15 với cấu trúc GFP reporter, protein P0, và PTGS, Albert và cộng sự (2006) đã chỉ ra rằng protein P0 của SCYLV cũng im lặng ở vị trí PTGS bị gây ra bởi cấu trúc sense GFP (sGFP). Không giống nhƣ protein P0 của BWYV, PLRV và CABYV, protein P0 của SCYLV ức chế ảnh hƣởng của PTGS bởi sGFP nhƣng nó không đƣợc gây ra bởi cấu trúc inverted repeat GFP (irGFP). Phân tích chức năng protein P0 bằng cách xóa bỏ cấu trúc P0 của SCYLV cho thấy protein này có nhiều vùng cần thiết cho chức năng ức chế của protein này. Thấm lá với protein P0 của SCYLV, kết quả là xuất hiện những vết hoại tử ở trên những đốm đƣợc thấm, sự hủy bỏ hoạt tính ức chế cũng mất đi sự hoại tử, điều đó chứng tỏ những hoạt tính này có thể đƣợc liên kết. Những nghiên cứu về đa dạng di truyền gần đây đã thừa nhận sự tồn tại một vài kiểu gene của ScYLV. Để xác định và mô tả chính xác các kiểu gene của ScYLV, Abu và cộng sự (2006) đã giải trình tự toàn bộ bộ gene (gồm 6 ORF) của 8 ScYLV phân lập từ 6 vùng khác nhau (Brazil, China, Colombia, Cuba, Peru, và Reunion). Bốn kiểu gene của ScYLV (BRA ở Brazil, CUB ở Cuba, PER ở Peru và REU ở Reunion) đã đƣợc phát hiện dựa vào phân tích phát sinh chủng loài với trình tự bộ gene của 6 vùng này. Những cặp primer đặc hiệu đã đƣợc thiết kế để phát hiện từng kiểu gene của ScYLV bằng RT-PCR. Kết quả cho thấy một vài kiểu gene của ScYLV có thể cùng tồn tại trên một vùng địa lý hoặc trên cùng một cây (Abu Ahmad và cộng sự, 2006). 2.2.3 Ảnh hƣởng về kinh tế của bệnh vàng gân lá ScYLV là một tác nhân gây bệnh quan trọng về kinh tế ở Cauca Valley, Colombia. Trong năm 2004, tỉ lệ nhiễm virus này trên toàn bộ cánh đồng trồng mía nguyên liệu là 12,2% (S, J.C Angel và cộng sự, 2006). Ở Brazil virus này đã nhiễm 25% trên giống SP 71-6163 và 750 000 ha trên toàn bộ diện tích trồng mía (Vega và cộng sự, 1997). Giống SP 71-6163 mẫn cảm cao với ScYLV, ƣớc tính làm mất 40- 60% lƣợng đƣờng (Lockhart và cộng sự, 1996). ScYLV đã hiện diện trên toàn bộ các cánh đồng mía công nghiệp ở Lousiana (McAllister và cộng sự, 2006). Năng suất giảm 15 đến 20% cũng đã đƣợc báo cáo do ScYLV ở Louisiana (Grisham và cộng sự, 2002). Sự giảm năng suất (lƣợng đƣờng trên đơn vị diện tích) ở giống LCP 82-89 cao nhất ở vụ gốc thứ hai là 23% (Grisham). Ở Florida có ít nhất 65% diện tích trồng mía thƣơng mại bị nhiễm với ScYLV (Irey và cộng sự, 1997; ). Ở Nam Phi và Hawaii ảnh hƣởng của YLS trên mía đã làm giảm đáng kể hàm lƣợng phức hợp polysaccharide (gums) đƣợc tách chiết (Lockhart và cộng sự, 2000). 16 2.2.4 Những nghiên cứu về tính kháng ScYLV trên mía Marker phân tử liên kết với tính kháng đã đƣợc sử dụng để chọn lọc kiểu gene của những cá thể và có thể cung cấp công cụ để xác định tính kháng ở trên mía. Mục tiêu là tìm những quần thể có những cá thể kháng lại bệnh vàng lá. Kết quả là tìm thấy 39 dòng trong quần thể lai Green German x Ind 81-146 là không có bệnh SCYLV trong suốt quá trình thí nghiệm (Comstock và cộng sự, 2005). Comstock và cộng sự (2006) đã nghiên cứu về marker phân tử liên kết với tính kháng bằng cách sử dụng microsatellite primer. Mục đích là phát triển phƣơng pháp xác định các dòng kháng với ScYLV một cách nhanh chóng và chính xác. Với 216 microsatellite primer đã xác định đƣợc 12 cây nhiễm và 11 cây kháng từ quần thể 65 cây con lai từ Green German (nhiễm) và IND 81-146 (kháng). Trong số 216 microsatellite primer có 167 primer cho ra ít nhất 4 band. Kết quả đã chỉ ra rằng có 3 band đa hình microsatellite liên kết với tính kháng ScYLV. Phân tích kiểu gene trên 47 cây con cho thấy có 2 loci SSR liên kết với tính kháng nhƣng không liên kết với locus SSR khác. Trên một vài giống mía có khả năng kháng lại với ScYLV và tính kháng này có thể di truyền đƣợc (Schenck và Lehrer, 2001). Những nghiên cứu về tính kháng trên mía đã chỉ ra rằng các giống CC 84-75, CC 87-505, PR 61-632 mẫn cảm với ScYLV, nhƣng giống CC85-92 thì kháng tốt với ScYLV (Angel và cộng sự, 2006). Ở Hawaii các giống H 78-4153, H 78-3567, H 78-7750 và H87-4319 đƣợc báo cáo là kháng với ScYLV (Schenck và Lehrer, 2000). Các giống mía mới, Saccharum officinarum ít mẫn cảm (nhƣ là S. robustum. Saccharum spontaneum, S. sinensis và Erianthus sp.) thƣờng không có virus ở trên cánh đồng mía ở Maunawili, nó đƣợc cho là liên quan đến tính kháng (Schenck và cộng sự, 2001). 2.2.5 Tạo cây mía chuyển gene kháng ScYLV Giống mía kháng ScYLV có thể đƣợc tạo ra thông qua biến nạp. Sự bất hoạt gene đƣợc coi nhƣ một cơ chế phổ biến cho sự kháng của cây trồng đối với sự nhiễm của virus. Bất hoạt gene sau sao mã (posttranscriptional gene) đã đƣợc hƣớng tới trong cây mía bởi biến nạp với vùng không giải mã của ScYLV. Bộ gene của ScYLV và chức năng các protein của virus đã đƣợc biết đến (F. Moonan, 2000), vì thế chiến lƣợc tạo ra cây mía kháng ScYLV có thể dễ dàng. 17 Giống H62-4671 đã đƣợc biến nạp với một vùng trình tự DNA không dịch mã (non-traslatabe DNA sequence piece) của protein vỏ virus mà nó làm bất hoạt gene RNA của virus để chống lại sự nhiễm virus. Mía có một hệ thống bất hoạt gene rất hữu hiệu (Y. J. Zhu, 2003). Phôi phát sinh từ mô sẹo của giống lai CC 84-75 đƣợc bắn với plasmids pFM395 và pFM396 chứa một đoạn DNA mã hóa protein vỏ của ScYLV. Những cây đã biến nạp đƣợc ủ với ScYLV bởi Melanaphis sacchari. Sự nhiễm đƣợc kiểm tra sau một vài tháng bằng kỹ thuật TBIA và RT-PCR. Kết quả thu đƣợc 37 cây từ 66 cây đƣợc kiểm tra là âm tính với ScYLV (Rangel và cộng sự, 2005). 2.2.6 Tạo cây mía sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô Có 3 phƣơng pháp để loại bỏ virus đƣợc sử dụng là xử lý nhiệt, nuôi cấy mô, xử lý bằng hóa chất. Tuy nhiên, xử lý nhiệt và hóa chất thì không có hiệu quả trong việc loại bỏ virus ScYLV (M. Chatenet và cộng sự, 2001). Có thể tạo cây sạch ScYLV bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô (M. Chatenet và cộng sự, 2001; Y. Parmessur và cộng sự, 2002). Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng là phƣơng pháp hiệu quả nhất trong việc sản xuất cây sạch virus và cũng là phƣơng pháp đƣợc chọn để loại bỏ virus khỏi cây bị nhiễm. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng có thể tạo ra 92% cây sạch virus, nhƣng chỉ đạt 29% khi nuôi cấy bằng chồi đỉnh (M. Chatenet và cộng sự, 2001). Tuy nhiên, theo Parmessur (2002) khi nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng chỉ tạo ra 64% cây sạch virus, chỉ có 6% khi nuôi cấy bằng chồi nách. Nhƣng khi nuôi cấy từ mô sẹo sẽ tạo ra 100% cây sạch virus (Y. Parmessur và cộng sự, 2002). 2.2.7 Một số kỹ thuật trong chẩn đoán ScYLV 2.2.7.1 Phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bằng cây chỉ thị Cây chỉ thị thực chất cũng là cây ký chủ của virus, nhƣng đặc biệt hơn là chúng mẫn cảm cao với virus và tạo ra các triệu chứng rất điển hình trên thân, lá, … Các triệu chứng này giúp ta chẩn đoán khá chính xác các bệnh do virus. Đối với virus, có 2 nhóm chỉ thị: nhóm chỉ thị theo bộ phận (necrotic) và nhóm chỉ thị theo hệ thống (systemic). Nhóm chỉ thị theo bộ phận là những cây chỉ thị mà khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ có vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà không di chuyển đến những bộ phận khác của cây. Ví dụ nhƣ cây cà độc dƣợc (Datura stramonium) khi bị nhiễm TMV sẽ xuất hiện những vết đốm chết hình tròn trên mặt lá sau khi lây bệnh từ 3 - 5 ngày trong điều kiện nhiệt độ 25 - 30 o C. Nhóm chỉ thị theo hệ 18 thống là những cây chỉ thị mà khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ tạo sự chết hệ thống trên toàn cây (Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998). 2.2.7.2 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng Triệu chứng bên ngoài: Các triệu chứng phổ biến là đốt cuối ngắn, vàng những lá cuối, mặt dƣới của gân lá trở nên vàng hơn lá già, hoại tử bắt đầu từ chóp lá, … Triệu chứng bên trong: Sự thay đổi tế bào và mô có thể quan sát qua kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử. Ngƣời ta còn quan sát những cấu trúc khác nhau do virus sản sinh ra, thƣờng là những thể vùi. 2.2.7.3 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng Brix kế Độ brix đƣợc đánh giá vào giai đoạn mía 10 tháng tuổi bằng Brix kế trên gân chính lá +1 và đƣợc chia thành 4 mức độ nhiễm bệnh khác nhau:  Không bị bệnh: không có triệu chứng, độ brix nhỏ hơn 7.  Nhiễm nhẹ: độ brix từ 7 đến 14.  Nhiễm trung bình: Nhìn mặt trên và mặt dƣới lá có màu vàng, độ brix lớn hơn 14, phiến lá có màu vàng lan ra từ gân chính.  Nhiễm nặng: toàn bộ phiến lá và gân lá chính có màu vàng, triệu chứng khô từ cổ lá xuống bẹ lá, toàn bộ cây trong bụi có triệu chứng bệnh, độ brix lớn hơn 14, bụi có thể nhổ lên dễ dàng (Hà Đình Tuấn, 2004). 2.2.7.4 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi huỳnh quang Những lát cắt tƣơi đƣợc cắt từ gân, bẹ lá và thân bởi dao lam đƣợc làm tiêu bản trên một giọt nƣớc cất hai lần trên lam kính và đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi quang học. Toàn bộ mô đƣợc nghiên cứu với sự chuyển từ ánh sáng trắng sang ánh sáng xanh bởi đèn huỳnh quang. Sự kiểm tra huỳnh quang với ánh sáng kích thích màu xanh đƣợc tiến hành thông qua một kính tách màu nhị sắc ở bƣớc sóng 510nm và một kính lọc màu vàng chặn lại tại bƣớc sóng 510nm. 19 Hình 2.6. Các bó mạch gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang. (A) Chất huỳnh quang màu vàng xanh (đầu mũi tên) trong mạch libe với triệu chứng vàng gân lá. (B) Cây không có triệu chứng các bó mạch libe bình thƣờng (J. Vega và cộng sự, 1997). Kiểm tra những lát cắt từ cây có triệu chứng vàng gân lá bởi phƣơng pháp phát huỳnh quang đã phát hiện ra những bó mạch với chất phát huỳnh quang màu vàng xanh ở trong mạch libe (hình 2.6 A). Trong những cây không có biểu hiện triệu chứng thì hiếm khi xuất hiện màu huỳnh quang trong mạch libe (hình 2.6 B). 2.2.7.5 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử Những lát cắt cực mỏng từ lá, gân hoặc thân mía sau khi sử lý bằng hóa chất đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. Virus đƣợc tìm thấy ở dạng kết tụ vô định hình trong tế bào chất của tế bào kèm của mạch libe. Trong tế bào kèm, virus chỉ xuất hiện ở tế bào chất không thấy ở trong nhân hay các cơ quan tử khác của tế bào chất. Đƣờng kính của hạt virus từ 22 đến 24 nm. 20 Hình 2.7. Vi ảnh điện tử của lát cắt siêu mỏng của tế bào kèm libe cây mía (VP: virus particles, CW: cell wall, N: nucleus, tỷ lệ thƣớc 100nm). (Nguồn: Vega, 1997) 2.2.7.6 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật DAS-ELISA Kháng nguyên thu đƣợc (hạt virus tinh sạch) sẽ đƣợc tiêm vào thỏ New Zeland để thu globulin miễn dịch. Kháng thể sau khi sản xuất sẽ đƣợc sử dụng cho DBIA, TBIA, ISEM để phát hiện các mô bị nhiễm ScYLV (Angel và cộng sự, 2006). DAS-ELISA đƣợc thực hiện trên kháng nguyên từ lá mía và dịch nƣớc mía cho thấy kháng nguyên từ dịch nƣớc mía có chuẩn độ cao hơn kháng nguyên từ lá mía (R Viswanathan và M Balamuralikrishnan, 2004). 2.2.7.7 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng tissue blot immunoassay (TIBA) Cũng giống nhƣ ELISA, TIBA sử dụng kháng thể chống lại virus. Nhựa từ cây đƣợc chuyển lên một màng nylone hay nitrocellulose và virus đƣợc phát hiện nhờ vào mẫu dò đƣợc đánh dấu. Quy trình này không cần nhiều thao tác nhƣ ELISA, nhanh, nhạy, đơn giản (không cần dịch chiết của virus), không đắt tiền (chỉ cần số 21 lƣợng trang thiết bị tối thiểu), thích hợp cho khảo sát 1000 - 2000 mẫu trên ngày. Kit cũng đã sẵn có cho nhiều virus. Hình 2.8. Kết quả TIBA của vết in gân lá khỏe (trên) và lá bị nhiễm (dƣới) (Comstock và Gilbert) Sự nhiễm ScYLV đƣợc xác định bằng một kháng thể đặc hiệu cho ScYLV. Lá đƣợc cắt khỏi cây và bản lá đƣợc cắt khỏi gân lá trong một thời gian ngắn. Vị trí gốc của gân lá đƣợc cắt bằng dao mỏng. Miếng cắt gân lá đƣợc cố định trên màng nitrocellulose. Sau đó màng đƣợc rửa với huyết thanh sử dụng kháng thể đặc hiệu cho ScYLV đƣợc tạo ra bởi B. E. Lockhart, Đại học Minnesota (Minneapolis) (theo Comstock và Miller (2003)). Sau đó đƣợc phủ bởi cơ chất tạo màu. Kính hiển vi ba chiều đƣợc dùng để kiểm tra vết lá in. Vì ScYLV đƣợc xác định ở trong mạch libe nên mẫu dƣơng tính cho sự hiện diện của virus khi những bó mạch libe trong vết lá in có màu xanh (Comstock và Miller, 2003) (hình 2.8 và 2.9). 22 Hình 2.9. Màng nitrocellulose đƣợc xử lý bằng kỹ thuật TBIA với huyết thanh của BYDV-PAV. Kết tủa xuất hiện ở mạch libe của gân lá (A và B), lá (C), thân (D). Tỷ lệ thƣớc 200µm. (Nguồn: Vega, 1997) 2.2.7.8 Chẩn đoán ScYLV bằng kỹ thuật Immunoblotting (western blotting) Sau khi điện di protein trên SDS-PAGE, polypeptides đƣợc chuyển lên màng nitrocellulose để thực hiện Immunoblotting (western blotting). Màng đƣợc ngâm 2 phút trong 2% Tween 20 (v/v) và ủ qua đêm ở 4 0 C với kháng thể sơ cấp (toàn bộ huyết thanh) đƣợc pha loãng với tỉ lệ 1:5000 trong TTBS chứa 1% gelatin. Những band protein đƣợc phát hiện dựa vào 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate và nitroblue tetrazolium (BCIP/NBT). Hạt virus ScYLV chứa protein 27 kDa, là một polypeptide đƣợc xác định bằng cách nhuộm với Coomassie blue (hình 2.11A). Protein 58, 27 và 17 kDA (6 band) đƣợc xác định bằng western blotting với kháng huyết thanh ScYLV (hình 2.11,lane1). Hình 2.10. Kết quả immunoblotting (westren blotting) của protein ScYLV (Nguồn: Scagliusi và Lockhart, 2000) 23 2.2.7.9 Real -Time PCR Sử dụng phân tử beacon (Tyagi và Kramer, 1996; Eun và Wong, 2000) trong chẩn đoán virus cho phép phát hiện nhanh, nhạy và đặc hiệu hơn các kỹ thuật khác. Kết hợp kỹ thuật phân tử beacon với sự khuếch đại dựa trên trình tự acid nucleotide (NASBA: nucleic acid sequence-based amplification, Kievits và cộng sự, 1991) cho phép đồng thời khuếch đại và phát hiện RNA của virus trong một tube kín, đƣợc gọi là AmpliDet RNA (Leone và cộng sự, 1998). NASBA là phƣơng pháp khuếch đại RNA đích của virus trong điều kiện đẳng nhiệt ở 41 0 C sử dụng hai oligonucleotide primer đặc hiệu và enzyme AMV-reverse transcriptase (AMV-RT), RNase H và T7-RNA polymerase. Gần đây, AmpliDet RNA đã đƣợc sử dụng để xác định một số virus thực vật (Klerks và cộng sự, 2001; Leone và cộng sự, 1998; Szemes và cộng sự, 2002). AmpliDet RNA có độ nhạy cao và ổn định cho việc phát hiện những virus ở trong mô cây phức tạp nhƣ vỏ, chồi, củ và quả. Hơn nữa, AmpliDet RNA phát hiện đƣợc đồng thời nhiều virus riêng biệt trong cùng một tube (Klerks và cộng sự, 2001; Szemes và cộng sự, 2002). Hình 2.11. Phân tử Beacon (Nguồn: http://www.molecular-beacons.org) Phân tử beacon MB ScYLV đƣợc thiết kế để mang trình tự 6 nucleotide tự bổ sung với nhau ở đầu 5’ và đầu 3’. Trình tự 21 nucleoitde bổ sung cho sản phẩm NASBA đặc hiệu cho ScYLV đƣợc chọn để lai với vùng tƣơng tự nhƣ biotinylated probe BIO ScYLV. Phân tử beacon đƣợc kết hợp với 6-carboxyfluorescein (FAM; bị kích thích ở bƣớc sóng 494 nm, phát sáng ở bƣớc sóng 530 nm) và quencher 4-[4 - Vùng mang trình tự bổ sung với DNA đích 24 dimethylaminophenylazo]-benzoic acid (DABCYL) riêng biệt ở đầu 5’ và 3’. Đầu 6 nucleotide cấu trúc sợi đôi ở 41 0 C sẽ kìm hãm sự phát quang khi không có sự bắt cặp với trình tự đích. Khi có mặt gene đích probe sẽ bắt cặp với gene đích đồng thời với sự phát huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang đƣợc đo ở bƣớc sóng 530nm sau mỗi 2 phút. Phƣơng pháp này có độ nhạy cao với ScYLV, có thể phát hiện ScYLV ở mật độ rất nhỏ 10fg (femtogram, 1fg = 10 -15 g). Phƣơng pháp cho phép phát hiện ScYLV sau khi pha loãng mẫu 1000 lần (Gonçalves và cộng sự, 2002). 2.2.7.10 Chẩn đoán ScYLV bằng kỹ thuật RT-PCR RT-PCR đƣợc thực hiện trên dịch trích mô bị nhiễm ScYLV với cặp primer Lu1 và Lu4 đặc hiệu cho nhóm virus luteovirus (Irey và cộng sự, 1997). Cặp primer Lu1 và Lu4 tạo ra sản phẩm có kích thƣớc 530bp đặc hiệu cho gene mã hóa protein vỏ của virus (Robertson và cộng sự, 1991 (trích bởi Schenck, 2001)). Những primer này đƣợc sử dụng để tách trình tự acid nucleotide của ScYLV mà nó đƣợc chứng minh rằng có khoảng 40% tƣơng đồng với trình tự PAV của kiểu huyết thanh BYDV. Từ trình tự của ScYLV đƣợc phân lập từ Florida, một cặp primer khác đã đƣợc tạo ra (YLS111 và YLS462), nó đặc hiệu cho ScYLV (Irey và cộng sự, 1997). Primer này khuếch đại gene mã hóa cho protein vỏ của ScYLV. Sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc 352bp. Ngày nay cặp primer này đƣợc sử dụng để phát hiện ScYLV ở các nơi nhƣ Brazil, Colombia, Taiwan, Mauritius và Mexico Florida, Hawaii, (Irey, thông tin cá nhân). Ngoài ra các cặp primer khác khuếch đại gene mã hóa protein vỏ cũng đƣợc sử dụng để phát hiện ScYLV nhƣ các cặp primer:  RT-PCR sense primer – P1f GCT AAC CGC TCA CGA AGG AAT GT (3660–3882bp).  RT-PCR antisense primer – P2r GAA GGG GGC CGG GAA GAC T (4091–4109 bp).  RT-PCR sense primer – P3f CAG GTG CAA TCG CAC TTG AAG TGG A (3997–4021bp).  RT-PCR antisense primer – P4r GAA TTG TCC TGC TAG GCT CGA (4179–4199bp).  NASBA sense primer – N2f CAG GTG CAA TCG CAC TTG AAG TGG A (3997–4022bp) (Gonçalves và cộng sự, 2002). [...]... (Angel và cộng sự, 20 06) Comstock và cộng sự (20 05) đã sử dụng marker phân tử để xác định tính kháng ScYLV trên mía 2. 3 .2 Những nghiên cứu về ScYLV ở Vi t Nam Hà Đình Tuấn (20 04) đã dựa vào triệu chứng và Brix kế để nghiên cứu về bệnh vàng gân lá Kết quả cho thấy hầu hết các giống đƣợc nghiên cứu đều nhiễm bệnh vàng gân lá Đây là nghiên cứu về bệnh vàng gân lá đầu tiên tại Vi t Nam 27 2. 4 Kỹ thuật PCR và. .. chứng vàng gân lá (dƣới) và lá không biểu hiện triệu chứng vàng gân lá (trên) (A) mặt trên của lá, (B) mặt dƣới của lá (Hình chụp tại xã Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An ngày 19/03 /20 06) Hình 4 .2 Triệu chứng vàng gân lá bắt đầu từ lá thứ 3 (Hình chụp tại xã Phú Lý, Vĩnh Cửu, Đồng Nai ngày 25 /03 /20 06) Triệu chứng vàng gân lá xuất hiện bắt đầu từ lá thứ 3 ( hình 4 .2) và những lá già hơn trên toàn cây và xuất... 20 01) Bệnh vàng gân lá gây ra bởi ScYLV là một bệnh quan trọng tiềm tàng đƣợc nhập vào Louisiana gần đây Một cuộc khảo sát rộng để xác định sự phân bố của ScYLV cho thấy virus này đã hiện diện trên tất cả các vùng trồng mía công nghiệp ở Louisiana (McAllister, 20 06) Ở Ecuador có 2 bệnh virus chính trên mía là bệnh vàng lá do SCYLV và bệnh khảm do Sugarcane mosaic virus (SCMV) Phạm vi tác động của bệnh. .. 720 C /20 phút – 1 chu kỳ 940C /1 phút, 540C /1 phút, 720 C /2 phút - 40 chu kỳ 720 C 10 phút - 1 chu kỳ 3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý bằng trắc nghiệm 2 bởi phần mền Excel XP 37 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Các biểu hiện của triệu chứng vàng gân lá do ScYLV Các biểu hiện của triệu chứng vàng gân lá do ScYLV là vàng ở gân lá cả mặt trên và mặt dƣới (hình 4.1) A B Hình.4.1 Lá biểu... Phƣơng pháp quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang Gân lá và bản lá đƣợc cắt mỏng bằng dao lam mới Sau đó, thiết vật đƣợc đặt trong một giọt nƣớc cất hai lần đã khử trùng trên lame Đặt lamelle lên và quan sát các bó mạch libe ở các độ phóng đại 40X, 100X, 20 0X và 400X với ánh sáng đơn sắc màu xanh (blue) bƣớc sóng 510nm Những bó mạch libe bị nhiễm virus sẽ phát huỳnh quang màu vàng xanh bởi ánh sáng... tử trên lá (Hình 4.3) 38 Triệu chứng này biểu hiện làm cho toàn bộ cánh đồng chuyển thành màu vàng (hình 4.4) A B Hình 4.3 (A) cây biểu hiện triệu chứng vàng gân lá (B) cây không có triệu chứng vàng gân lá (Hình chụp tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú ngày 14/03 /20 06) A B Hình 4.4 Cánh đồng có triệu chứng vàng gân lá (A) Cánh đồng khỏe mạnh (B) (Hình (A) chụp tại xã Mỹ Thạnh Tây ngày 19/03 /20 06,.. .25 2. 3 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới và ở vi t nam 2. 3.1 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới Triệu chứng vàng lá xuất hiện trên mía ở Hamakua thuộc bờ biển của đảo Hawaii năm 1989 Chúng đƣợc thấy ở trên những cánh đồng giống H65-70 52 và nó không giống nhƣ triệu chứng của sự thiếu dinh dƣỡng Sau đó triệu chứng... khó khăn do virus bị hạn chế trong mạch libe và hiện diện với nồng độ thấp Một lƣợng nhỏ protein của mía còn lại gây trở ngại cho độ đặc hiệu của kháng thể Vì thế một kháng thể có hoạt tính và độ đặc hiệu cao đã đƣợc nghiên cứu và đƣợc sử dụng trong chẩn đoán mà không bị trở ngại bởi protein của mía và các luteovirus hay polerovirus (Wang, Schenck và Albert, 20 06) ScYLV là tác nhân gây bệnh quan trọng... bình thƣờng sẽ không phát huỳnh quang 3.6 Phƣơng pháp phát hiện bằng kỹ thuật RT-PCR Kỹ thuật RT-PCR đƣợc thực hiện là hai bƣớc (two steps ): gồm giai đoạn tổng hợp cDNA và giai đoạn khuếch đại cDNA Virus đƣợc phát hiện dựa trên trình tự đoạn gene có kích thƣớc 3 52 bp mã hóa cho protein vỏ của virus ScYLV Qui trình thực hiện gồm 3 giai đoạn: ­ Giai đoạn ly trích RNA đƣợc thực hiện bằng kit ly trích RNA... (SCMV) Phạm vi tác động của bệnh vàng gân lá trên những cánh đồng thƣơng mại cao và bệnh này đã lan rộng trong cả nƣớc (Garcés và cộng sự, 20 06) Ở Mauritius YLS đã đƣợc tìm thấy đầu tiên vào năm 1994 trên giống CP 72 121 0 Tiếp sau đó triệu chứng này đã đƣợc tìm thấy ở một vài giống khác và sự hiện diện của ScYLV đã đƣợc xác định vào năm 1990 (S M Aljanabi và cộng sự, 20 01) ScYLV đƣợc phát hiện đầu tiên . các giống đƣợc nghiên cứu đều nhiễm bệnh vàng gân lá. Đây là nghiên cứu về bệnh vàng gân lá đầu tiên tại Vi t Nam. 27 2. 4 Kỹ thuật PCR và RT-PCR 2. 4.1 PCR Kĩ thuật PCR PCR (Polymerase. ScYLV trên mía. 2. 3 .2 Những nghiên cứu về ScYLV ở Vi t Nam Hà Đình Tuấn (20 04) đã dựa vào triệu chứng và Brix kế để nghiên cứu về bệnh vàng gân lá. Kết quả cho thấy hầu hết các giống đƣợc nghiên. hiện diện trên tất cả các vùng trồng mía công nghiệp ở Louisiana (McAllister, 20 06). Ở Ecuador có 2 bệnh virus chính trên mía là bệnh vàng lá do SCYLV và bệnh khảm do Sugarcane mosaic virus (SCMV).