BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khố: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: PHẠM THỊ TUYẾT ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng – 2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS NGUYỄN VĂN HẢO PHẠM THỊ TUYẾT ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng – 2005 ii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ: Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học trƣờng TS Nguyễn Văn Hảo tận tình bảo, hƣớng dẫn giải đáp khó khăn, vƣớng mắc suốt thời gian thực tập tốt nghiệp, giúp tơi hồn thành tốt đề tài tốt nghiệp CN Phạm Văn Điền CN Hứa Đức Quới giúp đỡ tơi hồn thành tốt đề tài TS Lý Thị Thanh Loan ThS Đinh Thị Thủy tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực tập Viện Các anh chị làm việc phịng Mơ Học, phòng Sinh Học Phân Tử phòng Chất Lƣợng Nƣớc Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh giúp đỡ tơi nhiều q trình thực đề tài Cơ Linh, chị Lan thuộc Chi Cục Bảo Vệ Nguồn Lợi Thủy Sản Phú n giúp tơi thu mẫu hồn thành đề tài Các bạn bè thân yêu lớp CNSH K27 chia xẻ vui buồn thời gian học nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ thời gian thực tập Thành phố HCM, tháng năm 2005 Sinh viên Phạm Thị Tuyết Anh iii TÓM TẮT PHẠM THỊ TUYẾT ANH, Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng – 2005 ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION (ISH) ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Giáo viên hƣớng dẫn: TS NGUYỄN VĂN HẢO Đề tài đƣợc thực từ – – 2005 đến 30 – – 2005, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, hai đối tƣợng TSV P vannamei (Postlarvae thƣơng phẩm) WSSV P monodon (Postlarvae thƣơng phẩm) Hai loại virus có mức độ nguy hiểm khả tạo dịch bệnh lớn tôm ni Việt Nam Do đó, chúng tơi sử dụng phƣơng pháp In Situ hybridization (ISH) hay lai chỗ nhằm mục tiêu phát nhanh xác mẫu tơm nhiễm bệnh Taura đốm trắng, để có biện pháp xử lý kịp thời, góp phần phịng ngừa lây lan bùng phát hai loại dịch bệnh Đề tài gồm thí nghiệm sau: Các thí nghiệm P vannamei Thí nghiệm theo quy trình chuẩn kit để ổn định phƣơng pháp ISH chẩn đoán TSV P vannamei Sau thực thí nghiệm này, chúng tơi nhận thấy phƣơng pháp ISH đƣợc ứng dụng hiệu chẩn đoán TSV P vannamei Thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ƣu áp dụng điều kiện phịng thí nghiệm Viện, gồm thí nghiệm nhỏ sau:  Thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ƣu, thực nghiệm thức Kết nhiệt độ biến tính mẫu theo nghiệm thức thứ ba (probe đƣợc biến tính trƣớc 950C 10 phút, làm lạnh nhanh giữ 40C; lai cho dung dịch lai có probe biến tính lên mẫu thực biến tính mẫu 700C phút, sau ủ mẫu qua đêm 420C) tốt postlarvae tơm thƣơng phẩm  Thí nghiệm tìm thời gian cắt tối ƣu với Proteinase K, thực nghiệm thức: 11 phút, 13 phút, 15 phút, 17 phút 19 phút Kết thời gian cắt với Proteinase K tối ƣu postlarvae 15 phút tơm thƣơng phẩm 17 phút  Thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp, thực nghiệm thức: 100µl, 75µl 50µl Kết thể tích dung dịch lai thích hợp tơm postlarvae tơm thƣơng phẩm 75µl Các thí nghiệm P monodon Thí nghiệm theo quy trình chuẩn kit để ổn định phƣơng pháp ISH chẩn đoán WSSV P monodon Sau thực thí nghiệm này, nhận thấy iv phƣơng pháp ISH đƣợc ứng dụng hiệu chẩn đoán WSSV P monodon Thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ƣu áp dụng điều kiện phịng thí nghiệm Viện, gồm thí nghiệm nhỏ sau:  Thí nghiệm thay đổi số hóa chất thơng dụng nhƣ cồn tuyệt đối, xylene paraformaldehyde Việt Nam Trung Quốc sản xuất, nhằm giảm chi phí chẩn đốn Kết thí nghiệm cho thấy khơng có khác biệt so với thí nghiệm dùng hóa chất nhƣ kit khuyến cáo sử dụng  Thí nghiệm dùng quy trình xử lý mẫu nhanh: thực tôm postlarvae thƣơng phẩm, kết lai thực theo quy trình khơng khác với kết lai theo quy trình chuẩn  Thí nghiệm biến tính mẫu probe đồng thời lame trƣớc lai: thực tôm postlarvae thƣơng phẩm thu đƣợc kết không khác với kết lai theo quy trình chuẩn  Thí nghiệm kết hợp xử lý mẫu nhanh với biến tính probe mẫu đồng thời lame: thực tôm postlarvae thƣơng phẩm thu đƣợc kết không khác với kết lai theo quy trình chuẩn Thí nghiệm so sánh phƣơng pháp ISH với mơ học PCR Thí nghiệm đƣợc thực P vannamei (postlarvae tôm thƣơng phẩm) P monodon (postlarvae tôm thƣơng phẩm) Kết thí nghiệm cho thấy phƣơng pháp ISH có độ ổn định, độ xác nhạy mơ học PCR Từ kết thực nghiệm nhƣ trên, chúng tơi đƣa quy trình ISH có độ nhạy, độ ổn định, độ xác cao thời gian chẩn đoán nhanh, đáp ứng đƣợc việc kiểm tra mầm bệnh WSSV TSV gây tơm ni điều kiện phịng thí nghiệm hệ thống nuôi tôm Việt Nam v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa i Trang tựa ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt xi Danh sách hình sơ đồ xii Danh sách bảng xiv CHƢƠNG I: GIỚI THIỆU I.1 Đặt vấn đề I.2 Mục tiêu đề tài I.3 Yêu cầu đề tài I.4 Nội dung đề tài CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU II.1 Tình hình ni tơm giới II.1.1 Hiện trạng chung II.1.2 Các hình thức nuôi II.1.3 Tình hình dịch bệnh tôm giới II.2 Tình hình ni tơm Việt Nam II.2.1 Hiện trạng chung II.2.2 Các mơ hình ni tơm đƣợc áp dụng II.2.3 Tình hình dịch bệnh tơm Việt Nam II.3 Một số đặc điểm sinh học tôm sú thẻ chân trắng II.3.1 Vị trí phân loại tơm sú P monodon tôm thẻ chân trắng P vannamei II.3.2 Đặc điểm phân bố tôm sú thẻ chân trắng vi II.3.2.1 Đặc điểm phân bố tôm sú II.3.2.2 Đặc điểm phân bố tôm thẻ chân trắng II.3.3 Vòng đời phát triển tôm sú thẻ chân trắng II.3.3.1 Vòng đời phát triển tôm sú II.3.3.2 Vòng đời phát triển tôm thẻ chân trắng II.3.4 Dinh dƣỡng II.3.4.1 Dinh dƣỡng tôm sú II.3.4.2 Dinh dƣỡng tôm thẻ chân trắng II.3.5 Các yếu tố môi trường tối ưu cho tôm sú thẻ chân trắng phát triển II.4 Bệnh đốm trắng (White spot desease – WSD) bệnh Taura (Taura syndrome TS) II.4.1 Bệnh đốm trắng WSD II.4.1.1 Tác nhân gây bệnh II.4.1.2 Dấu hiệu bệnh lý 11 II.4.1.3 Lịch sử phân bố lan truyền bệnh 11 II.4.1.4 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh 12 II.4.1.5 Phòng bệnh 12 II.4.2 Hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) 12 II.4.2.1 Tác nhân gây bệnh 12 II.4.2.2 Dấu hiệu bệnh lý 13 II.4.2.3 Phân bố lan truyền bệnh 14 II.4.2.4 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh 14 II.4.2.5 Phòng trị bệnh 14 II.5 PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION 14 II.5.1 Sơ lƣợc phƣơng pháp In situ hybridization 14 II.5.2 Khái niệm lai phân tử 15 II.5.3 Cơ sở lai phân tử 16 II.5.3.1 Khái niệm nhiệt độ nóng chảy DNA 16 II.5.3.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nhiệt độ nóng chảy DNA 16 II.5.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến lai phân tử 17 vii II.5.5 Probe 17 II.5.5.1 Khái niệm 17 II.5.5.2 Các loại probe 18 II.5.5.3 Các phƣơng pháp đánh dấu probe 18 II.5.5.4 Các tác nhân đánh dấu probe cách phát phân tử lai 19 II.5.6 Các phƣơng pháp lai chỗ ISH 23 II.5.6.1 Lai khuẩn lạc 23 II.5.6.2 Lai nhiễm sắc thể 23 II.5.6.3 Lai tế bào mô 24 II.5.7 Ứng dụng chủ yếu ISH 25 II.5.8 Một số nghiên cứu trƣớc bệnh đốm trắng, bệnh Taura ứng dụng phƣơng pháp ISH chẩn đoán mầm bệnh vật nuôi thủy sản 25 II.5.8.1 Một số nghiên cứu trƣớc bệnh đốm trắng Taura 25 II.5.8.2 Ứng dụng phƣơng pháp ISH chẩn đoán mầm bệnh động vật nuôi thủy sản 26 II.5.9 Xu hƣớng phát triển phƣơng pháp 26 CHƢƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 27 III.1 Thời gian địa điểm thí nghiệm 27 III.2 Vật liệu sinh học 27 III.3 Hóa chất thí nghiệm 27 III.3.1 Hóa chất có sẵn kit chẩn đốn DiagXotics Mỹ 27 III.3.2 Hóa chất cần thiết nhƣng khơng có kit chẩn đoán 28 III.4 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 28 III.4.1 Thiết bị thí nghiệm 28 III.4.2 Dụng cụ thí nghiệm 29 III.5 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm theo quy trình kit 29 III.5.1 Chuẩn bị hóa chất 29 III.5.2 Chuẩn bị mẫu 30 III.5.2.1 Cố định mẫu 30 viii III.5.2.2 Cách xử lý mẫu 30 III.5.2.3 Đúc mẫu paraffin 31 III.5.2.4 Cắt mẫu 31 III.5.3 Quy trình chẩn đốn theo kit 31 III.5.3.1 Ngày thứ 31 III.5.3.2 Ngày thứ hai 32 III.6 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 III.6.1 Phƣơng pháp thu mẫu 34 III.6.2 Bố trí thí nghiệm 34 III.6.2.1 Phƣơng pháp ISH để chẩn đoán virus Taura TSV tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei 35 III.6.2.2 Phƣơng pháp ISH để chẩn đoán virus đốm trắng WSSV tôm sú Penaeus monodon 36 III.6.2.3 Bố trí thí nghiệm so sánh phƣơng pháp ISH với mô học PCR 39 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 IV.1 Kết tôm thẻ chân trắng P vannamei 41 IV.1.1Thí nghiệm thử nghiệm khả phát TSV phƣơng pháp ISH 41 IV.1.2 Kết thí nghiệm ổn định phƣơng pháp ISH P vannamei 43 IV.1.2.1 Kết thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ưu lai 43 IV.1.2.2 Kết thí nghiệm xác định thời gian cắt thích hợp với Proteinase K 46 IV.1.2.3 Kết thí nghiệm tìm thể tích dung dịch lai thích hợp 49 IV.2 Kết tôm sú P monodon 52 IV.2.1 Kết thí nghiệm theo quy trình kit để ổn định phƣơng pháp 52 IV.2.2 Kết ứng dụng kit để tìm quy trình ISH tối ƣu cho WSSV áp dụng phịng thí nghiệm 54 IV.2.2.1 Kết thí nghiệm theo quy trình kit nhƣng có thay đổi số hóa chất thơng dụng khơng có kit 54 IV.2.2.2 Trƣờng hợp xử lý mẫu nhanh 56 IV.2.2.3 Trƣờng hợp biến tính mẫu probe trƣớc lai 59 ix IV.2.2.4 Trƣờng hợp kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu probe trƣớc lai 61 IV.3 Kết thí nghiệm so sánh ISH với mô học PCR 65 IV.3.1 Kết Penaeus vannamei 65 IV.3.1.1 Kết tôm postlarvae 65 IV.3.1.2 Kết tôm thƣơng phẩm 66 IV.3.2 Kết Penaeus monodon 68 IV.3.2.1 Đối tôm postlarvae 69 IV.3.2.2 Đối với tôm thƣơng phẩm 70 IV.5 Nhận xét chung 73 IV.6 Những thuận lợi khó khăn 74 IV.6.1 Thuận lợi 74 IV.6.2 Khó khăn 74 IV.7 Ƣu nhƣợc điểm phƣơng pháp In situ hybridization 75 IV.7.1 Ƣu điểm 75 IV.7.2 Nhƣợc điểm 75 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76 V.1 Kết luận 76 V.1.1 Phƣơng pháp In Situ hybridization chẩn đoán mầm bệnh TSV P vannamei 76 V.1.2 Phƣơng pháp In Situ hybridization chẩn đoán mầm bệnh WSSV P monodon 76 V.2 Đề nghị 77 CHƢƠNG VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 x II.2.2 Các mơ hình ni tơm đƣợc áp dụng Hiện nay, nƣớc ta áp dụng hình thức ni tôm giới nhƣ nuôi quảng canh, quảng canh cải tiến, ni bán thâm canh thâm canh Ngồi nƣớc ta phát triển hình thức ni sinh thái: ni tơm – rừng, tơm – lúa…Trong đó, hình thức ni quảng canh đƣợc áp dụng phổ biến Việt Nam, đặc biệt vùng ĐBSCL (Vũ Đỗ Quỳnh, 1992) II.2.3 Tình hình dịch bệnh tơm Việt Nam Tại Việt Nam, từ cuối năm 1993 dịch bệnh tơm đƣợc báo động tồn quốc, thiệt hại lớn tỉnh ĐBSCL nhƣ Trà Vinh, Bến Tre, Sóc Trăng, Minh Hải, Kiên Giang, Tiền Giang, Long An…Ở tỉnh tôm nuôi bị bệnh chết hàng loạt môi trƣờng nuôi bị nhiễm bẩn, thời tiết diễn biến phức tạp, nguồn giống chƣa đảm bảo chất lƣợng (Phan Lƣơng Tâm, 1994) Tính đến 30 – – 1994, tổng diện tích ni tơm bị chết 84.850 với thiệt hại ƣớc tính 5.520 trị giá 294 tỷ đồng (Bùi Quang Tề, 1995) Năm 1995, sản lƣợng tôm nuôi Việt Nam 50.000 giảm 30.000 năm 1997 (World Shrimp Farming, 1997) Theo Ts Nguyễn Văn Hảo ctv năm 1997, tác nhân gây bệnh tơm ni vùng ĐBSCL ngồi nhóm Vibrios cịn có xuất hai tác nhân Virus gây bệnh quan trọng MBV (Monodon Baculovirus) WSSV (White Spot Syndrome Virus) Tác nhân gây bệnh virus đƣợc xem tác nhân gây bệnh nghiêm trọng nhất, việc chữa trị bệnh virus khơng hiệu chƣa có loại thuốc hay hóa chất chữa bệnh virus (Ts Nguyễn Văn Hảo, 2000) Từ năm 1996 – 1997, bệnh đốm trắng xuất khắp vùng ni tơm biển từ Hải Phịng đến tỉnh miền Trung, tỉnh ven biển Nam Bộ Bệnh đốm trắng gây thiệt hại lớn cho nghề ni tơm biển Việt Nam chúng lan truyền nhanh qua nguồn nƣớc, đƣờng tiêu hóa…với tỷ lệ chết 90 – 100% (Bùi Quang Tề, 1998) II.3 Một số đặc điểm sinh học tôm sú thẻ chân trắng II.3.1 Vị trí phân loại tôm sú P monodon tôm thẻ chân trắng P vannamei Đối với tôm sú Ngành chân đốt: Arthropoda Lớp giáp xác: Crustacea Lớp phụ: Malacostraca Bộ: Decapoda Bộ phụ: Natantia Họ chung: Penaeidea Họ: Penaeidea Giống: Penaeus Loài: Penaeus monodon Fabricius 1798 Tên tiếng Anh phổ biến Giant Tiger Prawn, tên tiếng Pháp Crevette geante Tigre, tên tiếng Australia Jumbo Prawn…Ở Việt Nam P monodon đƣợc gọi tơm sú Vị trí phân loại TCT giống nhƣ tôm sú nhƣng khác TCT thuộc loài Penaeus vannamei Boone Tên thƣờng gọi tơm bạc Thái Bình Dƣơng, Camaron blanco, Whiteleg shrimp Tên FAO Camaron patiblanco Tên Việt Nam tôm chân trắng, tôm he chân trắng (Theo hệ thống phân loại Hoilthus, 1989) II.3.2 Đặc điểm phân bố tôm sú thẻ chân trắng II.3.2.1 Đặc điểm phân bố tôm sú Phân bố ngang: Tôm sú P monodon phân bố rộng rãi Ấn Độ Dƣơng Ở Thái Bình Dƣơng, tơm sú phân bố phía Bắc tới Nhật Bản, Đài Loan; phía Đơng tới Tahiti; phía Nam tới Úc vùng biển phía Đơng Châu Phi Theo Motoh (1981), tôm sú phân bố từ kinh độ 300 Đông tới 1500 Đông từ vĩ độ 350 Bắc đến 350 Nam nhƣng tập trung chủ yếu nƣớc nhiệt đới, đặc biệt Indonesia, Malaisia, Philippine Ở Việt Nam, tôm sú phân bố hầu hết vùng ven biển từ Quảng Ninh đến Kiên Giang nhƣng mật độ tập trung cao vùng biển từ Đà Nẵng đến Khánh Hòa (Trần Minh Anh,1989) Phân bố thẳng: Giai đoạn ấu trùng ấu niên P monodon sống nổi, thích nghi sống đáy Ở vùng cửa sông, tôm ấu niên thiếu niên sống tầng mặt, phần lớn tôm trƣởng thành sống mực nƣớc sâu khoảng 70 m Ở khơi Philippine, vịnh Thái Lan 30 – 39 m nhiệt độ 340C độ mặn 35‰ (Trần Minh Anh, 1989) II.3.2.2 Đặc điểm phân bố tơm thẻ chân trắng TCT hay cịn gọi tôm chân trắng Nam Mỹ, đƣợc phân bố tự nhiên từ nƣớc ven bờ Thái Bình Dƣơng, Châu Mỹ - từ Mehico đến miền trung Peru, nhiều vùng biển Ecuador II.3.3 Vịng đời phát triển tơm sú thẻ chân trắng II.3.3.1 Vòng đời phát triển tôm sú Trong thiên nhiên, tôm sú sinh sản biển Khi tới mùa sinh sản, tôm di cƣ vùng biển sâu có độ mặn cao để đẻ trứng Trứng nở ấu trùng trải qua ba giai đoạn: Nauplius, Zoea Mysis Ấu trùng theo sóng biển dạt vào cửa sơng, nơi có nƣớc biển nƣớc sông pha trộn lẫn nên độ mặn thấp ngồi biển nên thích hợp cho phát triển ấu trùng Ngƣời ta gọi vùng nƣớc lợ, có độ mặn từ 13 30‰ Tại môi trƣờng nƣớc lợ, ấu trùng larvae chuyển sang thời kỳ hậu ấu trùng Postlarvae Sau hậu ấu trùng chuyển sang thời kỳ ấu niên Juvenile đồng thời bơi biển tiếp tục tăng trƣởng, sinh sản tiếp diễn chu kỳ sống (Vũ Thế Trụ, 1994) II.3.3.2 Vịng đời phát triển tơm thẻ chân trắng Q trình phát triển tơm TCT trải qua sáu giai đoạn Nauplius kéo dài 1,5 ngày, ba giai đoạn Zoea kéo dài ngày, ba giai đoạn Mysis kéo dài ngày cuối Postlarvae Sau giai đoạn postlarvae tôm chuyển sang giai đoạn ấu niên Juvenile tiếp diễn chu kỳ sống (Thái Bá Hồ Ngô Trọng Lƣ, 2003) Tôm TCT linh hoạt nhạy cảm với biến đổi môi trƣờng sống TCT thành thục ao ni, ƣu điểm lồi tơm so với lồi tơm khác việc chủ động nguồn tôm bố mẹ giống thả nuôi II.3.4 Dinh dƣỡng II.3.4.1 Dinh dưỡng tôm sú Tôm sú giai đoạn ấu trùng Zoea ăn thực vật phù du với hai giống tảo Silic thích hợp Chaetoceros Skeletonema Giai đoạn Mysis chuyển sang ăn số loài động vật phù du, luân trùng ấu trùng Artemia Giai đoạn postlarvae tôm ăn giun nhiều tơ, ấu trùng tôm, cua, nhuyễn thể, mùn bả hữu (Apud, 1984) Tôm sú lồi ăn tạp, đặc biệt tơm sú trƣởng thành thích ăn giáp xác, sản phẩm thực vật, giun nhiều tơ, nhuyễn thể, cá, côn trùng (Hal, 1962) II.3.4.2 Dinh dưỡng tơm thẻ chân trắng TCT lồi tơm ăn tạp Giống nhƣ lồi tơm he khác, thức ăn cần thành phần protid, lipid, glucid, vitamin muối khống…Giai đoạn Nauplus khơng cần cho ăn, chúng tự ni nỗn hồng có sẵn Giai đoạn Zoea, tôm ăn thực vật phù du đặc biệt loại tảo khuê Giai đoạn Mysis, tôm ăn thực vật phù du lẫn động vật phù du Khả chuyển hóa thức ăn tơm cao, điều kiện ni lớn bình thƣờng, lƣợng cho ăn cần 5% thể trọng tôm (Thái Bá Hồ, Ngô Trọng Lƣ, 2003) Trong thời kỳ tôm sinh sản, lƣợng thức ăn hàng ngày tăng lên gấp – lần II.3.5 Các yếu tố môi trƣờng tối ƣu cho tôm sú thẻ chân trắng phát triển Bảng 2.1: Các thông số tối ƣu cho tôm phát triển STT Các thông số tối ƣu Penaeus monodon Penaeus vannamei pH 7,7 – 8,5 7–9 Nhiệt độ 250C – 300C 260C – 300C Oxy hòa tan mg/l > mg/l Nitrite < 0,1 mg/l < 0,1 mg/l Độ mặn 15 – 25‰ 15 – 28‰ (Theo Chanratchakook P., 1995 Brock J.A., Main K.L., 1994) II.4 Bệnh đốm trắng (White spot desease – WSD) bệnh Taura (Taura syndrome TS) II.4.1 Bệnh đốm trắng WSD II.4.1.1 Tác nhân gây bệnh (a) Phân loại Trƣớc năm 2002, có ba chủng Baculovirus gây bệnh đốm trắng hay gọi virus Trung Quốc Tùy nƣớc nghiên cứu mà chúng có tên gọi kích thƣớc khác Bảng 2.2: Các tên gọi khác virus gây bệnh đốm trắng Tên virus Kích thƣớc virus Kích thƣớc nhân Virus Trung Quốc (HHNBV) 120 x 360 nm Virus Nhật ( RVPJ – 1) 84 x 226 nm Virus Nhật ( RV – PJ – 2) 83 x 275 nm 54 x 126 nm Virus đốm trắng Thái Lan 121 x 276 nm 89 x 201 nm 70 –150 x 350 –380 nm 58 – 67 x 330 – 350 nm (SEMBV) Virus bệnh đốm trắng (WSBV) (Theo Bùi Quang Tề, 2003) Virus gây bệnh đốm trắng WSSV đƣợc phân loại thuộc họ Baculovirdae (Francki ctv, 1991) Tuy nhiên, phân tích trình tự hệ gen WSSV gần cho thấy chúng mã hóa số loại protein khơng giống protein Baculovirus nhƣ protein ribonucleotide reductase (RR1 RR2) (van Hulten ctv, 2000) Protein capsid (VP26, VP28) (van Hulten ctv, 2000) WSSV khơng giống protein database Ngồi ra, trình tự nucleotide tồn hệ gen WSSV cho thấy nhiều gen khơng giống gen virus khác (van Hulten ctv, 2001; Yang ctv, 2001) Sự khác biệt genome phổ kí chủ rộng WSSV (Flegel, 1997) chứng tỏ WSSV đại diện cho họ virus (van Hulten ctv, 2000) Trong Hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (Paris, 2002), tác giả Just M Vlak, Jean-Robert Bonami, Tim W Flegel, Guang-Hsiung Kou, Donald V Lightner, Chu-Fang Lo, Philip C Loh Peter J Walker phân loại virus gây hội chứng đốm trắng thành giống Whispovirus thuộc họ Nimaviridae 10 (b) Hình thái Virus dạng hình trứng, kích thƣớc 120 x 275 nm, có phụ đầu kích thƣớc 70 x 300 nm (Woongteerasupaya C ctv, 1995; Wang ctv, 1995) C Hình 2.1: Virus WSSV gây bệnh đốm trắng A – Hình thái WSSV phóng to kính hiển vi điện tử, X100 B – Nuclecapside WSSV kính hiển vi điện tử, X100 C – WSSV nhuộm âm huyết tƣơng tôm sú bị đốm trắng (Theo Vlak ctv, 2002) (c) Cấu trúc protein vật chất di truyền Hạt virus cấu trúc bao gồm phần: bao màng (envelope), nucleocapside vật chất di truyền Virion chứa protein chính: VP28, VP26, VP24, VP19, VP15 có trọng lƣợng phân tử tƣơng ứng 28, 26, 24, 19 15 kDa Hiện virus WSSV đƣợc giải mã trình tự hồn chỉnh (Yang ctv, 2001) Genome WSSV DNA vịng kép lớn, kích thƣớc thay đổi tùy theo mẫu phân lập từ vị trí địa lí khác (d) Phổ ký chủ Phổ ký chủ rộng, chủ yếu loại tôm: P monodon, P vannamei, P indicus, P japonicus,…các loại cua động vật thủy sinh khác (theo V.A Graindorge T.W Flegel, 1999) (e) Cơ chế xâm nhiễm Khi xâm nhập vào tôm virus cƣ trú nhiều phận tơm nhƣ nội bì, mơ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn, hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi phận khác Sau xâm nhập vào tế bào chủ, virus tiến hành tự nhân dựa sở vật chất nguyên liệu tế bào Quá trình làm cho số lƣợng virus tăng lên nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình thƣờng tế bào Virus tiếp tục 11 phát triển đến giai đoạn làm vỡ nhân giết chết tế bào, sau virus đƣợc phóng thích mơi trƣờng nƣớc, tìm ký chủ khác tiếp tục xâm nhập, cơng Nếu nhƣ virus khơng tìm đƣợc ký chủ sống tự nƣớc khoảng 24 II.4.1.2 Dấu hiệu bệnh lý Tơm nhiễm bệnh có màu hồng đến màu nâu đỏ (Guang Hsiung ctv, 1998) Bên vỏ giáp xác xuất đốm trắng đƣờng kính từ 0,5 – 2,0 mm Các đốm trắng lắng đọng muối canxi lớp biểu bì mặt lớp vỏ kitin, đốm Hình 2.2: Tơm sú bị nhiễm bệnh đốm trắng trắng xuất vỏ giáp (carapace) đốt bụng thứ V, VI Gan tụy trƣơng to có màu trắng vàng Tơm có biểu bỏ ăn, lờ đờ hoạt động, thƣờng có khuynh hƣớng cặp mé bờ, sau chết chìm xuống đáy (Y G Wang ctv, 1998) Tơm bệnh có dấu hiệu trƣơng nhân tế bào bị nhiễm (Chou ctv, 1995) Bệnh đốm trắng xảy kèm theo tiêu thụ thức ăn giảm nhanh (Takahashi ctv, 1994) Một vài trƣờng hợp, tôm trạng thái hấp hối thƣờng chuyển sang màu đỏ hồng, tỷ lệ chết lên đến 90 – 100% vịng – ngày nhiễm bệnh (Feng Yang ctv, 2001) II.4.1.3 Lịch sử phân bố lan truyền bệnh Phân bố: Bệnh đốm trắng WSD (white spot disease) xuất lần đầu Bắc Á vào năm 1992 – 1993, đồng thời nhanh chóng lan rộng khắp khu vực Châu Á giới nƣớc có hình thức nuôi tôm công nghiệp thâm canh Bệnh đốm trắng đƣợc thông báo Trung Quốc, đầm nuôi tôm sú với tỷ lệ chết cao (Chen, 1989) Năm 1992 – 1993, bệnh đốm trắng xuất Thái Lan (Flegel T.W, 1996) Năm 1993, Nhật Bản nhập tôm Trung Quốc nuôi xuất bệnh đốm trắng Năm 1994, có báo cáo từ Ấn Độ, Trung Quốc, Indonesia, Nhật Bản Thái Lan, tìm nguyên nhân gây bệnh đốm trắng Trong năm gần bệnh đốm trắng thƣờng xuyên xuất khu vực nuôi tôm ven biển Việt Nam, hầu hết tỉnh tôm bị nhiễm bệnh đốm trắng tơm chết hàng loạt gây tổn thất lớn cho nghề nuôi tôm 12 Truyền bệnh: Bệnh đốm trắng lây truyền chủ yếu theo chiều ngang Virus lây từ giáp xác khác nhiễm bệnh đốm trắng từ mơi trƣờng bên ngồi ao ao ni tơm Bệnh đốm trắng khơng có khả lây lan theo đƣờng thẳng đứng, nỗn bào (trứng) phát chúng bị nhiễm virus đốm trắng chúng khơng chín đƣợc (Bùi Quang Tề, 2003) Nhƣng q trình đẻ trứng tơm mẹ thải virus đốm trắng từ buồng trứng chúng, ấu trùng tơm dễ dàng nhiễm virus từ giai đoạn sớm II.4.1.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh Dựa dấu hiệu bệnh đặc trƣng xuất đốm trắng dƣới vỏ phân lập vi khuẩn gây bệnh tôm bị đỏ thân Chẩn đốn phƣơng pháp mơ bệnh học, quan sát nhân tế bào biểu bì dƣới vỏ, tế bào biểu bì tuyến anten, tế bào quan bạch huyết, quan tạo máu, tổ chức liên kết vỏ… Khi nhuộm Hematoxylin Eosin, nhân tế bào có thể vùi (inclusion body) lớn, bắt màu đỏ đồng Chẩn đoán phƣơng pháp PCR, Enzyme miễn dịch II.4.1.5 Phịng bệnh Hiện chƣa có biện pháp điều trị hữu hiệu bệnh đốm trắng tơm, phòng bệnh chủ yếu Để phòng đƣợc bệnh đốm trắng tơm, ta áp dụng phƣơng pháp phịng bệnh tổng quát sau:  Lựa chọn Postlarvae khỏe mạnh không mang mầm bệnh (kiểm tra mô học, PCR, sốc formalin)  Chẩn đốn xác, kịp thời, kiểm sốt dịch bệnh, đặc biệt giai đoạn tơm mẫn cảm với virus đốm trắng  Quản lý tốt ao ni để phịng bệnh  Khi phát bệnh tốt thu hoạch II.4.2 Hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) II.4.2.1 Tác nhân gây bệnh Tác nhân gây hội chứng Taura Syndrome Virus (TSV) hay Picornavirus thuộc họ Picornaviridae (Bonami ctv, 1997) Virus hình cầu có 20 mặt, đƣờng kính 30 – 32 nm, hệ thống gen RNA mạch đơn có chiều dài 10,2 kb, cấu 13 trúc capsid có ba phần (55, 40 24kD) đoạn polypeptide (phụ 58kD) tƣơng ứng với ký hiệu VP1, VP2, VP3 VP4 Virus ký sinh tế bào biểu mô dƣới biểu mơ Ký chủ chính: P vannamei, P setiferus, P stylirostris (theo V.A Graindorge T.W Flegel, 1999), loài tôm nhiễm thực nghiệm nhƣ P aztecus, P duorarum (Lightner, 1996; Overstreet ctv, 1997) II.4.2.2 Dấu hiệu bệnh lý Bệnh Taura có ba giai đoạn chính: cấp tính, chuyển tiếp mãn tính đƣợc phân biệt rõ tơm bị nhiễm bệnh Giai đoạn cấp tính: tơm yếu, lờ đờ, đuôi tôm phồng chuyển màu đỏ, mềm vỏ ruột khơng có thức ăn Giai đoạn chuyển tiếp: tơm yếu, có nhiều đốm đen thể biểu bì bị hoại tử, tơm có khơng có dấu hiệu phồng đuôi chuyển sang màu đỏ Ở hai giai đoạn này, virus ký sinh tổ chức trung bì ngoại bì Biểu mơ biểu bì bị ảnh hƣởng nặng giai đoạn cấp tính Giai đoạn mãn tính: thể có đốm đen nhƣng ít, virus ký sinh tổ chức lympho A B C Hình 2.3: Tơm bị nhiễm virus Taura TSV Hình A – tơm nhiễm giai đoạn cấp tính Hình B – tơm nhiễm TSV cấp tính đƣợc phóng to Hình C – tơm nhiễm TSV giai đoạn mãn tính Tơm P vannamei giai đoạn nhiễm cấp tính thƣờng có tỷ lệ chết cao nhƣng tơm P stylirostris bị nhiễm bệnh nhƣng có khả kháng lại virus gây bệnh Mơ biểu bì dƣới biểu 14 mô tế bào nhiễm virus bị hoại tử, tế bào chất bắt màu hồng có chứa nhân kết đặc phân mảnh Đặc điểm quan trọng tế bào chất biểu bì chuyển màu hồng xanh nhạt II.4.2.3 Phân bố lan truyền bệnh Phân bố: Bệnh TSV lần phát tôm P vannamei nuôi Ecuador (6 – 1992) Ngay sau phát hiện, mầm bệnh nhanh chóng lan rộng sang nƣớc nuôi tôm Tây Bán Cầu nhƣ Peru, Colombia, Honduras, Guatemala, El Salvador, Brazil, tây Mexico bang Châu Mỹ nhƣ Hawaii, Florida, Texas Nam Carolina (Lightner, 1996) Hội chứng Taura thƣờng xảy tôm P vannamei giai đoạn nuôi từ 14 – 40 ngày nuôi ao bể ƣơng Bệnh TSV thƣờng gặp tôm giống cỡ nhỏ từ 0,05 – 5,0 gram, tôm lớn xuất Nếu giai đoạn đầu bệnh chƣa phát giai đoạn giống lớn thƣơng phẩm bệnh xảy Bệnh TSV gây chết từ 40 – 90% tổng số tôm nuôi ao (Bùi Quang Tề, 2003) Truyền bệnh: bệnh TSV lan truyền theo chiều ngang chiều thẳng đứng II.4.2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh Phƣơng pháp truyền thống gồm phƣơng pháp sau: dấu hiệu lâm sàng, mô học xét nghiệm sinh học Phƣơng pháp kháng thể đơn dòng xét nghiệm ELISA Phƣơng pháp RT – PCR (Reverse – transcription polymerase chain reaction) II.4.2.5 Phòng trị bệnh Áp dụng phƣơng pháp phòng bệnh tổng hợp tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp phòng bệnh virus đốm trắng II.5 PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION II.5.1 Sơ lƣợc phƣơng pháp In situ hybridization Phƣơng pháp In Situ hybridization (ISH) đƣợc phát vào năm 1969 công Gall Pardue Đây phƣơng pháp lai phân tử nhằm phát trình tự acid nucleic đặc hiệu nằm tế bào mô cách lai mẫu tế bào với mẫu dò (probe) RNA cDNA đƣợc 15 đánh dấu đồng vị phóng xạ hay phƣơng pháp hóa học (John ctv, Gall Pardue, 1969) Lai chỗ cho phép nghiên cứu nucleic acid mà không cần qua giai đoạn trung gian tách chiết chúng khỏi tế bào hay mô Giống với phƣơng pháp Northern Southern blot, ISH xác định đƣợc diện RNA DNA đặc biệt đó, nhƣng ISH khác với hai phƣơng pháp nhờ probe đƣợc đánh dấu nên ta xác định vị trí RNA DNA diện vị trí xác định tế bào Từ đời ISH trở thành công cụ quan trọng để phát mRNA Trong tế bào có nhiều dạng mRNA biểu mức độ cao nhƣng số lƣợng mRNA có chức tồn với số lƣợng thấp (Hahn ctv, 1982) Vì phƣơng pháp ISH có độ nhạy độ đặc hiệu cao nên phát đƣợc mRNA với số lƣợng thấp tế bào nhƣ phát đƣợc mRNA mức độ khác tế bào khác Các ứng dụng kiểu lai đa dạng từ kỹ thuật định vị gen nhiễm sắc thể, phát dòng vi khuẩn tái tổ hợp phƣơng pháp tạo dòng đến việc nghiên cứu mRNA chuyên biệt tế bào mô II.5.2 Khái niệm lai phân tử Lai phân tử tƣợng tái bắt cặp trở lại hai mạch đơn nhiệt độ xung quanh giảm từ từ điều kiện thí nghiệm thích hợp Sau hai mạch phân tử DNA tách rời dƣới tác động Tm, bắt cặp không xảy nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột, lúc phân tử DNA tồn mơi trƣờng dạng mạch đơn với cấu hình khơng gian vô trật tự Ngƣợc lại, sau hai mạch phân tử tách rời, nhiệt độ đƣợc làm giảm từ từ điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch bắt cặp trở lại tạo nên tƣợng lai Lai phân tử có hai đặc điểm sau:  Đặc hiệu tuyệt đối: Sự tái bắt cặp xảy hai trình tự hồn tồn bổ sung chúng có hai nằm lẫn hàng triệu trình tự khác  Các trình tự bổ sung DNA hay RNA nên hình thành phân tử DNA – DNA, DNA – RNA hay RNA – RNA 16 II.5.3 Cơ sở lai phân tử II.5.3.1 Khái niệm nhiệt độ nóng chảy DNA Khi phân tử DNA mạch đôi đƣợc đun lên nhiệt độ vƣợt nhiệt độ nóng chảy Tm hai mạch tách rời nhau, phá vỡ liên kết hydro nối liền hai mạch Sự chuyển từ mạch đôi sang mạch đơn xảy đột ngột nhiệt độ dao động xung quanh Tm tính cộng hƣởng phản ứng Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn đƣợc xác định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị mật độ quang OD bƣớc sóng 260 nm Giá trị mật độ quang tăng lên phân tử mạch đôi chuyển thành dạng mạch đơn, tƣợng gọi “hiện tƣợng siêu sắc” Nguyên nhân tƣợng phân tử DNA mạch đôi, base nằm chồng lên mặt phẳng song song, cấu trúc che lắp phần base khiến chúng không hấp thụ ánh sáng Khác với DNA mạch đôi, DNA mạch đơn hai mạch DNA đƣợc tách rời nên base không bị che khuất nên chúng hấp thu đƣợc ánh sáng tối đa tạo tƣợng siêu sắc nhƣ II.5.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy DNA Hai mạch đôi phân tử DNA bắt cặp với nhờ liên kết hydro Sự tách rời hai mạch tƣơng ứng với phá vỡ liên kết Do đó, số lƣợng liên kết yếu tố làm thay đổi tính ổn định chúng làm thay đổi nhiệt độ nóng chảy DNA Ảnh hƣởng thành phần base phân tử DNA: phân tử DNA, A liên kết với T hai liên kết hydro, G liên kết với C ba liên kết hydro nên liên kết C G chặt Do thành phần base cấu tạo nên DNA mạch đơi có ảnh hƣởng quan trọng đến bền vững phân tử này, đặc biệt tỷ lệ base C G Trong điều kiện chuẩn, Tm thƣờng đƣợc đánh giá công thức sau: Tm = 20C*(A + T) + 40C*(C + G), đoạn DNA 25 bp, FA formaldehyde (Meinkoth – Wahl,1989) 17 Ảnh hƣởng độ dài đoạn DNA: đoạn DNA dài số lƣợng liên kết hydro nối hai mạch lớn nhiêu nhiệt độ nóng chảy cao Ảnh hƣởng điểm bắt cặp sai lệch (mismatch): điểm bắt cặp sai lệch (A liên kết với G hay C thay liên kết với T…) làm giảm tính ổn định phân tử lai, làm giảm Tm Ảnh hƣởng môi trƣờng phản ứng o Ảnh hƣởng nồng độ muối: nồng độ muối môi trƣờng giảm hay lực ion môi trƣờng giảm làm cho nhiệt độ nóng chảy DNA giảm mạnh Nhƣ vậy, dung dịch lỗng tính ổn định chuỗi xoắn kép DNA o Ảnh hƣởng formamide: Formamide đƣợc sử dụng phƣơng pháp lai phân tử nhằm làm giảm nhiệt độ lai Nồng độ formamide thƣờng dùng 50% tƣơng ứng với việc hạ Tm xuống 30% (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002) II.5.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến lai phân tử Nồng độ DNA thời gian phản ứng: Để tái bắt cặp xảy hai mạch đơn, trình tự bổ sung phải tiến đến gần vị trí đối diện Nhƣ vậy, tần số gặp gỡ hai trình tự bổ sung định trình tái bắt cặp Ở nhiệt độ xác định, hai tiêu ảnh hƣởng đến tần số gặp gỡ nồng độ DNA thời gian phản ứng Nồng độ DNA, nghĩa số lƣợng trình tự bổ sung, cao xác suất chúng tiếp xúc với tăng; kết tốc độ phản ứng lai tăng lên Tƣơng tự, thời gian phản ứng dài xác suất nói lớn số lƣợng phân tử lai tăng dần toàn trình tự bổ sung tái bắt cặp Hai thơng số nói thƣờng đƣợc xem xét đồng thời Tích số nồng độ thời gian đƣợc gọi Cot (C: concentration - nồng độ, t: time - thời gian) Cot1/2 giá trị có 50% số phân tử lai Nhiệt độ: Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc vào nhiệt độ Thông thƣờng tốc độ phản ứng lai cực đại nhiệt độ thấp Tm acid nucleic khoảng 25% Lực ion: Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ – 10 lần Nồng độ NaCl vƣợt 1,2 M lại hồn tồn khơng có tác dụng 18 II.5.5 Probe II.5.5.1 Khái niệm Để phát trình tự xác định, ban đầu ta cần trung thực trình tự Bản đƣợc đánh dấu để nhận biết có tƣợng lai xảy đƣợc gọi probe (mẫu dò) Qua lai probe trình tự bổ sung, ta phát định vị đƣợc trình tự hỗn hợp acid nucleic II.5.5.2 Các loại probe Probe đoạn Oligonucleotide: Loại probe đƣợc tổng hợp phƣơng pháp hóa học, thuận lợi cho sử dụng có kích thƣớc nhỏ 40 – 50 cặp base kháng lại RNase Ngồi ra, probe đƣợc tổng hợp nhân tạo nên ta tạo probe theo mong muốn Hơn nữa, oligonucleotide có dạng mạch đơn nên ta khơng cần giai đoạn biến tính trƣớc lai Hiện nay, loại probe đƣợc sử dụng nhiều phƣơng pháp ISH Probe DNA mạch đơn: Probe loại có khoảng 200 – 500 cặp base Các probe DNA mạch đơn tạo kỹ thuật PCR kỹ thuật chép ngƣợc RNA Nhƣợc điểm loại probe cần nhiều thời gian để chuẩn bị, hóa chất đắc tiền địi hỏi phải có kiến thức sâu sinh học phân tử Probe DNA mạch đơi: Các probe DNA mạch đơi đƣợc tạo nhờ kỹ thuật PCR tạo vi khuẩn Vì DNA mạch đơi nên ta phải biến tính probe trƣớc lai Loại probe có độ nhạy mạch đơn probe sau biến tính, hai mạch đơn ln có khuynh hƣớng tái bắt cặp trở lại ngƣời ta sử dụng loại probe Probe đoạn RNA (còn gọi probe cRNA riboprobe): Loại probe dùng việc phát trình tự RNA Probe mạch đơn bổ sung với RNA đƣợc tổng hợp từ RNA cách nhân dịng vơ tính ngƣợc (reverse cloning) (Polak ctv, 1990) Liên kết RNA-RNA bền kháng lại với RNase nên thuận tiện cho ta loại bỏ tín hiệu lai RNA chất không cần thiết khác sau lai, nhiên giai đoạn xử lý trƣớc lai khó thực (Power Versatility) II.5.5.3 Các phương pháp đánh dấu probe 19 Đánh dấu Nick – translation: Phƣơng pháp đƣợc thực nhƣ sau: DNAse I cắt phân tử DNA vị trí khác tạo “lỗ thủng” (Nick) phân bố cách ngẫu nhiên hai mạch Từ lỗ thủng DNA polymerase I mặt gặm dần mạch bị cắt theo chiều 5’ – 3’ (nhờ hoạt tính exonuclease 5’ – 3’), mặt khác lại tổng hợp bù đoạn bị thiếu (nhờ hoạt tính polymerase) Do phản ứng có diện loại nucleotide đƣợc đánh dấu, nên đoạn tổng hợp mang nhiều nucleotides đánh dấu Kết cuối DNA đƣợc đánh dấu khắp chiều dài phân tử Đánh dấu Random priming: Đầu tiên mẫu dị đƣợc biến tính nhiệt làm lạnh đột ngột Ngƣời ta thêm vào phản ứng hỗn hợp oligonucleotide tổng hợp (thƣờng nucleotide) Các hexanucleotide tƣơng ứng với tất trình tự tổ hợp có lý thuyết Nhƣ chắn vài hexanucleotide số bắt cặp với hai mạch đơn mẫu dị Lúc chúng trở thành primer cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp mạch bổ sung Vì bốn loại nucleotide thêm vào phản ứng đƣợc đánh dấu nên mạch tổng hợp đƣợc đƣợc đánh dấu DNA polymerase thƣờng đƣợc sử dụng đoạn Klenow DNA polymerase I T7 polymerase Đánh dấu probe RNA: Trình tự DNA dùng để sản xuất mẫu dị RNA phải đƣợc dƣa vào vector có mang promoter dạng SP6, T3, T7 Vector đƣợc cắt thành dạng mạch thẳng, sau RNA polymerase thích hợp đƣợc thêm vào phản ứng với nucleotide đƣợc đánh dấu RNA polymerase phiên mã trình tự DNA promoter tạo lƣợng lớn RNA đƣợc đánh dấu Sau phản ứng vector có mang trình tự DNA gốc bị DNase I phân hủy, enzyme đƣợc loại bỏ qua tách chiết phenol RNA đƣợc tinh sắc ký lọc gel Ngoài phƣơng pháp đánh dấu chủ yếu trên, ngƣời ta cịn dùng phƣơng pháp nhƣ gắn vào đầu 3’ (3’ tailing), đánh dấu đầu 3’ (3’ end labeling) phƣơng pháp PCR để đánh dấu probe trƣớc thực thí nghiệm II.5.5.4 Các tác nhân đánh dấu probe cách phát phân tử lai A Probe đƣợc đánh dấu đồng vị phóng xạ ... MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Giáo viên hƣớng dẫn: TS NGUYỄN VĂN HẢO Đề tài đƣợc... đoán mầm bệnh WSSV (White Spot Syndrome Virus) tôm sú Penaeus monodon TSV (Taura Syndrome Virus) tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei” I.2 Mục tiêu đề tài Phát triển phƣơng pháp ISH để chẩn đoán mầm. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐỐN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TƠM SÚ (Penaeus