47 Tuy nhiên sự khác biệt về màu sắc của tế bào nhiễm virus còn phụ thuộc vào trạng thái nhiễm WSSV của tế bào. Có 4 pha nhiễm của tế bào ứng với 4 pha của virus: Pha sớm (tế bào mới nhiễm virus), pha tăng sinh (lượng virus trong hạch nhân tăng nhanh chiếm hết nhân, dùng cơ chất trong nhân để sao chép vật liệu di truyền), pha cấp (virus phá vỡ màng nhân xâm nhiễm vào tế bào chất, sử dụng cơ chất trong tế bào chất để hoàn chỉnh cấu trúc), pha phóng thích (tế bào vỡ và phóng thích virus). Nếu tế bào ở pha sớm, hạch nhân sẽ có màu vàng đến nâu nhạt. Nếu tế bào ở pha tăng sinh, hạch nhân trương to chiếm hết nhân và bắt màu nâu. Nếu tế bào ở pha cấp sẽ nhận thấy tế bào trương to và nâu sậm. Nếu tế bào ở pha phóng thích sẽ thấy có màu vàng, lan ra. Vì vậy ở bất kì nồng độ kháng thể nào cũng có những tế bào bắt màu vàng hay nâu nhạt, chỉ tuỳ vào lượng mAb nhiều hay ít, kết hợp đủ với kháng nguyên thì tín hiệu khuyếch đại sẽ nhiều, có thể giảm lượng tế bào có màu vàng hay nâu nhạt. C. Về độ sắc nét: Ở các nồng độ 0,5X, 1X và 1,5X, độ sắc nét của màu nhuộm thể hiện trên tế bào nhiễm không cao. Nồng độ 2X khác hẳn 3 nồng độ còn lại, trên tất cả các mẫu dương tính (8/10), phần lớn nhân tế bào trương to và tròn, có thể nhận thấy rõ mép nhân (25 - 75% tế bào có trên mẫu), những tế bào không có hình dạng đặc trưng là tròn to thì vẫn sắc nét (Bảng 4.4, Hình 4.2). - Nồng độ 0,5X; 1X và 1,5X: Kết quả được ghi nhận chủ yếu ở vật kính 40x và 100x vì ở vật kính 10x gần như tất cả các tế bào nhiễm đều không thể hiện được độ sắc nét. - Nồng độ 2X: Nhiều tế bào thể hiện sự sắc nét ngay ở vật kính 10x. Nguyên nhân: Thời gian giữ mẫu sau khi đúc trong nến và điều kiện lưu giữ ảnh hưởng lớn đến độ sắc nét. Những mẫu thí nghiệm do được thu, cố định và vùi trong nến cách đây khá lâu nên hình dạng tế bào và nhân tế bào không còn rõ nét. Tuy nhiên ở nồng độ 2X do lượng mAb quá cao, có thể đã kết hợp với toàn bộ kháng nguyên nên hình ảnh tế bào nhiễm sắc nét hơn. Ngoài ra độ sắc nét cũng phụ thuộc vào giai đoạn nhiễm WSSV của tế bào. Nếu tế bào ở pha sớm, hạch nhân trương lên nhưng chưa to. Ở pha tăng sinh và pha cấp thì 48 nhân sẽ có hình dạng đặc trưng. Ở pha phóng thích, hình dạng tế bào không rõ do có sự vỡ tế bào. A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3 E1 E2 E3 49 Hình 4.2. Kết quả nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau và không có mAb trên mẫu 103 (tất cả hình ảnh được chụp trên cùng một mang). A1, A2, A3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 0X (100x), (400x), (1000x). - Hình A1: Không thể nhận ra tế bào nhiễm - Hình A2: Vị trí mũi tên có thể là tế bào nhiễm - Hình A3: Tế bào nhiễm có nhân trương to và bắt màu hematoxylin. B1, B2, B3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 0,5X (100x), (400x), (1000x). - Hình B1: Nhận thấy những vị trí bắt màu vàng đến nâu nhạt trên mẫu - Hình B2, B3: Tế bào nhiễm có màu sắc khá rõ ràng, chỉ có tế bào ở vị trí mũi tên mới có hình dạng đặc trưng. C1, C2, C3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 1X (100x), (400x), (1000x). - Hình C1: Có thể nhận thấy rõ vi trí tế bào nhiễm có màu nâu. - Hình C2, C3: Tế bào nhiễm bắt màu đẹp, sắc nét. D1, D2, D3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 1,5X (100x), (400x), (1000x). Tế bào nhiễm biểu hiện rõ ràng, dễ nhận biết E1, E2, E3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 2X (100x), (400x), (1000x). - Hình E1: Các tế bào nhiễm bắt màu nâu rất đậm, gần như đen. - Hình E2, E3: Màu DAB quá đậm, hình dạng nhân sắc nét 4.2. Kết quả nội dung so sánh phƣơng pháp IHC với phƣơng pháp Mô học truyền thống và kỹ thuật PCR về độ chính xác, độ nhạy, tính ổn định và tính hiệu quả. 4.2.1. So sánh độ chính xác và độ nhạy của 3 phƣơng pháp PCR, mô học và IHC. 50 Bảng 4.4. Kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV của ba phƣơng pháp PCR, Mô học và IHC trên tôm sú post-larvae và tôm thƣơng phẩm. Tôm post-larvae Tôm thương phẩm Kí hiệu PCR Mô học IHC Kí hiệu PCR Mô học IHC 7683 - - - 101 + + 7787 - - - 97 + + 7661 + - - 98 ++ ++ 7781 - - - 99 + + 7536 + - - 336 ++ + 7786 - - - 341 ++ + 7718 - - - 342 ++ + 7769 - - - 340 + + 7768 - - - 339 ++ + 7764 - - - 338 + + 7684 - - - 103 + + + 7691 - - - 44 ++ + ++ 7650 + - - 55 +++ ++ + 7722 - - - 57 - - - 7725 - - - 49 - - - 2682 + - - 94 + + + 2741 + - - 136 - - - 2708 + - - 134 - - - 3122 - - - 137 - - - 2752 + - - 135 - - - 2745 + - - 159 +++ ++ +++ 12964 - 5%(+) 20%(++) 161 - - - 2794 - 10%(++) 10%(+++) 152 + ++ ++ 2746 + - - 153 ++ + + 7755 ++ - - 156 + + + 178 - - - 179 - - - 181 - - - 182 - - - 185 - - - 51 Bảng 4.5. Kết quả thống kê so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phƣơng pháp PCR, Mô học truyền thống và IHC Loại xét nghiệm Lượng mẫu Trung bình có ý nghĩa nhỏ nhất Nhóm giống nhau Tôm post- larvae Tôm thương phẩm Tôm post- larvae Tôm thương phẩm Tôm post- larvae Tôm thương phẩm PCR Mô học IHC 25 25 25 20 30 30 0,84 0,2 0,28 1,59167 1,46667 1,36667 X X X X X X So sánh đối chiếu Khác biệt +/- Giới hạn Tôm post-larvae Tôm thương phẩm PCR – Mô học PCR – IHC Mô học - IHC 0,64 0,50112 * 0,56 0,50112 * -0,08 0,50112 * 0,125 0,25026 0,225 0,25026 0,1 0,25026 Dấu * chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê A. Trên đối tượng tôm post-larvae: Bảng kết quả (Bảng 4.2) cho thấy không có sự khác biệt về khả năng phát hiện tế bào nhiễm virus giữa phương pháp IHC và phương pháp mô học nhưng sự khác biệt này lại rất rõ nét giữa phương pháp PCR và 2 phương pháp còn lại. Như vậy, độ nhạy của PCR là khá cao và độ nhạy của IHC và mô học khác nhau không đáng kể. Theo quan sát dưới kính hiển vi, các mẫu nhuộm IHC biểu hiện nhân nhiễm WSSV rất rõ ràng, có thể nhận biết ngay ở vật kính 10x, nhưng với phương pháp Mô học cần phải tập trung và tìm thật kĩ mới nhận biết được những tế bào nhiễm. Trên 2 mẫu 12964 và 2794, IHC và mô học đều cho kết quả dương tính với tỷ lệ cảm nhiễm thấp và cường độ cảm nhiễm khá cao nhưng PCR lại cho kết quả âm tính. Khi xét nghiệm bằng IHC, cường độ cảm nhiễm và tỉ lệ cảm nhiễm của 2 mẫu này cao hơn xét nghiệm bằng Mô học. Có 10 mẫu (7661, 7536, 7650, 2682, 2741, 2708, 2752, 2745, 52 2746, 7755) PCR cho kết quả dương tính nhưng IHC và Mô học đều cho kết quả âm tính. Nguyên nhân: - Phương pháp PCR: Tôm post-larvae do chưa phải tuổi mẫn cảm nên thường nhiễm WSSV ở dạng tiềm ẩn, lượng virus trong mẫu rất ít, chỉ có phương pháp PCR với khả năng khuyếch đại một lượng rất nhỏ DNA của virus mới nhận biết được. Hơn nữa, trong quá trình xét nghiệm bằng PCR mẫu được đồng nhất nên tất các các bộ phận của cá thể tôm trong mẫu đều được kiểm tra, lượng tôm trong mẫu xét nghiệm có thể nhiều nên khả năng phát hiện mầm bệnh cao hơn. Vì vậy trên đối tượng tôm post-larvae phương pháp PCR có độ nhạy cao nhất (phát hiện ra 10 mẫu dương tính trong khi Mô học và IHC không thể phát hiện được). Tuy nhiên, tính chính xác của phương pháp PCR lại phụ thuộc rất nhiều vào tính đặc hiệu của primer và nhiều yếu tố khách quan và chủ quan khác như chất lượng hoá chất, thao tác của người làm thí nghiệm … Độ nhạy và tính chuyên biệt cao của phương pháp PCR vừa là ưu điểm vừa là trở ngại của phương pháp này vì có thể cho kết quả âm tính giả do chất lượng hoá chất, primer giảm trong quá trình bảo quản …hay do mầm bệnh mới xuất hiện, lượng tôm nhiễm ít, ngẫu nhiên không có cá thể bệnh trong số tôm làm xét nghiệm. - Phương pháp mô học và IHC: Khả năng phát hiện tế bào nhiễm phụ thuộc rất nhiều vào quá trình đúc mẫu (lượng tôm được vùi trong nến nhiều hay ít, các cá thể được đúc có nhiễm virus hay không, cơ quan đích của virus có nằm gần mặt cắt hay không), chất lượng lát cắt (cắt có đúng vị trí có nhiều mẫu hay không, cơ quan đích của virus có nằm trên lát cắt hay không). Phương pháp IHC (kỹ thuật avidin-biotin complex – ABC) không bằng PCR về độ nhạy (vì không thể khuyếch đại DNA virus) nên không phát hiện mầm bệnh trên 10 mẫu tôm post-larvae. Tuy nhiên, IHC nhờ khả năng hoạt động tốt của kháng thể sơ cấp, kháng thể thứ cấp và HRP nên nếu có mầm bệnh virus với một lượng có ý nghĩa thì chắc chắn sẽ có tín hiệu màu (kháng thể thứ cấp là kháng thể đa dòng sẽ phản ứng với lượng lớn epitope trên kháng thể sơ cấp, từ đó khuyếch đại tín hiệu virus vì nhiều 53 phân tử enzyme được gắn trên một vị trí đích). Với IHC người đọc mẫu dễ dàng nhận biết tế bào nhiễm trên mang và cả trên những cơ quan khác như các phụ bộ gần mang, dạ dày, ruột, biểu mô, cơ quan lymphoid (Hình 4.3, 4.4) do đó phát hiện nhiều cá thể nhiễm và nhiều tế bào nhiễm hơn Mô học (mẫu 12964 và 2794). Phương pháp mô học truyền thống: Tất cả các tế bào nhiễm mầm bệnh đều có những biểu hiện khác biệt (với WSSV, tín hiệu đặc trưng là nhân trương to, tròn và bắt màu tím đậm) (Hình 4.4) nhưng nếu lượng virus nhiễm ít hay ở dạng tiềm ẩn (trên tôm post-larvae) và tế bào nhiễm chưa có biểu hiện đặc trưng rõ ràng thì rất khó xác định chính xác mầm bệnh (có thể nhầm lần với mầm bệnh khác). Ngoài mang là cơ quan đích chủ yếu của WSSV thì mô học truyền thống khó phát hiện được mầm bệnh ở những cơ quan khác. Vì vậy, mô học kém hơn PCR và IHC về độ nhạy. Độ nhạy của phương pháp này phụ thuộc rất nhiều vào khả năng và kinh nghiệm của người đọc mẫu. B.Trên đối tượng tôm thương phẩm: Bảng kết quả (Bảng 4.2) cho thấy trên đối tượng tôm thương phẩm, khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV của cả 3 phương pháp là như nhau. Biểu hiện của tế bào nhiễm khi kiểm nghiệm bằng mô học truyền thống và IHC khá rõ ràng. Với IHC, người đọc mẫu có thể dễ dàng phát hiện tế bào nhiễm ngay cả ở vật kính 10x nhờ biểu hiện màu sắc (nâu) khác biệt rõ với màu nền (tím). Với Mô học truyền thống, phải tập trung hơn mới nhận ra tế bào nhiễm nhưng nhờ lượng tế bào nhiễm nhiều, hình dạng đặc trưng nên cũng không quá khó để nhận ra. Nguyên nhân: Tôm sú thương phẩm khi nhiễm WSSV thường mang một lượng lớn virus do ở tuổi mẫn cảm. Vì vậy lượng tế bào nhiễm nhiều và biểu hiện rất rõ trên mang tôm lớn nên rất dễ nhận biết với PCR, mô học và IHC, khó có sự khác biệt do yếu tố con người. Với tôm sú thương phẩm, mẫu được lấy chủ yếu ở mang và gan tụy. Mang và gan tụy của mỗi cá thể được chia làm hai, mỗi phần được cho vào cồn (PCR) hoặc Davidson (mô học và IHC) để thực hiện xét nghiệm nên không có sự khác biệt do cá thể. 54 Hình 4.3. Tế bào nhiễm WSSV trên các cơ quan khác nhau của tôm sau khi nhuộm IHC Hình A1, A2: Tế bào nhiễm WSSV trên biểu mô tôm thương phẩm (100x), (400x). Hình B1, B2: Tế bào nhiễm WSSV trên phụ bộ tôm post-larvae (100x), (400x). Hình C1, C2: Tế bào nhiễm WSSV trên dạ dày tôm thương phẩm (100x), (400x). A1 A2 B1 B2 C1 C2 55 Hình 4.4. Tế bào nhiễm WSSV sau khi nhuộm bằng IHC và Mô học truyền thống (Hình A và hình B chụp cùng một vị trí trên mẫu 98. Hình C và hình D chụp cùng một vị trí trên mẫu 12964) A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3 56 A1, A2, A3: Mô học–Tế bào nhiễm WSSV trên mang tôm thương phẩm. - Hình A1(100x): Nhân tế bào nhiễm bắt màu hồng tím đậm, nhưng hơi lẫn với màu nền. - Hình A2, A3 (400x, 1000x): Có thể nhận thấy rõ nhân tế bào nhiễm trương to, tròn, màu sắc rõ, đẹp. B1, B2, B3: IHC–Tế bào nhiễm WSSV trên mang tôm thương phẩm. - Hình B1(100x): Tế bào bắt màu nâu đậm, khác biệt rất rõ với màu nền. - Hình B2, B3 (400x, 1000x): Nhìn rõ hình dạng tế bào nhiễm. C1, C2, C3: Mô học–Tế bào nhiễm WSSV trên mang tôm post-larvae. - Hình C1 (100x): Màu nền khá đậm nên khá khó nhận thấy tế bào nhiễm. - Hình C2, C3 (400x, 1000x): Tế bào nhiễm bắt màu rất đẹp, hình dạng đặc trưng và điển hình. Các tế bào nền rõ ràng D1, D2: IHC–Tế bào nhiễm WSSV trên mang tôm post-larvae (100x), (400x). - Hình D1: Màu nền khá đậm, tế bào nhiễm có màu nâu nên dễ lẫn với màu nền. - Hình D2, D3: Nhân tế bào nhiễm bắt màu rất đẹp, sắc nét. [...]... mầm bệnh virus đốm trắng của ba phƣơng pháp PCR, Mô học và IHC trên tôm sú postlarvae và tôm thƣơng phẩm Tôm post-larvae Tôm thƣơng phẩm Kí hiệu PCR Mô học IHC Kí hiệu Mô học IHC 76 83 7787 7661 0 0 2 0 0 0 0 0 0 101 97 98 2 2 2 2 3 7781 7 536 7786 7718 7769 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 99 33 6 34 1 34 2 34 0 2 3 3 3 2 2 2 2 2 2 7768 7764 7684 0 0 0 0 0 0 0 0 0 33 9 33 8 1 03 2 3 2 2 2 2 2 7691 0 0 0 44 3 2 3. .. 55 4 3 2 7722 0 0 0 57 0 0 0 7725 0 0 0 49 0 2682 2 0 0 94 0 2 2741 2 0 0 136 2 0 0 2 0 0 2708 2 0 0 134 0 0 0 31 22 0 0 0 137 0 0 0 2752 2 0 0 135 0 0 0 2745 2 0 0 159 4 3 4 12964 0 2 3 161 0 2794 0 3 4 152 2 0 3 0 3 2746 2 0 0 1 53 4 2 2 7755 3 0 0 156 2 2 2 178 0 0 0 179 0 0 0 181 0 0 0 182 185 0 0 0 0 0 0 PCR 3 73 Phụ lục 4: Bảng ANOVA của nội dung so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng. .. nhau trên 10 mẫu thử nghiệm Kí hiệu Cường độ cảm nhiễm Nơi thu Cường độ bắt màu Độ sắc nét 0,5X 1X 1,5X 2X 0,5X 1X 1,5X 2X 0,5X 1X 1,5X 2X 45P Sóc Trăng 4 5 1 0 c T r ă n g 1 2 1 0 2 3 0 0 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 0 0 0 2 2 2 1 1 2 2 2 0 2 0 2 2 2 2 2 1 2 3 4 2 2 2 3 1 ó 2 2 S 2 2 2 2 2 2 2 4 1 0 0 2 2 2 2 2 2 3 2 4 1 3 2 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 D 1 3 3 3 2 3 3 4 2 3 3 3 Cà Mau 5 1 Sóc Trăng 3 0 3 Cà... Trăng Cà Mau 4 5 9 3 9 C à M a u 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 C à M a u 1 2 2 2 2 2 3 4 1 2 2 3 71 Phụ lục 2: Bảng ANOVA của nội dung so sánh 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb 2.1 Cƣờng độ cảm nhiễm Nguồn biến lượng Tổng các bình Độ tự do Trung bình F P 0 .35 833 33 3.617 0.0258 9 3. 1 138 889 31 . 43 0 2.675 27 0.0990741 31 .775 39 (SOV) phương (SS) (df) bình phương (MS) Nồng độ 1.075 3 Mẫu 28.025 Sai lệch... THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1 Trần Minh Anh, 1989 Đặc điểm sinh học và kỹ thuật nuôi tôm he Nhà xuất bản TP HCM; 39 4 trang 2 Trần Thị Hoàng Dung, 2001 Ứng dụng phương pháp Nested PCR điều tra bệnh đốm trắng trên tôm sú ở một số tỉnh phía nam Khoá luận tốt nghiệp Trường Đai Học Nông Lâm TP HCM; 56 trang 3 Kim Oanh, 2005 Ứng dụng khoa học công nghệ vào nuôi trồng thuỷ sản-Phỏng vấn ông Nguyễn việt... Vietnam Journal of General Virology 8 5: 36 07 -36 18 30 Durand S., Lightner D V., Redman R M and Bonami J R., 1997 Ultrastructure and morphogenesis of white spot syndrome baculovirus (WSSV) Disease of Aquatic Organisms 2 9: 20 5–2 11 31 Faulk W.P., Taylor G.M., 1971 An immunocolloid method for the electron microscope Immunochemistry 8: 1081 – 10 83 32 Flegel T.W., 1997 Major viral diseases of the black tiger prawn... Taiwan Aquaculture 16 4: 221 – 131 92 Wang Y.G., 1995 Managing White Spot Disease in Shrimp INFFISH International 3/ 1998 69 93 Wang Y.G., Shariff M., Suda P.M., Rao P.S.S., Hassan M.D., and Tan L.T., 1998 Managing whitespot disease in shrimp INFOFISH International 3: 30 -36 94 Wang Y.G., Hassan M.D., Shariff M., Zamri S.M and Chen X., 1999 Histopathology and cytopathology of white spot syndrome virus... 68.48 74 4.2 Trên tôm thƣơng phẩm Nguồn biến lượng Tổng các bình Độ tự do Trung bình (SOV) phương (SS) (df) bình phương (MS) Loại kiểm nghiệm 0.55 833 2 Mẫu 129. 533 33 Sai lệch ngẫu nhiên Tổng F P 0.2791667 1.6 53 0.20 23 29 4.4666667 26.442 0 8.10 833 33 48 0.1689 236 138 .2 79 ... năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phƣơng pháp PCR, Mô học và IHC 4.1 Trên tôm post-larvae Nguồn biến lượng Tổng các bình Độ tự do Trung bình (SOV) phương (SS) (df) bình phương (MS) Loại kiểm nghiệm 6.08 2 Mẫu 25.146667 Sai lệch ngẫu nhiên Tổng F P 3. 04 3. 917 0.0266 24 1.0477778 1 .35 0.1854 37 .2 533 33 48 0.7761111 68.48 74 4.2 Trên tôm thƣơng phẩm Nguồn biến lượng Tổng các bình Độ tự do Trung... phương pháp mô học truyền thống và kỹ thuật PCR về độ chính xác, độ nhạy, tính ổn định và tính hiệu quả cho thấy: - Trên đối tượng tôm post-larvae, phương pháp PCR tỏ ra có ưu thế hơn phương pháp IHC và Mô học về khả năng phát hiện mầm bệnh Như vậy PCR có độ nhạy cao hơn (vì trên tôm post-larvae nhiễm virus, lượng virus thường thấp) - Trên đối tượng tôm thương phẩm, khả năng phát hiện mầm bệnh là như . và kỹ thuật nuôi tôm he. Nhà xuất bản TP HCM; 39 4 trang. 2. Trần Thị Hoàng Dung, 2001. Ứng dụng phương pháp Nested PCR điều tra bệnh đốm trắng trên tôm sú ở một số tỉnh phía nam. Khoá luận. + + 7 536 + - - 33 6 ++ + 7786 - - - 34 1 ++ + 7718 - - - 34 2 ++ + 7769 - - - 34 0 + + 7768 - - - 33 9 ++ + 7764 - - - 33 8 + + 7684 - - - 1 03 + +. Thailand. World Journal of Microbiology and Biotechnology 1 3: 433 – 442. 33 . 34 . 64 35 . Flegel T.W., 2000. Overview of PCR probes for shrimp diseases of Penaeus monodon. Molecular Diagnosis