21 có đƣợc chỗ cƣ ngụ (mơi trƣờng thích hợp với vài lồi vi khuẩn) [44], [50] Bên cạnh tính phổ biến tồn lâu dài, nhiều chứng cho thấy PPFM thu nhận chất dinh dƣỡng từ chủ nhƣng mối quan hệ chiều Các vi khuẩn sử dụng nguồn carbon khoáng chất từ cây, đồng thời tham gia vào trình sinh hoá chuyển hoá quan trọng chủ Methylobacterium sp bật nhiều đặc tính quan trọng nhƣ khả tổng hợp amino acid, PHB (Poly- -Hydrobutyrate); tổng hợp carotenoid, tăng cƣờng tạo hƣơng vị dâu tây; tăng khả nảy mầm hạt; khả phân hủy hợp chất 2,4,6-trinitrotoluene, nitramine…; khả phân hủy chuyển hóa số chất khơng cần thiết thực vật thành sản phẩm có giá trị [35] Chủng PPFM đƣợc Basile cộng (1969) phát kích thích sinh trƣởng địa tiền (Scapania nemorosa) điều kiện in vitro [9] Kalyaeva cộng (2000, 2003) phát việc nhiễm vi khuẩn Methylovorus mays Methylomonas methanica vào môi trƣờng nuôi cấy in vitro tạo mối liên kết bền vững vi khuẩn mô thực vật Thuốc lá, lanh khoai tây nhiễm khuẩn tăng trƣởng mạnh (số chồi tăng, rễ phát triển mạnh) [39], [40] Năm 1994, Holland cộng công bố khả tƣơng tác vi khuẩn Methylobacterium sp đậu nành việc chuyển hoá nickel [35] Cây lúa (Oryza sativa) loại có mối quan hệ mật thiết với vi khuẩn PPFM Nhiều nhà nghiên cứu chứng tỏ vi khuẩn Methylobacterium sp có tác động tích cực lên sinh trƣởng phát triển lúa điều kiện in vitro lẫn in vivo Maliti (2000) nghiên cứu, đánh giá ảnh hƣởng số chủng Methylobacterium sp tăng trƣởng phát triển lúa mức độ: nuôi cấy mô, điều kiện in vitro trƣởng thành mơi trƣờng nhà kính Kết cho thấy: vi khuẩn Methylobacterium sp có khả 22 làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm hạt, tăng trọng lƣợng tƣơi, chiều cao mạ điều kiện in vitro [46] Năm 2004, Madhaiyan cộng tiến hành thí nghiệm gây nhiễm PPFM lên hạt lúa hay phun lên kết cho thấy: vi khuẩn Methylobacterium sp có hoạt tính kích thích tăng trƣởng, gia tăng khả đẻ nhánh lúa góp phần gia tăng suất lúa từ 22,1 đến 24,1% Ngoài ra, vi khuẩn Methylobacterium sp cịn có vai trị ức chế chủng vi khuẩn gây bệnh lúa, góp phần làm giảm tỷ lệ bệnh từ 17,8-23,7% Cơng trình Madhaiyan cộng (2004) chứng tỏ mối tƣơng quan khả kháng bệnh lúa xử lý với vi khuẩn Methylobactreium sp gia tăng polyphenol oxidase [47] Qua kết khảo sát ảnh hƣởng vi khuẩn Methylobactreium sp lên hình thành mơ sẹo thuốc cúc cho thấy: vi khuẩn có ảnh hƣởng khác lên q trình hình thành mơ sẹo loại mô hay loại nuôi cấy Đối với Chrysanthenum sp vi khuẩn hạn chế hình thành mơ sẹo nhƣng kích thích hình thành phơi mơ sẹo này, Nicotiana tabacum vi khuẩn lại ức chế q trình hình thành mơ sẹo mơ phiến mơ lóng thân Nhƣ vậy, vi khuẩn Methylobacterium sp có khả tác động lên q trình biệt hóa quan thực vật Ngồi vai trị tác động vi khuẩn chất mơ lồi thực vật định đến khả chiều hƣớng phát sinh quan ni cấy invitro Bên cạnh kết thí nghiệm cho thấy vi khuẩn Methylobacterium sp có khả tăng cƣờng q trình hình thành rễ P fortunei Chrysanthemum sp., so với đối chứng nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn mẫu cấy thành lập rễ sớm hơn, nhiều [9] Ngoài PPFM, cịn có nghiên cứu sử dụng lồi vi khuẩn có lợi khác nhƣ khảo sát tăng trƣởng phát triển hoa Cúc, hoa Bi Bi Địa Lan có diện Bacillus spp nuôi cấy in vitro [5] cho kết quả: tuỳ theo loại mà Bacillus spp có tác dụng khác nhƣ tăng chiều cao, số lƣợng rễ, trọng lƣợng tƣơi Vi khuẩn Methanotropic có ảnh hƣởng đến 23 hình thành callus hạt lúa mì, gia tăng tạo rễ, đồng thời gia tăng tái sinh [40] Với diện vi khuẩn Methylovorus mays môi trƣờng nuôi cấy làm tăng khả tái sinh chồi thuốc chuyển gen ipt [39] Từ kết chứng tỏ thực vật vi sinh vật có mối quan hệ tƣơng hỗ có lợi tạo điều kiện thuận lợi cho phát triển tăng trƣởng thực vật điều kiện in vitro in vivo 2.5.4.2 Sinh tổng hợp auxin cytokinin Khơng có thực vật mà vi sinh vật tổng hợp auxin cytokinin, vi khuẩn có lợi vi khuẩn tƣơng tác với thực vật nguyên nhân kích thích phát triển Omer cộng (2004) khảo sát diện IAA môi trƣờng chứa dịch PPFM phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp kết hợp với phân tích phổ NMR (Nuclear Mangnetic Radiation: cộng hƣởng từ hạt nhân) chứng tỏ vi khuẩn PPFM có khả tổng hợp hormone thực vật IAA [50] Holland cộng (1994) kiểm tra mối quan hệ PPFM, cytokinin phát triển thực vật cho thấy PPFM có ảnh hƣởng đến lƣợng cytokinin có mơ tế bào thực vật [35] 24 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thời gian : từ tháng 3/2006 đến tháng 7/2006 Địa điểm : phịng thí nghiệm sinh học phân tử - khoa Sinh học - trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Thí nghiệm đƣợc thực giống lúa VĐ20 đƣợc cung cấp từ Công ty cổ phần giống trồng Miền Nam * Đặc tính nơng học Giống lúa VĐ 20: giống lúa cao sản ngắn ngày, thời gian sinh trƣởng 95100 ngày, cao 85- 90 cm, suất 6- tấn/ Dạng hình khá, bơng to, lép, chín sớm, nhiễm bệnh vàng lá, chịu phèn trung bình Hạt gạo thon dài, không bạc bụng, cơm thơm dẻo (Công ty cổ phần giống trồng Miền Nam) (a) (b) Hình 3.1: Giống lúa VĐ20: (a) hạt chƣa bóc vỏ trấu, (b) hạt bóc vỏ trấu 25 Chủng vi khuẩn Methylobacterium sp 1019 phịng thí nghiệm sinh học phân tử - khoa Sinh học - trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên phân lập cung cấp * Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa chủng 1019 [9] Đặc điểm hình thái, sinh lý Chủng 1019 vi khuẩn có màu hồng, hình que ngắn, có khả di động, Gram âm, nhiệt độ tăng trƣởng thích hợp từ 25-35oC Đặc điểm Màu sắc khuẩn lạc MMS Đƣờng kính khuẩn lạc Hình dạng khuẩn lạc Chủng 1019 Hồng nhạt 2-3 mm Trịn, lồi, nhầy, có viền trắng bên ngồi Kích thƣớc tế bào 2-4 x 4-6 m Khả di động Có Gram - pH thích hợp 5,8 ± Nhiệt độ 25-35oC Hình dạng tế bào Dấu phẩy, phình to hai đầu Trong giới hạn nồng độ chất điều hòa tăng trƣởng thực vật thƣờng sử dụng môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thực vật, nồng độ chất điều hồ tăng trƣởng thực vật khơng ảnh hƣởng tới phát triển chủng 1019, việc bổ sung hormone vào môi trƣờng nuôi cấy thực vật không ảnh hƣởng đến tăng trƣởng vi khuẩn Chủng 1019 tăng trƣởng tối đa sau 30 nuôi cấy thời gian thích hợp để thu nhận sinh khối tế bào từ 12 đến 32 sau nuôi cấy 26 log (N/ml) 11 10,5 10 9,5 8,5 7,5 h 12 16 20 24 28 32 36 40 Đồ thị 3: Đƣờng cong tăng trƣởng chủng 1019 Đặc điểm sinh hóa Chủng có hoạt tính catalase dƣơng tính hoạt tính oxidase yếu Hợp chất Chủng 1019 Methylamine - Trimethylamine + Acetate + Citrate + L-Glutamate + D-Glucose + D-Xylose, L-arabinose + Fructose + Betaine + Tartrate + Serbacate + 44 27 Ethanol + Nutrient agar + Lactose + Sucrose + Chủng 1019 có khả tổng hợp cytokinin lƣợng thấp auxin môi trƣờng nuôi cấy mô thƣc vật 3.2.2 Thiết bị dụng cụ dùng nghiên cứu Thiết bị : tủ cấy vô trùng, nồi hấp (autoclave), máy đo pH, cân phân tích, phịng ni cây… Dụng cụ : pince, kéo, dao cấy, chai nƣớc biển, bình tam giác, đĩa petri, đèn cồn… 3.2.3 Mẫu cấy điều kiện nuôi cấy Mẫu cấy : hạt lúa giống VĐ20 Điều kiện nuôi cấy : môi trƣờng trƣớc cấy đƣợc hấp khử trùng 121oC, áp suất 1atm thời gian 20 phút Phịng ni cấy: - Cƣờng độ ánh sáng 2000 lux - Nhiệt độ : 27 ± 2oC - Ẩm độ 70%- 80% - Thời gian chiếu sáng : 16h/ngày 3.2.4 Nhân sinh khối giữ giống vi khuẩn Chủng 1019 đƣợc giữ glycerol 10%, sau phân lập mơi trƣờng MMS + 1% methanol 28 3.2.5 Môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng nuôi cấy môi trƣờng MS (Murashige Skoog, 1962) (Phụ lục 1) Môi trƣờng phân lập làm chủng 1019 môi trƣờng MMS (methanol mineral salts) (Phụ lục 2): Môi trƣờng MMS đƣợc trùng cách hấp nhiệt độ 121oC 20 phút, sau để nguội bổ sung methanol vào mơi trƣờng với thể tích từ 0,1 đến 0,2%, mơi trƣờng rắn có bổ sung agar 20g/l trƣớc hấp Hầu hết chủng PPFM không cần vitamine hay nhân tố tăng trƣởng khác trình tăng sinh Môi trƣờng giữ giống chủng 1019 môi trƣờng Glycerol-Pepton Agar (Phụ lục 3) * Các môi trường hấp khử trùng nhiệt độ 121oC 20 phút Các thành phần khác: - Đƣờng: 20g/l - Agar: 7g/l pH môi trƣờng trƣớc hấp: 5,7 – 5,8 Các chất kích thích sinh trƣởng: - BAP (6- benzylamino purine) - NAA (α- naphthaleneacetic acid) 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Tạo vật liệu khởi đầu (mô sẹo) Các hạt lúa giống VĐ 20 sau khử trùng đƣợc cấy vào môi trƣờng MS + mg/l 2,4- D để tạo mô sẹo [16] 29 Khử trùng mẫu: Hạt lúa bóc vỏ trấu Rửa xà bơng 5-10 phút Rửa nƣớc máy mang vô tủ cấy Tráng nƣớc cất vô trùng Lắc cồn 70o phút Lắc Javel (1 Javel:3 H2O) xấp mặt hạt đổ Javel Rửa nƣớc cất vô trùng lần Gấp vào cấy Các mẫu cấy đƣợc đặt tối, nhiệt độ 27 ± 2oC, ẩm độ 72% Theo dõi hình thành phát triển mơ sẹo sau 2, tuần, sau sử dụng mơ sẹo làm vật liệu thí nghiệm 30 Hình 3.2: Hạt lúa khử trùng môi trƣờng tạo sẹo 3.3.2 Nhân sinh khối vi khuẩn Nhân sinh khối vi khuẩn: vi khuẩn đƣợc cấy vào môi trƣờng MMS (sử dụng phƣơng pháp đo OD để đạt mật độ 1010 tế bào/ml), lắc 37oC sau 87 giờ, sử dụng để bổ sung vào mơi trƣờng thí nghiệm 3.3.3 Nội dung thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, lần lặp lại, tổng số mẫu nghiệm thức 30 mẫu * Xử lý số liệu: Phân tích thống kê: số liệu đƣợc xử lý thống kê theo phần mềm MSTATC, sau dựa vào giá trị Prob bảng ANOVA để định nên trắc nghiệm phân hạng hay khơng Nếu có, dùng trắc nghiệm LSD trắc nghiệm Ducan, mức độ tin cậy 0,01 để đánh giá kết thí nghiệm 3.3.3.1 Thí nghiệm 1: “ Ảnh hƣởng nồng độ 2,4-D lên khả nhân sẹo giống lúa VĐ 20” Mục tiêu thí nghiệm: xác định lại nồng độ 2,4-D tốt cho khả nhân sẹo giống lúa VĐ20 Theo Đồn Thị Phƣơng Thùy [6] có khác nồng độ auxin thích hợp cho hình thành mơ sẹo nồng độ auxin thích hợp cho tăng trƣởng mô sẹo giống lúa khác nhau, thí nghiệm thay đổi nồng độ 2,4-D để xác định lại nồng độ auxin thích hợp cho khả nhân sẹo giống lúa VĐ20 Môi trƣờng (MTN): khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng + 1mg/l NAA + 0,5 mg/l BAP, bổ sung nồng độ 2,4-D [6] Mẫu cấy: mơ sẹo có diện tích NT1: MTN + mg/l 2,4-D NT2: MTN + mg/l 2,4-D 40 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng nồng độ BAP NAA đến số chồi hình thành từ mô sẹo Nghiệm BAP NAA Số chồi mẫu thức (mg/l) (mg/l) tuần tuần 2.1 0,1 1.16ab 1,33ab 2.2 0,5 1,75ab 2,08b 2.3 1 1,91b 2,41b 2.4 0,1 0,66a 0,66a 2.5 0,5 1,66ab 2,16b 2.6 1,91b 2,5b * Ghi chú: Trong cột, giá trị trung bình có kí tự theo sau giống khơng có khác biệt mặt thống kê (P>0,05) Số chồi 2,5 tuần 1,5 tuần 0,5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 Nghiệm thức Đồ thị 4.3: Số chồi hình thành mẫu nghiệm thức khác theo thời gian 41 Số chồi hình thành nghiệm thức tăng theo thời gian có nghiệm thức (2.4) số chồi hình thành không tăng (2,66) Ở nghiệm thức (2.3) tỷ lệ tái sinh tuần thứ không tăng so với tuần thứ (bảng 4.2), nhƣng số chồi lại tăng rõ rệt, tỷ lệ nồng độ ức chế tái sinh chồi nhƣng không ảnh hƣởng đến hình thành phát triển mẫu tái sinh Sau tuần, nghiệm thức (2.2); (2.3); (2.5), (2.6) số chồi hình thành có khác biệt so với nghiệm thức lại so với tuần thứ Sự khác biệt ý nghĩa mặt thống kê sinh học (P>0,05) Tỷ lệ Cyt/Aux có ảnh hƣởng quan trọng, định chiều hƣớng phát sinh hình thái mơ ni cấy [6], với tỷ lệ Cyt/Aux mơi trƣờng thích hợp kích thích tạo chồi mô sẹo Điều phù hợp với nghiên cứu trƣớc đây: hoạt động chất điều hoà tăng trƣởng phụ thuộc vào: - Sự cân chất điều hồ tăng trƣởng thực vật mơ đích - Loại mơ đích trạng thái sinh lý mơ đích [3] Qua bảng 4.2 4.3 cho thấy nghiệm thức (2.6) cho tỷ lệ tái sinh chồi số chồi hình thành cao nên ta sử dụng kết nghiệm thức cho thí nghiệm 42 cm Hình 4.3: Mơ sẹo tái sinh chồi môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP 1mg/l NAA sau tuần nuôi cấy (2.1) (2.4) (2.2) (2.3) (2.5) (2.6) cm Hình 4.4: Các mẫu mơ tái sinh chồi thí nghiệm sau tuần ni cấy 43 4.3 Thí nghiệm 3: “ Ảnh hƣởng nồng độ NAA lên khả tái sinh rễ từ mô sẹo giống lúa VĐ20” Bảng 4.4: Ảnh hƣởng nồng độ NAA đến tỷ lệ tái sinh rễ số rễ hình thành Nghiệm NAA (mg/l) thức Tỷ lệ tái sinh rễ Số rễ mẫu sau tuần (%) sau tuần 3.1 0,5 58,33a 2,08a 3.2 91,66a 4,16a 3.3 1,5 83,33a 4,25a 3.4 83,33a 2,66a * Ghi chú: Trong cột, giá trị trung bình có kí tự theo sau giống khơng có khác biệt mặt thống kê (P>0,05) 60 40 20 0 3.1 3.2 3.3 số rễ 80 tỷ lệ (%) 100 tỷ lệ rễ số rễ 3.4 Nghiệm thức Đồ thị 4.4: Tỷ lệ rễ tái sinh số rễ hình thành nghiệm thức khác sau tuần 44 Theo bảng 4.4 cho thấy tỷ lệ tái sinh rễ cao, nghiệm thức (3.2), (3.3), (3.4) có khác biệt rõ ràng so với nghiệm thức (3.1), khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê sinh học (P>0,05) Nhƣ nồng độ NAA cao kích thích tái sinh rễ tốt Ở nghiệm thức (3.4) có tỷ lệ tái sinh rễ cao (83.33%) nhƣng số rễ mẫu lại thấp, nồng độ kích thích tái sinh rễ từ mơ sẹo nhƣng lại hạn chế phát triển rễ từ mẫu tái sinh Sau tuần nuôi cấy nghiệm thức (3.1), (3.2), (3.3), số mơ sẹo xuất chồi, cịn nghiệm thức (3.4) khơng có chồi xuất hiện, nồng độ NAA cao ức chế tạo chồi mô sẹo Hai nghiệm thức (3.2), (3.3) có tỷ lệ tái sinh rễ số rễ mẫu cao, khơng có khác biệt mặt thống kê, nhƣng nghiệm thức (3.3) rễ phát triển nhiều tốt Nên ta chọn kết nghiệm thức (3.3) sử dụng cho thí nghiệm cm Hình 4.5: Mơ sẹo tái sinh rễ mơi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA sau tuần nuôi cấy 45 (3.1) (3.2) (3.3) (3.4) cm Hình 4.6: Các mẫu mơ tái sinh rễ thí nghiệm sau tuần ni cấy 4.4 Thí nghiệm 4: “ Ảnh hƣởng chủng 1019 lên mô sẹo giống lúa VĐ 20” Bảng 4.5: Ảnh hƣởng chủng 1019 đến tỷ lệ tạo sẹo hạt lúa Nghiệm thức Vml dung dịch vi khuẩn Tỷ lệ tạo sẹo (%) 4.1 85,33b 4.2 0,5 79,33b 4.3 84,66b 4.4 1,5 62,33a * Ghi chú: Trong cột, giá trị trung bình có kí tự theo sau giống khơng có khác biệt mặt thống kê (P>0,05) tỷ lệ(%) 46 90 80 70 60 50 40 30 20 10 85,33 79,33 84,66 62,33 4.1 4.2 4.3 Nghiệm thức 4.4 Đồ thị 4.5: Tỷ lệ tạo mô sẹo nghiệm thức khác sau tuần Nghiệm thức đối chứng nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn (4.2), (4.3) khơng có khác biệt rõ rệt mặt thống kê sinh học Trong nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn có lẽ nồng độ hormone chủng 1019 tổng hợp không ảnh hƣởng nhiều đến tỷ lệ cân Cyt/Aux môi trƣờng nuôi cấy nên q trình tạo mơ sẹo xảy ra, nhiên tùy vào nồng độ khuẩn bổ sung mà cho tỷ lệ khác Nghiệm thức (4.2) cho tỷ lệ cao thấp nghiệm thức (4.4) Vì vậy, chủng 1019 khơng có ảnh hƣởng đến khả tạo mô sẹo giống lúa VĐ20 so với đối chứng môi trƣờng: MS + 2mg/l 2,4-D, nồng độ khuẩn thích hợp cho mội trƣờng tạo sẹo nghiệm thức có bổ sung khuẩn 1ml Theo tác giả [9], Methylobacterium sp hạn chế hình thành mô sẹo Chrysanthemum sp ức chế hình thành mơ sẹo mơ phiến lá, lóng thân Nicotiana tabacum; nhƣ vi khuẩn có ảnh hƣởng khác lên q trình hình thành mơ sẹo loại mơ hay lồi ni cấy khác 47 (a) (b) Hình 4.7: Sự tạo mơ sẹo mơi trƣờng MS bổ sung 2mg/l 2,4-D: (a) có bổ sung 1ml dung dịch khuẩn, (b) khơng có bổ sung khuẩn sau tuần ni cấy 4.5 Thí nghiệm 5: “ Ảnh hƣởng chủng 1019 lên khả nhân sẹo giống lúa VĐ20” Dựa vào kết thí nghiệm 1, mẫu đối chứng: mơi trƣờng MS bổ sung 0,5 mg/l NAA mg/l BAP Bảng 4.6: Ảnh hƣởng chủng 1019 đến đƣờng kính mơ sẹo Nghiệm V dung dịch Đƣờng kính mơ sẹo (cm) thức khuẩn (ml) tuần tuần 5.1(Đ/chứng) 0,53b 0,66c 5.2 0,5 0,27a 0,31b 5.3 0,25a 0,26a 5.4 1,5 0,25a 0,25a * Ghi chú: Trong cột, giá trị trung bình có kí tự theo sau giống khơng có khác biệt mặt thống kê (P>0,05) 48 kích thước(cm) 0,7 0,6 0,5 5.1(đ/c) 0,4 5.2 0,3 5.3 0,2 5.4 0,1 tuần tuần Đồ thị 4.6: Kích thƣớc mơ sẹo nghiệm thức khác theo thời gian Qua bảng 4.6, ta thấy có khác biệt rõ rệt nghiệm thức đối chứng với nghiệm thức bổ sung khuẩn Sự khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê sinh học (P0,05) 75 80 70 66,66 tỷ lệ(%) 60 6.1(đ/c) 50 41,66 6.2 40 6.3 30 20 10 6.4 16,66 0 0 tuần tuần Đồ thị 4.7: Tỷ lệ tái sinh chồi nghiệm thức khác theo thời gian 51 2,5 Số chồi 2,5 6.1(đ/c) 1,66 6.2 1,5 6.3 0,5 0,58 6.4 0,25 0 0 tuần tuần Đồ thị 4.8: Số chồi hình thành mẫu nghiệm thức khác theo thời gian Theo kết có khác biệt rõ rệt nghiệm thức đối chứng với nghiệm thức có bổ sung khuẩn tỷ lệ tái sinh chồi số chồi hình thành từ mơ sẹo Sự khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê sinh học (P0,05) 100 80 60 40 số rễ tỷ lệ(%) tỷ lệ rễ số rễ 20 0 7.1(đ/c) 7.2 7.3 7.4 Nghiệm thức Đồ thị 4.9: Tỷ lệ rễ tái sinh số rễ hình thành mẫu nghiệm thức khác sau tuần 54 Qua bảng 4.8 cho thấy khác biệt nghiệm thức có bổ sung khuẩn (7.2) với nghiệm thức đối chứng nghiệm thức có bổ sung khuẩn (7.3), (7.4), khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê sinh học (P