kính hiển vi điện tử quét [36] 18 Hình 2.5: Sự tái sinh chồi của loài cây thuốc lá chuyển gen ipt trên môi trƣờng MS không bổ sung hormone sau một tháng nuôi cấy. (a): không bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays. (b): có bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays[21]……….20 Hình 3.1: Giống lúa VĐ20: (a) hạt chƣa bóc vỏ trấu, (b) hạt bóc vỏ trấu…… 24 Hình 3.2: Hạt lúa đã khử trùng trên môi trƣờng tạo sẹo……………………….29 Hình 4.1: Mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 0,5mg/l BAP và 1mg/l NAA sau 5 tuần nuôi cấy (1.1)…………………………………………………………… 37 Hình 4.2: Các mô sẹo ở thí nghiệm 1 sau 5 tuần nuôi cấy…………………….38 Hình 4.3: Mô sẹo tái sinh chồi trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP và 1mg/l NAA sau 5 tuần nuôi cấy………………………………………………………42 Hình 4.4: Các mẫu mô tái sinh chồi ở thí nghiệm 2 sau 5 tuần nuôi cấy………42 Hình 4.5: Mô sẹo tái sinh rễ trên môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA sau 5 tuần nuôi cấy…………………………………………………………………………44 Hình 4.6: Các mẫu mô tái sinh rễ ở thí nghiệm 3 sau 5 tuần nuôi cấy…………45 Hình 4.7: Sự tạo mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l 2,4-D: (a) có bổ sung 1ml dung dịch khuẩn, (b) không có bổ sung khuẩn sau 2 tuần nuôi cấy……….47 Hình 4.8: Sự tăng sinh mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 1mg/l BAP và 0,5mg/l NAA: (a) bổ sung 0,5ml dung dịch vi khuẩn, (b) không bổ sung khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy…………………………………………………………………………49 x Hình 4.9: Sự tăng sinh mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 1mg/l BAP, 0,5mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (5.4)…………………49 Hình 4.10: Sự tái sinh chồi trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP, 1mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (6.2)……………………… 52 Hình 4.11: Sự tái sinh chồi trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP, 1mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (6.4)……………………… 52 Hình 4.12: Sự tái sinh rễ trên môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA và 0,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (7.2)……………………………………… 54 Hình 4.13: Sự tái sinh rễ trên môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (7.4)……………………………………… 55 Hình 4.14: Sự tăng sinh mô sẹo ở thí nghiệm 8 trên môi trƣờng MS không bổ sung hormone: (a) không có bổ sung khuẩn, (b) bổ sung 0,5ml dung dịch vi khuẩn, (c) bổ sung 1ml dung dịch vi khuẩn, (d) bổ sung 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy……………………………………………………………………… 57 [...]... tài: “KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa L) NI CẤY IN VITRO Mục đích Tìm hiểu ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobacterium sp lên sự phát sinh cơ quan cây lúa: mơ sẹo, chồi, rễ u cầu Xác định nồng độ kích thích tố thích hợp đến khả năng tạo mơ sẹo, nhân sẹo, tạo chồi, nhân chồi, tạo rễ ở cây lúa bằng phƣơng pháp ni cấy in vitro Khảo sát ảnh. .. chất điều hòa sinh trƣởng thực vật thay đổi thì sự phát sinh cơ quan (chồi, rễ) sẽ xảy ra Sự phát sinh cơ quan từ mơ sẹo tƣơng tự nhƣ sự phát sinh cơ quan trực tiếp từ mẫu cấy Khi thay đổi thành phần và nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật thì tế bào mơ sẹo lại đƣợc cảm ứng để phân hóa tạo cơ quan [13 ] Tái sinh cây từ mơ sẹo lúa: khi đƣờng kính mơ sẹo đạt 0,5-1mm, mơ sẹo sẽ đƣợc cấy chuyền sang... cấy in vitro Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobacterium sp lên khả năng tạo mơ sẹo, tạo chồi, tạo rễ ở cây lúa So sánh ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobacterium sp với ảnh hƣởng của các kích thích tố lên sự phát sinh cơ quan 3 TỔNG QUAN 2 .1 Giới thiệu về cây lúa Lúa là cây lƣơng thực chính cho nhiều ngƣời và đồng thời lúa gạo cũng tham gia vào các hoạt động kinh tế quan trọng nhất trên thế giới... tái sinh, số chồi trên mẫu, số rễ trên mẫu, đƣờng kính mơ sẹo Những kết quả thu đƣợc: - Chủng 10 19 có tác dụng kích thích sự phát triển rễ, ức chế khả năng tái sinh chồi và thay đổi trạng thái, cấu trúc của mơ sẹo Chứng tỏ chủng khuẩn có tác động đến q trình trao đổi chất, sinh lý, sinh hóa của tế bào mơ sẹo, ảnh hƣởng đến sự phát sinh hình thái của sẹo - Chủng 10 19 có ảnh hƣởng đến q trình phát sinh. .. thực nghiệm – khoa Sinh học - trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên trên đối tƣợng là giống lúa VĐ20 và chủng vi khuẩn Methylobacterium sp 10 19 Tiến hành nhân sẹo, tạo chồi, tạo rễ từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20 bằng phƣơng pháp ni cấy in vitro, sau đó khảo sát ảnh hƣởng của chủng 10 19 lên khả năng phát sinh cơ quan của mơ sẹo bằng cách bổ sung những nồng độ khuẩn khác nhau vào mơi trƣờng ni cấy với 34 nghiệm... tuần………………………………………………………………… 53 Đồ thị 4 .1 0: Số chồi, số rễ hình thành trên mẫu, kích thƣớc mơ sẹo ở các nghiệm thức khác nhau sau 4 tuần……………………………………………………… 56 xi TĨM TẮT CHU LÝ HẢI ANH, Đại học Nơng Lâm TPHCM Tháng 8/2006 “ KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN CÂY LÚA (Oryza sativa L.) NI CẤY IN VITRO Giáo vi n hƣớng dẫn: PGS TS Bùi Văn Lệ ThS Kiều Phƣơng Nam Đề tài... sau: - Bản chất và nồng độ của các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật - Sự cân bằng giữa các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật trong mơ đích - Loại mơ đích và trạng thái sinh lý của mơ đích [3] 2.4 Ảnh hƣởng của vi sinh vật lên sự phát triển của thực vật Giữa thực vật và vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết với nhau, bên cạnh một số vi sinh vật có hại thì một số khác có lợi cho cây trồng giúp cây. .. streptomycin và tetracylin, trong đó chất kháng sinh tetracylin có hoạt tính ức chế mạnh đối với vi khuẩn Methylobacterium sp [34] 2.5.4 Các ứng dụng của vi khuẩn Methylobacterium sp 2.5.4 .1 Tƣơng tác với thực vật Giữa cây và vi khuẩn có quan hệ tƣơng hỗ, một số vi khuẩn có lợi cho cây trồng vì chúng tham gia vào các chu trình sinh địa hố, cung cấp cho cây các chất dinh dƣỡng cần thiết Vi khuẩn dinh dƣỡng... năng sinh phơi Nồng độ auxin tăng cao kích thích sự tạo mơ sẹo dạng bở nhƣng khi giảm nồng độ auxin thì mơ sẹo có dạng nốt và chắc [13 ] 13 2.3.3 Ảnh hƣởng của một số mơi trƣờng và điều kiện ni cấy trên sự ni cấy tế bào 2.3.3 .1 Mơi trƣờng ni cấy Tiềm năng tạo sẹo của một số lồi thực vật đƣợc xác định bởi sự tƣơng tác giữa trạng thái sinh lý của vật liệu ni cấy và mơi trƣờng ni cấy [15 ], [49] Vì vậy, vi c... Hình 1: Vi khuẩn có sắc tố hồng ngoại nhiễm vào mơi trƣờng ni cây: A: Saintpaulia ionantha; B: Paulonia fortunei; C: Pacciflora sp [9] Đã có nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành trên cây lúa (Oryza sativa L) và kết quả cho thấy vi khuẩn Methylobacterium sp có khả năng làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt, tăng trọng lƣợng tƣơi, chiều cao của cây mạ trong điều kiện in vitro …Vì vậy chúng tơi thực hiện đề tài: . hiện đề tài: “KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO . Mục đích Tìm hiểu ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobacterium. KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở CÂY LÚA (Ozyra sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành:Công nghệ sinh học . NGHỆ SINH HỌC ***000*** CHU LÝ HẢI ANH KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở CÂY LÚA (Ozyra sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO Luận