18 làm xấu trình kéo dài (extension) Do đó, người ta cần phải xác định nồng độ tối ưu ion Mg2+ nhằm đảm bảo kết số lượng sản phẩm chuyên tính sản phẩm PCR Để tối ưu hóa phản ứng PCR người ta thường thay đổi nồng độ MgCl2 trước tiên để phản ứng xảy dễ dàng 2.6.3.6 Buffer (dung dịch đệm) PCR buffer thường cung cấp theo Taq – polymerase, có khơng có Mg2 PCR buffer có chất ổn định hoạt động enzyme (enzyme stabilizer): thường gelatin nồng độ 0,01 % hay Triston X – 100 nồng độ 0,1 % 2.6.3.7 Những ứng dụng quan trọng phản ứng PCR Kể từ đời, phương pháp PCR ảnh hưởng sâu sắc tới nghiên cứu sinh học phân tử Các ứng dụng tiêu biểu PCR bao gồm: sản xuất mẫu dò dùng phương pháp lai phân tử, xác định trình tự acid nucleic, tạo đột biến điểm định hướng Ngồi ra, PCR cịn ứng dụng nhiều lĩnh vực khác như: y học, pháp y, ngành khảo cổ học Gần đóng góp thiết thực kỹ thuật PCR việc giải mã gen người 2.6.3.8 Những hạn chế phƣơng pháp PCR Có thể kể ba vấn đề lớn sử dụng PCR: Trong thực nghiệm, kích thước trình tự cần khuếch đại giới hạn Trừ vài trường hợp cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động với đoạn DNA lớn kb Việc sử dụng PCR độ dài 1,5 kb cho kết tốt Với độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải xác định qua thực nghiệm Sự ngoại nhiễm vấn đề đặt lớn PCR, gắn liền với khả khuếch đại phương pháp Có thể khắc phục vấn đề số biện pháp sau: 19 - Các công đoạn thao tác khác thiết lập phản ứng PCR phân tích sản phẩm khuếch đại phải tiến hành địa điểm cách xa Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không sử dụng vào thao tác khác Đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh nhiễm đầu micropipette phân tử khuếch đại hút dung dịch phản ứng - Dùng tia tử ngoại để loại bỏ phân tử lại từ lần khuếch đại trước - Tất thành phần phản ứng chia thành lượng nhỏ, tính toán sau cho đủ 1, lần thao tác - Ngồi ra, hãng sản xuất cịn tung thị trường nhiều hệ thống cho phép loại bỏ hoàn toàn ngoại nhiễm Ví dụ hãng Perkin-Elemer-Cetus đề xuất sử dụng dUTP thay dTTP; việc thay khơng ảnh hưởng đến phản ứng Trước lần phản ứng kế tiếp, người ta cho thêm vào dung dịch phản ứng uracylglycosylase; enzyme phân hủy tất DNA có mang dUTP nhiễm từ lần trước Đồng thời enzyme bị phân hủy nhiệt từ lần biến tính Bất lợi hệ thống giá thành cao (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002) Các sai sót gây Taq polymerase Sự chép Taq polymerase cho tỷ lệ sai cao (cứ 10000 nucleotide enzyme gắn sai nucleotid Ta khơng thể loại bỏ hồn tồn sai sót mà giảm bớt; ví dụ đảm bảo cân nồng độ nucleotide phản ứng, xác định trình tự nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước đến trình tự thức (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002) 2.7 Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) Kỹ thuật dựa giả thuyết: khác biệt DNA thay đổi cấu trúc dây đơn DNA có cấu trúc hình học khác nhau, làm cho DNA dịch chuyển 20 gel với tốc độ khoảng cách di chuyển khác Sau thực phản ứng PCR, làm biến tính DNA thành dây đơn, điện di nhuộm bạc Kỹ thuật SSCP có quy trình thực khó kết có độ tin cậy khơng cao (Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999) 2.8 Kỹ thuật STS (Sequence – Target Sites) Do Olson ctv đề xuất năm 1989, dựa nguyên lý: trình tự đoạn DNA chuyên biệt cho lồi, thơng qua kỹ thuật PCR nhân đoạn DNA lên hàng triệu lần phát qua điện di Kỹ thuật có nhược điểm phải biết trình tự gene đối tượng nghiên cứu (Nguyễn Thị Lang, 2002) 2.9 Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) Kỹ thuật dựa nguyên lý: giống khác có đoạn DNA ổn định chun biệt có trình tự đơn giản gồm khoảng – nucleotides lặp lại nhiều lần (simple sequence repeat), tiến hành phản ứng PCR sử dụng primer chuyên biệt nhân đoạn DNA chuyên biệt lên Điều quan trọng phải biết trình tự lặp lại chuyên biệt để thiết kế primer cho giống Kỹ thuật SSR có độ tin cậy cao, chủ yếu dùng để định danh giống hay loài gần mặt di truyền (Nguyễn Thị Lang, 2002) 2.10 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 2.10.1 Giới thiệu kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD dựa kỹ thuật PCR, cách sử dụng primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp nhân ngẫu nhiên đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự primer Theo nguyên tắc, cá thể hoàn toàn giống nhau, sau thực phản ứng RAPD điều kiện tạo số lượng đoạn DNA chiều dài đoạn DNA tương ứng Khi có đột biến làm xuất hay vị trí bắt cặp ngẫu nhiên tạo số lượng chiều dài đoạn DNA khác cá thể, kỹ thuật RAPD phát đột biến Kỹ thuật 21 RAPD giúp nhận diện thị phân tử trội (Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999) Kỹ thuật RAPD minh họa qua hình 2.3: Hình 2.3 Sự bắt cặp khuếch đại phản ứng RAPD Ghi chú: - Các mũi tên biểu thị cho primer (các primer có trình tự giống nhau, khoảng 10 nucleotide); số 1, 2, 3, 4, 5, tượng trưng cho vị trí DNA mẫu mà primer gắn vào; primer bắt cặp vào vị trí 1, 2, mạch đơn DNA mẫu 3’- 5’, primer bắt cặp vào vị trí 4, 5, mạch đơn DNA mẫu 5’ - 3’ Trong trường hợp này, có sản phẩm PCR tạo thành: Sản phẩm A: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA nằm hai vị trí Sản phẩm B: sản phẩm PCR khuếch đại Khơng có sản phẩm PCR hình thành primer nằm vị trí hai vị trí xa phép hồn thành khuếch đại Khơng có sản phẩm hình thành primer nằm vị trí 4, 5, primer khơng có chiều hướng vào (Nguồnhttp://www.avery.rulger.edu/wssp/studentscholarship/project/achive s anion/rapd.html) Về kỹ thuật RAPD thực theo ba bước: Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA máy PCR Điện di gel agarose gel polyacrylamid Xác định tính đa dạng di truyền phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) số liệu thu 22 cho thấy gần gũi cách biệt di truyền mẫu nghiên cứu (Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999) 2.10.2 Một số vấn đề thực tế thực phản ứng RAPD thƣờng gặp phải Nồng độ primer tối ưu thường nằm khoảng từ – 2mM Nồng độ DNA mẫu khác làm thay đổi số băng bảng gel điện di Vì nồng độ DNA mẫu xem thích hợp cho phản ứng: 10 – 50 ng/50 μl thể tích phản ứng PCR buffer thường cung cấp theo Taq - polymerase có khơng có Mg2+ Kỹ thuật RAPD phụ thuộc nhiều vào nồng độ Mg2+, nồng độ Mg2+ khác sản phẩm RAPD khác nhau, thay đổi nồng độ Mg2+ thường thay đổi số lượng băng DNA gel Taq - polymerase nhà sản xuất khác cho kết sản phẩm khác lớn Vì vậy, loại Taq - polymerase nồng độ Taq địi hỏi phải xác xác định qua thực nghiệm Việc chọn loại Taq polymerase phù hợp quan trọng Taq – polymerase (Promega) AmpliTaq (Perkin Elmer) thường sử dụng Chu kỳ nhiệt có thay đổi số chu kỳ nhiệt độ, điều phụ thuộc vào máy PCR độ dày eppendorf RAPD thường tiến hành với 45 chu kỳ (KurtWeising, Hide Nybom, Kirten Wolff, Wieland Meyer, 1995) 2.10.3 Những ƣu điểm kỹ thuật RAPD Về mặt kỹ thuật: kỹ thuật RAPD dễ thực dễ thành công không cần biết trước trình tự gene đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản Chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh cao, thời gian thực nhanh, khả nhân cao Về mặt kinh tế: chi phí thực thấp Kỹ thuật RAPD thường sử dụng kết hợp với kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di 23 truyền nhận diện thị phân tử có độ tin cậy cao (Nguyễn Thị Lang, 2002) 2.10.4 Những hạn chế kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD có độ xác khơng cao, không ổn định (thể mức độ lặp lại giống thấp) Khả nhân phản ứng PCR cao khả xuất đa hình thấp độ tin cậy không cao Khả nhận diện thị phân tử thấp có độ tin cậy không cao (Nguyễn Thị Lang, 2002) 2.10.5 Ứng dụng kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD phát minh sử dụng sau kỹ thuật PCR đời, mặc kết có độ tin cậy khơng cao sử dụng ưu điểm dễ thực chi phí thấp Những ứng dụng kỹ thuật RAPD: Đánh giá đa dạng di truyền: áp dụng đối tượng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua.v.v Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chương trình chạy PCR cần lựa chọn primer thích hợp cho đa hình cao Đối với nấm bệnh thực vật kỹ thuật RAPD áp dụng để phân tích đa dạng di truyền nhiều loại nấm khác nhau: Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces et de Not (Goodwin and Annis, 1991), Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei (Silva cộng sự, 1995) D teres (Peever Milgroom, 1994; Peltonen cộng sự, 1996).v.v.(Nguồn: http://library.uws.edu.au/adt-NUWS/uploads/approved/adt- NUWS20050722.084916/public/04Chapter3.pdf) Nhận diện thị phân tử: Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền mối tương quan kiểu gene RGA kiểu hình phản ánh bệnh đạo ơn số giống lúa Việt Nam (Lã Tuấn Nghĩa ctv, 1999) (Nguyễn Thị Lang, 2002) Ngoài kỹ thuật RAPD áp dụng xây dựng đồ gene: (Nguyễn Thị Lang, 2002) 24 2.10.6 Sự cách tân kỹ thuật RAPD Đã có vài cách tân kỹ thuật RAPD mô tả Kỹ thuật thứ sử dụng lúc primer khác thay sử dụng primer kỹ thuật RAPD thơng thường Việc sử dụng lúc primer khác làm xuất băng hoàn toàn khác, băng xuất so với sử dụng primer riêng rẽ Việc lựa chọn, sử dụng lúc primer khác cách phù hợp làm tăng tính đa hình primer cho sản phẩm đa hình Cách tân thứ cắt DNA enzyme giới hạn trước sau thực phản ứng PCR Sự cắt tạo hai kết Một làm giảm số lượng băng khó xác định (complex band) điều dẽ dàng cho việc đánh giá đa dạng di truyền Hai tạo đa hình mẫu có hạn chế đa hình Tuy nhiên việc sử dụng cách tân thuộc vào chiến lược nhằm làm tăng số thị (marker) đa hình đạt thị (marker) đồng trội Những cách tân có hạn chế làm giảm lợi kỹ thuật RAPD cụ thể tốc độ, giá thành, sử dụng phức tạp (Kurt Weising, Hide Nybom, Kirten Wolff, Wieland Meyer, 1995) 2.11 Kỹ thuật AFLP AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)– đa dạng chiều dài đoạn DNA nhân chọn lọc, phương pháp dựa nguyên tắc PCR Ở sản phẩm PCR kết trình nhân bội đoạn DNA sau cắt enzyme giới hạn (Zabow M Vos P.,1993) Nguyên lý kỹ thuật sau: trước làm phản ứng PCR người ta gắn đoạn DNA ngắn (adaptor) vào hai đầu mảnh DNA cắt enzyme giới hạn sau thiết kế primer theo đoạn DNA ngắn có gắn thêm nucleotide tiến hành phản ứng PCR Khi thay đổi số lượng trật tự oligonucleotid chọn lọc đầu nối ta nhận đoạn DNA nhân khác Sản phẩm phân tích gel polyacrymide, kết thu thường 50 - 100 băng DNA mẫu thí nghiệm 25 Kỹ thuật AFLP phương pháp xác định đa hình cao, tiết kiệm thời gian, dễ dàng lặp lại sử dụng để phân tích DNA mức độ (Zabeau, 1993) AFLP loại thị di truyền trội, giá thành đắt nên phần hạn chế sử dụng (Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999) 2.12 Nghiên cứu nƣớc 2.12.1 Những nghiên cứu C cassiicola nƣớc 2.12.1.1 Nghiên cứu tình hình bệnh C cassiicola gây cao su số nƣớc trồng cao su Đây bệnh có tác hại lớn chưa có từ trước tới nước trồng cao su giới Bệnh xuất quanh năm giai đoạn sinh trưởng cao su, gây hại cho dvt cao su mẫn cảm: RRIC 103, PNN 2058, PNN 2444, PNN 2447, KRS 21, FX 25, RRIM 725, IAN 873.v.v Tình hình bệnh diễn biến bệnh quốc gia, vùng địa lý khác khác Dịch hại C cassiicola gây ghi nhận lần vào năm 1980 Ngày bệnh xuất 12 nước trồng cao su, gây hại nặng nước sau (Jayasinghe, 2000, IIRDB, 2002) Tại Sri Lanka, có 4.300 cao su thuộc dvt RRIC 103 bị nhiễm bệnh nặng, phải nhổ bỏ trồng lại dvt kháng bệnh Chính phủ phải bồi thường 64.000.000 Rp cho người trồng cao su Ngoài dvt bị nhiễm bệnh nặng trước RRIC 103, RRIC 104, KRS 21 bị loại bỏ từ đầu, dvt khác mà vào thập niên 80 đánh giá kháng bệnh lại bị hại nặng gồm: RRIM 600, GT 1, RRIC 110, IAN 873, PB 260, PB 28/59, PB 235 RRII 105 (Jayasinghe, 2000) Ở Indonesia, có 400 cao su bị nhổ để trồng lại với ước tính thiệt hại khoảng 200 triệu Rp Một số dvt phải kéo dài thời gian KTCB - 10 năm làm giảm sản lượng 30 50% vườn khai thác Các dvt mẫn cảm với bệnh gồm: RRIC 103, GT 1, KRS 21, FX 25, BPM 6, RRIM 600, RRIM 725 IAN 873 (Wisma Harmidi, 1996) Ở Malaysia, bệnh ghi nhận tất vùng trồng cao su nước, nặng Johor Trengganu Các dvt nhiễm bệnh gồm: GT 1, RRIM 600, RRIM 701, RRIM 26 703, RRIM 712, RRIM 725, RRIM 901, RRIM 2009, RRIM 2015, RRIM 2020, PR 261, IAN 873 PB 217 (Shamsuri cộng sự, 2000) Ở Ấn Độ, dvt nhiễm bệnh vườn trưởng thành gồm: GT 1, RRIM 600 RRII 105, 118 Tại vườn nhân, gồm dvt : RRII 105, 118, 300, 305, PR 107, 255, 261, RRIM 600, PB 235, 255, 260, 311 GT Đặc biệt dvt RRII 105 mẫn cảm nặng với bệnh gây nhiều ý 80% cao su Ấn Độ trồng dvt này(Sabu, 2000) Ở Thái Lan, bệnh ghi nhận năm 1985 thí nghiệm trao đổi giống cao su quốc tế năm tuổi trạm Surat Thani Bệnh gây chết dvt RRIC 103 rụng nặng dvt KRS 21 Các dvt RRIC 103 KRS 21 bị loại bỏ hoàn toàn nhiều quốc gia trồng cao su giới Dịng vơ tính RRIC 110 bị loại bỏ Châu Phi năm 1995 mẫn cảm với bệnh (Ismail cộng sự, 1996; Darussamin A Pawirosoemardjo S., 1996) 2.12.1.2 Các nghiên cứu khác Nấm C cassiicola ký chủ khác nghiên cứu so sánh mức độ khác biệt di truyền tìm hiểu khả nhận biết dòng C cassiicola, mức độ khả gây độc C cassiicola Kết nghiên cứu cho thấy, tính độc C cassiicola ngày phát triển đa dạng biến thiên, khả gây độc C cassiicola dvt cao su khác nhau, tùy theo giai đoạn sinh trưởng C cassiicola có khả tổng hợp enzyme phân giải pectin enzyme phân giải cellulose chế biến dưỡng độc tố (C.K Jayashinge, 2000) Những khác biệt di truyền nấm bệnh C cassiicola ký chủ khác nghiên cứu phân tích đa hình RFLP vùng ITS (internal transcribed spacer) ribosome DNA đa hình đoạn DNA khuếch đại từ DNA tổng số (PCRRAPD) Tuy nhiên nghiên cứu phân tích đa hình RFLP vùng ITS (internal transcribed spacer) ribosome DNA khơng có khác biệt Silva cộng sự, 1998 đọc trình tự phần vùng ITS nguồn nấm C cassiicola từ Srilanka nguồn nấm C cassiicola từ Úc kết cho thấy mức tương đồng cao 27 Ngược lại nghiên cứu kỹ thuật RAPD lại cho thấy khác biệt di truyền đáng kể nguồn nấm C cassiicola Nghiên cứu biến dị di truyền 42 nguồn nấm C cassiicola ký chủ khác phương pháp RAPD Silva cộng (1995) cho thấy, có nhóm di truyền xác định, điều có nghĩa có khác biệt di truyền đáng kể nguồn nấm C cassiicola thu thập từ ký chủ khác Những kết nghiên cứu làm cho việc nghiên cứu tạo dvt cao su kháng bệnh trở nên dễ dàng (Silva cộng sự, 2003) Kỹ thuật RAPD với 14 primer sử dụng phát khác biệt đáng kể số nguồn nấm C cassiicola ký chủ khác nhau: đu đủ, húng, cao su, trinh nữ Phân tích theo nhóm đoạn DNA khuếch đại cho thấy nguồn nấm xếp vào nhóm di truyền khác tương ứng với nguồn gốc ký chủ đặc điểm hình thái Các kỹ thuật mở rộng để nghiên cứu biến dị nguồn nấm C cassiicola cao su Sri Lanka, nơi mà chủng C cassiicola độc tính cao xuất đe dọa nghiêm trọng cho ngành công nghiệp cao su thiên nhiên nước (Silva cộng sự, 2002) Safiah Atan Noor Hisham Hamid (2003) sử dụng kỹ thuật RAPD để phân tích nguồn nấm C cassiicola từ Hevea brasiliensis Kết phân biệt nhóm nguồn nấm, nguồn nấm gây nhiễm cho dvt RRIM 2020 nhóm nguồn nấm gây nhiễm cho dvt RRIM 600 dvt cao su khác Silva cộng (1998) kết hợp nghiên cứu đặc điểm hình thái, độc tính đặc điểm phân tử nấm C cassiicola thu nhận từ đồn điền cao su Sri Lanka 32 nguồn nấm C cassiicola thu nhận từ phổ ký chủ rộng địa điểm khác phân tích kỹ thuật RAPD sử dụng 15 primer ngẫu nhiên khuếch đại hệ gen C cassiicola Kết xác định có nhóm RAPD khác nhau, nguồn nấm có tương quan lớn nhóm RAPD vị trí phân lập kiểu gen trồng ký chủ mà từ nguồn nấm phân lập Ngồi ra, có mối tương quan nhóm RAPD với tỷ lệ tăng trưởng nguồn nấm tính độc trồng ký chủ khác 31  Cách thực sau: Lá có triệu chứng bệnh đặc trưng đưa phịng thí nghiệm, rửa nước cất vô trùng lần, dùng que cấy nấm khử trùng ướt khơ, sau đốt lửa đèn cồn, để nguội,lấy trực tiếp bào tử vết bệnh cấy vào đĩa môi trường (5 điểm/đĩa)  Phương pháp phân lập từ bào tử, sau hai ngày khuẩn lạc nghi ngờ nấm C cassiicola cấy sang đĩa môi trường (môi trường PDA) đặt ánh sáng đèn huỳnh quang 12h/ngày điều kiện nhiệt độ phòng (26 - 30ºC) Khi nấm phát triển, tiến hành cấy chuyền sang môi trường thu nguồn nấm chủng  Trong phân lập nấm C cassiicola thường lấy bào tử mặt phiến Mặt phiến nơi thuận lợi cho phát triển nấm bề mặt Tầng cutin mỏng giúp nấm xâm nhập vào mô dễ dàng hơn, nấm chịu ảnh hưởng điều kiện môi trường, đặc biệt tia tử ngoại ánh sáng mặt trời  Sử dụng phương pháp phân lập thu nhận nguồn nấm C cassiicola đơn bào tử Tuy nhiên, cần lưu ý phương pháp thực nấm C cassiicola kích thước bào tử nấm C cassiicola tương đối lớn  Với phương pháp phân lập trên, sau phân lập mẫu nấm cần phải kiểm tra lại cách quan sát hình thái sợi nấm bào tử nấm C cassiicola kính hiển vi  Nấm C cassiicola khó tạo bào tử mơi trường nhân tạo, để tạo bào tử C cassiicola môi trường nhân tạo tiến hành theo phương pháp sau: Các mẫu nấm sau cấy vào đĩa etri có chứa 10 ml mơi trường PSA Ni cấy điều kiện tối liên tục 24/24h điều kiện nhiệt độ phòng ngày 32 Sau ngày nuôi cấy sử dụng lame vô trùng cạo nhẹ bề mặt khuẩn lạc để kích thích sợi nấm tạo bào tử (Chee, 1988) Tiếp tục nuôi cấy điều kiện chiếu sáng hoàn toàn 24/24h nhiệt độ phòng ngày Sau thời gian tiến hành kiểm tra lại nguồn nấm cách soi bào tử kính hiển vi (đặt bào tử giọt nước cất giọt dung dịch methylene blue) Hình dạng bào tử so sánh với mô tả Ellis Holiday (1971) Các nguồn nấm xác định xác nấm C cassiicola sử dụng vào phân tích 3.3.2.3 Phƣơng pháp tách dơn bào tử nấm C cassiicola Đặt lame vào đĩa petri, hút ml môi trường agar cho vào lame trang thành lớp mỏng Hút 10 ml nước cất lần vô trùng cho trực tiếp vào đĩa nấm, quan sát mật độ bào tử kính hiển vi pha lỗng tới mật độ thích hợp thuận lợi cho trình tách đơn bào tử Hút 0,1 ml dịch bào tử chuyển lên lame agar chuẩn bị, dùng que cấy tam giác trang bề mặt agar khơ hồn tồn Sau đem ủ nhiệt độ phịng qua đêm (khoảng 10 – 12 giờ) bào tử bắt đầu nảy mầm bề mặt mơi trường Đặt lame kính hiển vi quan sát bào tử mọc mầm riêng lẻ, sau đánh dấu vùng có đơn bào tử Dùng dao cắt cẩn thận, vùng cắt nhỏ độ xác cao Sau cắt xong đặt vào đĩa môi trường PGA chuẩn bị sẵn, đem ủ nhiệt độ phịng bóng tối vài ngày đơn bào tử phát triển thành khuẩn lạc Sử dụng khuẩn lạc để nhân sinh khối sợi nấm (C KuruvillaJacob cộng sự, 2002) 3.3.3 Nhân sinh khối 3.3.3.1 Dụng cụ Máy lắc, bình tam giác, kim mũi mác, đèn cồn.v.v 33 3.3.3.2 Phƣơng pháp  Các dòng nấm C cassiicola sau phân lập chuyển sang môi trường lỏng, tiến hành nuôi cấy máy lắc (160 vòng/phút), điều kiện nhiệt độ 26 - 30 C  Sau ngày tiến hành thu sinh khối sợi nấm Cần lưu ý sợi nấm phải khô nên giữ nguồn sợi nấm -70 C 3.3.4 Tách chiết DNA 3.3.4.1 Hóa chất dụng cụ ly trích  Becher, phễu lọc, giấy thấm, nitơ lỏng, phenol, chloroform, isoamyl alcohol, lysis buffer, isopropanol, TE 1X, ethanol 100%, ethanol 70%  Cối chày để nghiền mẫu, eppendorf, micropipette loại đầu típ, bồn ủ nhiệt Memmert, máy vortex 3.3.4.2 Phƣơng pháp ly trích Phương pháp ly trích DNA thực theo quy trình Lee Taylor có cải tiến (Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005) sau: 1) Nuôi môi trường lỏng 2) Giữ sợi nấm - 70 C 3) Lấy 1g sợi nấm khô kiệt vào cối nghiền dung dịch nitơ lỏng 4) Chuyển phần bột nấm vào ống eppendorf Ở bước này, cố gắng giữ cho bột nấm nghiền không tan 5) Thêm 400 l lysis buffer (xem phụ lục 2), trộn hỗn hợp 6) Ủ 65 C 7) Di chuyển ống nghiệm khỏi dung dịch nước ấm (ra khỏi bồn ủ nhiệt) 8) Thêm vào 300 l phenol: chlorophorm isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ (lúc dung dịch có màu trắng đục) Ly tâm 14 000 vịng phút 28 C 34 9) Chuyển phần ống eppendorf sang eppendorf khác với thể tích 300 l kết tủa DNA cách thêm vào ½ thể tích isopropanol, trộn nhẹ cẩn thận DNA kết tủa dạng sợi màu trắng đục 10) Ly tâm 14000 vòng phút 28 C 11) Cẩn thận đổ bỏ phần dịch lỏng Dùng ethanol 70 % rửa nhiều lần DNA 12) Làm khô DNA, hoà tan dung dịch TE 1X tồn trữ C hay – 20 C sử dụng 3.3.4.3 Kiểm tra chất lƣợng DNA  Yêu cầu DNA tách chiết có chất lượng tốt (tương đối khơng bị gãy nhiều)  Định tính DNA phương pháp điện di Phương pháp cho phép ta đánh giá chất lượng DNA (có bị gãy nhiều hay khơng, có bẩn khơng,.v.v.).Tuy nhiên khơng cho biết nồng độ DNA thu hay độ dung dịch DNA cách xác Q trình điện di kiểm tra chất lượng thực theo qui trình sau (Nguyễn Thị Lang, 2002) Chuẩn bị gel agrose Chuẩn bị DNA cho loading: dùng parafilm để dặt DNA lên (khoảng 1015ul cho mẫu)+4 l dung dịch nhuộm Đầu tiên đặt mẫu DNA chuẩn : mẫu DNA chuẩn dùng cho thí nghiệm 0,5X (5 l),1X (10 l) (20 l) Các mẫu chuẩn đạt bên cạnh mẫu thí nghiệm để dễ dàng so sánh kết Điện di chụp ảnh Dựa băng hình DNA đánh giá chất lượng Pha dung dịch DNA TE  Định lượng DNA quang phổ kế 35 Phương pháp cho phép ước lượng tương đối xác lượng DNA chất lượng DNA có mẫu kết thu Hàm lượng DNA tính theo cơng thức: DNA (ng/μl) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * Độ pha loãng Gồm hai bước: Xây dựng đường chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đường chuẩn Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thường pha lỗng 100 lần) với dung dịch TE 1X: Hút 10 μl dung dịch DNA hòa tan với 990 μl TE 1X Cho vào Curvette Tiến hành đo OD  DNA sau tách chiết kiểm tra định tính, định lượng bảo quản 40C để dùng cho việc chạy RAPD –PCR 3.3.5 Thực phản ứng RAPD Kỹ thuật RAPD thực theo ba bước bản: Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA máy PCR Điện di gel agarose Xác định tính đa dạng di truyền phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram), số liệu thu cho thấy gần gũi cách biệt di truyền mẫu nghiên cứu 3.3.5.1 Hóa chất dụng cụ a> Các hóa chất cần thiết cho kỹ thuật RAPD Trisbase 1M Ethidium bromide KCl 1M Methylene blue Taq polymerase (Promega) Thang chuẩn (DNA.ladder) Dầu khoáng (Mineral oil) 10 Bromphenol blue dNTPs 11 Xylenecyanode FF Agarose 12 Glycerol 13.Phản ứng RAPD –PCR thực với primer sau: 36 Bảng 3.2 Các primer dùng cho phản ứng RAPD Trình tự(5’-3’) TmoC OPL-08 AGCAGGTGGA 36 OPM-05 GGGAACGTGT 35 OPD-18 GAGAGCCAAC 32 Tên primer b>Dụng cụ Pipet Máy chụp hình DNA Geldoc Máy PCR Lị vi sóng(Oven) Máy ly tâm Tủ lạnh -20 C,- 400C Máy điện di 3.3.5.2 3.3.5.3 Khảo sát qui trình RAPD Mục đích tối ưu hóa qui trình RAPD .Căn số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng RAPD mục (2.10.2) Việc bố trí thí nghiệm để khảo sát tùy vào sản phẩm phản ứng phân tích  đưa thí nghiệm phù hợp nhằm đáp ứng mục đích chung thí nghiệm Quá trình khảo sát tín hành qua thí nghiệm sau A> Thí nghiệm Mục đích thí nghiệm: khảo sát quy trình RAPD Chỉ tiêu đánh giá: băng DNA gel điện di Phương pháp tiến hành: theo quy trình với thành phần hóa chất, chương trình nhiệt ghi bảng sau a> Thành phần phản ứng cho thí nghiệm 37 Bảng 3.3 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD thí nghiệm 1(Silva cộng sự, 2003) Hóa chất Dung dịch gốc Nồng độ cuối Thể tích sử dụng 10X 1X 1,μl MgCl2 25 mM 1,8 mM 0,72 μl dNTP 10 mM 0,2mM 0,2 μl primer 10 pmol/μl 0,5 mM 0,5 μl 5U 0,5 U 0,1 μl 10 ng/μl 10 ng μl PCR buffer Taq DNA polymerase DNA mẫu 5,58 μl H2 O b> Chương trình nhiệt cho thí nghiệm Bảng 3.4 Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng RAPD thí nghiệm (Silva cộng sự, 2003) Giữ Nhiệt độ(độ 0C) Thời gian 94 phút Bước 36 phút Bước 40 Bước Bước1 Số chu kỳ 72 phút 40C B> Thí nghiệm Mục đích thí nghiệm : khảo sát ảnh hưởng yếu tố chu kỳ đến phản ứng RAPD Chỉ tiêu đánh giá: băng DNA gel điện di Phương pháp tiến hành: theo quy trình với thành phần hóa chất chương trình nhiệt ghi bảng sau : a> Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD thí nghiệm 2: giống thí nghiệm (Bảng 3.1) b> Chương trình nhiệt cho phản ứng RAPD thí nghiệm 2: 38 Bảng 3.5 Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng RAPD thí nghiệm Số lần lập lại Các bước Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 94 phút Lần,lượt tăng 94 45 giây từ 40, 42, 45 35 phút 74 phút 72 10 phút giữ 40C C> Thí nghiệm 3: Mục đích thí nghiệm: khảo sát ảnh hưởng yếu tố MgCl2, dNTPs primer, Taq - polymerase, DNA lên phản ứng RAPD Chỉ tiêu đánh giá: số lượng chất lượng băng DNA gel điện di Phương pháp tiến hành: theo quy trình với thành phần hóa chất chương trình nhiệt ghi bảng sau: a> Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD nghiệm thức thí nghiệm 39 Bảng 3.6 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD nghiệm thức - thí nghiệm Nghiệm Dung dịch Thể tích Nồng độ gốc sử dụng cuối PCR buffer 10X μl 1X Taq DNA polymerase 5U 0,1 μl 0,5U DNA mẫu 10 ng/μl μl 10 ng MgCl2 10 mM 2,1 μl 2,1 mM dNTP 10 mM 0,2 μl 0,2 mM primer 10 pmol/μl 0,5 μl 0,5 mM MgCl2 10 mM 2,5 μl 2,5 mM dNTP 10 mM 0,2 μl 0,2 M primer 10 pmol/μl 0,5 μl 0,5 mM MgCl2 10 mM 2,5 μl 2,5 mM dNTP 10 mM 0,3 μl 0,3 mM primer 10 pmol/μl 0,5 μl 0,5 mM MgCl2 10mM 2,5 μl 2,5 mM dNTP 10mM 0,3 μl 0,3 mM primer 10 pmol/μl 0,6 μl 0,6 mM MgCl2 10 mM 2,5 μl 2,5mM dNTP 10 mM 0,3 μl 0,3mM primer 10 pmol/μl 0,4 μl 0,4mM MgCl2 10 mM 2,5 μl 2,5 uM dNTP 10 mM 0,35 ul 0,35 mM primer 10 pmol/μl 0,7 μl 0,7 mM Hóa chất thức H2 O Thêm vào cho đủ 10 μl 40 Bảng 3.7 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD nghiệm thức – 10 thí nghiệm Nghiệm Thể tích Nồng độ gốc sử dụng cuối MgCl2 10 mM 2,5 μl 2,5 mM dNTP 10 mM 0,3 μl 0,3 mM primer thức Dung dịch 0.5 pmol/μl 0,5 μl 0,5 nM DNA 10ng 0,5 10 ng Taq 5U/1 ul 0,1 0,5U DNA 10 ng 1,5 15 Taq 5U/ 1ul 0,1 0,5 DNA 10 ng μl 10 ng Taq 5U/1 μl 0,08 μl 0,4 U DNA 10 ng 10 ng Taq 5U/1 μl 0,06 μl 0,3U Hóa chất 10 Thêm vào H2 O cho đủ 10 μl b> Chương trình nhiệt cho phản ứng RAPD thí nghiệm Chương trình nhiệt thu thí nghiệm Sau tìm qui trình tối ưu cho phản ứng RAPD ta tiến hành thực phản ứng RAPD với số lượng mẫu thu Mẫu sau chạy PCR bảo quản 40 C tiến hành diện di 3.3.5.4 Điện di đọc kết PCR gel agarose a) Các hóa chất sử dụng để điện di đọc kết Agarose Loading dye 6X TAE 0,5X Ethidium bromide b) Các dụng cụ thiết bị sử dụng để điện di đọc kết 41 Cân kỹ thuật số Giấy parafin Lò viba Máy chụp hình gel (Biorad) Khay đổ gel Ống đong Bồn máy điện di (Bio-rad) c) Quy trình thực Cho 0,25 g agarose vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X (nồng độ 2%) Đun sôi hỗn hợp khoảng hai phút lò viba Để nguội nhiệt độ phòng khoảng 50oC Đổ gel vào khay (đặt lược tạo giếng trước đổ gel), ý tránh bọt khí đổ gel Để gel đông đặc lại nhiệt độ phòng, khoảng 30 phút, rút lược khỏi gel, cho gel vào bồn điện di cho gel ngập dung dịch TAE 0,5X khoảng đến 1,5 cm Trộn 2,5 l sản phẩm PCR với 1,5 l loading dye 6X mặt giấy parafin Cho hỗn hợp vào giếng gel, bao gồm giếng thang chuẩn, giếng đối chứng giếng chứa mẫu Vận hành máy điện di hiệu điện 50V, thời gian 70 phút Sau hồn tất q trình điện di, bảng gel lấy khỏi bồn điện di nhuộm dung dịch ethidium bromide khoảng 15 – 20 phút chụp ảnh gel máy chụp Geldoc d) Đọc kết điện di Sau điện di, gel nhuộm dung dịch ethidium bromide từ - 15 phút Vớt ra, rửa lại nhiều lần với nước đọc kết tia UV DNA liên kết với ethidium bromide phát sáng tia UV Chụp ảnh kết điện di máy Gel BioRad 42 3.3.5.5 Phân tích kết phần mềm NTSYSpc2.1 Các băng thu từ kết điện di RAPD mã hóa thành dạng nhị phân 1, băng có chuyển thành 1, băng khơng có chuyển thành Bảng mã hóa lưu dạng file excel (xls) chuyển sang phần mềm NTSYS phiên 2.1 để xử lý 43 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết lấy mẫu, phân lập nhân sinh khối 4.1.1 Kết lấy mẫu, phân lập Mẫu bệnh rụng Corynespora với vết bệnh đặc trưng (mục 2.3.1.2) thu thập từ nhiều dvt cao su khác từ vườn tuyển non Lai Khê thuộc Bộ Môn Giống – trại thực nghiệm cao su Lai Khê, VNCCSVN (Bình Dương) Trong trình lấy mẫu đồng ruộng chúng tơi nhận thấy Việt Nam chuyên canh cao su diện rộng, trải dài từ Bắc đến Nam vùng khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều điều kiện thuận lợi cho nấm C cassiicola lây lan, phát triên Hiện bệnh chưa bùng phát mạnh nhờ hiệu công tác quản lý dịch bệnh Những dvt mẫn cảm với bệnh bị loại bỏ khuyến cáo khơng trồng Khi phát vườn có bệnh, tiến hành cưa bỏ toàn bộ, đốt cháy để hạn chế phát tán mầm bệnh Những khu vực phát bệnh Miền Đơng Nam Bộ (Bình Dương, Đồng Nai), miền Bắc (Hà Tây, Nghệ An) Những đợt điều tra bệnh cao su gần tỉnh Tây Ninh khu vực Tây Nguyên chưa phát thấy có bệnh Xét mức độ ảnh hưởng không giống với nấm khác cao su thường gây bệnh vị trí, hay giai đoạn định (bệnh Nấm Hồng, bệnh Phấn Trắng.v.v.) Nấm C cassiicola gây bệnh nhiều vị trí cao su từ non, già, cuống lá, chồi Bệnh gây hại quanh năm suốt giai đoạn phát triển cao su từ vườn ươm, vườn kiến thiết đến vườn khai thác Bệnh Corynespora có biểu triệu chứng khác nhau, thay đổi tùy theo tính mẫn cảm dvt nấm bệnh Ngoài triệu chứng điển hình già vết bệnh đặc trưng hình xương cá dọc theo gân, chuyển dần sang màu đỏ cam (Hình 4.1) Trên non cịn có triệu chứng vết bệnh trịn, tâm đen có quầng màu vàng bao quanh.Tại trung tâm vết bệnh đơi hình thành lỗ thủng, quan biến dạng sau hình thành lỗ thủng Triệu chứng đơi có thay đổi tùy mức độ mẫn cảm dvt (Hình 4.2) Triệu chứng gây nhầm lẫn bệnh rụng Corynespora với bệnh héo đen đầu nấm 44 Colletotrichum gloeosporioides gây trưởng thành không u lồi mà trơn láng dùng tay vuốt nhẹ (Hình 4.3) Do cao su cao to, tán lớn, rậm nên việc dùng biện pháp hóa học áp dụng cho vườn ươm, vườn nhân Đối với cao su công nghiệp dài ngày, việc nhổ bỏ trồng lại gây thiệt hại lớn (a) (b) (c) (d) Hình 4.1 Triệu chứng đặc trƣng bệnh rụng Corynespora – vết bệnh hình xƣơng cá mặt (a b), mặt dƣới lá(c), bình thƣờng (d) (Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN (a),(b) Chụp vườn tuyển non Lai Khê: (c),(d)) Hình 4.2 Triệu chứng khơng đặc trƣng bệnh rụng Corynespora Dấu mũi tên vị trí vết bệnh Vết bệnh phóng lớn (góc trái) 45 Hình 4.3 Triệu chứng bệnh héo đen đầu Colletotrichum gloeosporioides gây cao su Nguồn: Bộ mơn BVTV/VNCCSVN) (a) (b) (c) Hình 4.4 Bào tử nấm C cassiicola môi trƣờng PDA (a), từ vết bệnh (b) bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides (c) dƣới kính hiển vi quang học (Nguồn: Bộ mơn BVTV/VNCCSVN) Sau phân lập, mẫu nấm kiểm tra lại cách làm tiêu quan sát bào tử kính hiển vi Kết có 63 mẫu bệnh (Phụ lục 3) phân lập nấm C cassiicola, phần lớn mẫu nấm nấm Colletotrichum ... Nguyễn Thị Lang, 1999) 2. 12 Nghiên cứu nƣớc 2. 12. 1 Những nghiên cứu C cassiicola nƣớc 2. 12. 1.1 Nghiên cứu tình hình bệnh C cassiicola gây cao su số nƣớc trồng cao su Đây bệnh có tác hại lớn chưa... kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di 23 truyền nhận di? ??n thị phân tử có độ tin cậy cao (Nguyễn Thị Lang, 20 02) 2. 10.4 Những hạn chế kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD có độ xác khơng cao, khơng... nguồn nấm C cassiicola từ Úc kết cho thấy mức tương đồng cao 27 Ngược lại nghiên cứu kỹ thuật RAPD lại cho thấy khác biệt di truyền đáng kể nguồn nấm C cassiicola Nghiên cứu biến dị di truyền 42