1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ٭٭٭ 000٭٭٭ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ٭٭٭ 000٭٭٭ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN NGUYỄN THỊ THANH HÀ KS. DƢƠNG THÀNH LAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 3 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY. HO CHI MINH CITY DEPARMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** TO FIND BACTERIUM: Erwinia carotovora subsp. carotovora ON THE Cymbidium BY THE PCR Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: PhD. LE DINH DON NGUYEN THI THANH HA BSc. DUONG THANH LAM Term:2002 – 2006 Ho Chi Minh City 8/2006 4 LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi nhận đƣợc rất nhiều sự ủng hộ và giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè. Nay tôi xin chân thành cảm ơn đến: Cha mẹ và những ngƣời thân luôn tạo điều kiện, động viên con trong suốt quá trình con học tập tại trƣờng. Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả thầy cô đã tận tình giúp đỡ, dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trƣờng. Thầy Lê Đình Đôn đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Thầy Dƣơng Thành Lam đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Anh Nguyễn Văn Lẫm, các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, các anh chị làm việc tại Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật khoa Nông Học trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Các bạn sinh viên lớp công nghệ sinh học 28 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học và làm đề tài tốt nghiệp. TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006 Nguyễn Thị Thanh Hà 5 TÓM TẮT KHÓA LUẬN NGUYỄN THỊ THANH HÀ, Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.Tháng 8 năm 2006. “PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR” Giáo viên hƣớng dẫn: Thầy Lê Đình Đôn Thầy Dƣơng Thành Lam Địa điểm: Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật – Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh - Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. Đối tƣợng nghiên cứu: vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên địa lan (Cymbidium). Hiện nay, các vƣờn địa lan tại thành phố Đà Lạt bị thiệt hại rất lớn do bệnh thối làm chết cây gây ra. Cho đến thời điểm này ngƣời ta vẫn chƣa xác định chính xác tác nhân gây ra bệnh và chƣa có loại thuốc đặc trị hữu hiệu. Do đó, việc tìm hiểu phƣơng pháp chẩn đoán, phát hiện tác nhân gây ra bệnh là hết sức cần thiết giúp xây dựng quy trình phòng trừ bệnh hiệu quả hơn. Nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Điều tra tình hình bệnh hại trên địa lan tại một số vƣờn trồng địa lan trên địa bàn TP. Đà Lạt – Lâm Đồng. 2. Phân lập mẫu vi khuẩn và chủng bệnh lên củ khoai tây và lá địa lan. 3. Nhân sinh khối các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc. 4. Khuếch đại đoạn DNA nằm trong vùng 16S/23S rDNA và vùng gen pel mã hóa pectate lyase của vi khuẩn bằng phƣơng pháp PCR. Kết quả đạt đƣợc: 1. Tỷ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn điều tra: - Bệnh do vi khuẩn: 20,17%. - Bệnh do virus: 9,5%. - Bệnh do nấm: 11,6%. 2. Phân lập đƣợc 2 dòng vi khuẩn có màu khuẩn lạc rất đặc trƣng: - Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. - Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. 3. Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan: 6 - Trên củ khoai tây: 9 dòng vi khuẩn có khả năng gây bệnh mạnh sau 48 giờ chủng bệnh (ở nhiệt độ phòng). - Trên lá địa lan: hầu nhƣ các dòng vi khuẩn đều không gây bệnh sau khi chủng bệnh 10 ngày (ở 25 0 C), duy nhất chỉ có một dòng EC06-8 gây bệnh. 4. Khuếch đại đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc 1,5 kb nằm trong vùng 16S/23S rDNA của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc. 7 MỤC LỤC Phần Trang Trang tựa ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh sách các chữ viết tắt ix Danh sách các hình x Danh sách các bảng xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích – yêu cầu 1 1.2.1. Mục đích 1 1.2.2. Yêu cầu 1 1.2.3. Giới hạn 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Điều kiện tự nhiên của TP. Đà Lạt với việc nuôi trồng Cymbidium 3 2.2. Giới thiệu về lan Cymbidium 3 2.2.1. Phân loại – phân bố 3 2.2.2. Đặc điểm thực vật học 4 2.2.3. Yêu cầu sinh thái 5 2.2.4. Sâu bệnh 5 2.2.5. Tình hình sản xuất lan Cymbidium của Tp. Đà Lạt và trên thế giới 7 2.3. Giới thiệu về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora và tác hại của nó 8 2.3.1. Phân loại 8 2.3.2. Erwinia carotovora 8 2.3.3. Erwinia carotovora subsp. carotovora 9 2.4. Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra 13 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 8 3.1. Vật liệu thí nghiệm 17 3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17 3.1.2. Vật liệu 17 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 18 3.2.1. Điều tra tình hình bệnh chết cây trên địa lan tại TP Đà Lạt – Lâm Đồng 18 3.2.2. Phân lập mẫu vi khuẩn 18 3.2.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB và môi trƣờng YDC 19 3.2.4. Chủng vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan 19 3.2.5. Tăng sinh khối vi khuẩn trên môi trƣờng LB lỏng 21 3.2.6. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn 21 3.2.7. Thực hiện phản ứng PCR 22 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1. Tình hình bệnh hại trên địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng 25 4.1.1. Các triệu chứng bệnh trên địa lan 25 4.1.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra 27 4.2. Phân lập mẫu vi khuẩn 28 4.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB và môi trƣờng YDC 29 4.3.1. Trên môi trƣờng KB 29 4.3.2. Trên môi trƣờng YDC 30 4.4. Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan 31 4.4.1. Trên củ khoai tây 31 4.4.2. Trên lá địa lan 32 4.5. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn 32 4.6. Phản ứng PCR 34 4.6.1. Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 34 9 4.6.2. Phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 35 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 5.1. Kết luận 37 5.2. Đề nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 10 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR : Polymerase chain reaction DNA : Deoxyribonucleotide acid RNAse : Ribonuclease TE : Tris EDTA SDS : Sodium dodecyl sulfate NaCl : Natri clorua TAE : Tris Acetate EDTA dNTP : Deoxynucleotide triphosphate Taq : Thermus aquaticus UV : Ultra violet LB : Luria – Bertani KB : King et al. 's medium B agar CVP : Crystal violet - pectate PGA : Potato Glucose Agar EtBr : Ethidium bromide YDC : Yeast extract – dextrose – CaCO 3 Ecc : Erwinia carotovora subsp. carotovora CTAB : Cethyltrimethylammonium bromide T m : Melting temperature ELISA : Enzyme linked Immuno Sorbent Assay μl : micro lít μg : micro gam μM : micro mol / lít mM : mili mol / lít ctv : cộng tác viên ha : hecta ng : nano gam bp : base pair [...]... phƣơng pháp PCR 1. 2 Mục đích – yêu cầu 1. 2 .1 Mục đích: thiết lập quy trình PCR cho vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora trên cây địa lan (Cymbidium) 1. 2.2 Yêu cầu - Điều tra tình hình bệnh hại tại các vƣờn trồng địa lan tại TP Đà Lạt – Lâm Đồng - Phân lập mẫu vi khuẩn - Nhân sinh khối các dòng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora - Nắm vững quy trình ly trích DNA vi khuẩn 14 - Khảo sát... 4.5.2 Hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng YDC sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng) 30 Hình 4.6 .1 Các triệu chứng bệnh trên củ khoai tây chủng vi khuẩn sau 48 giờ (ở nhiệt độ phòng) 31 Hình 4.6.2 Triệu chứng bệnh trên lá địa lan chủng vi khuẩn sau 10 ngày (ở 250C) 32 Hình 4.6.3 Vi khuẩn phân lập từ lá địa lan bị bệnh sau khi chủng vi khuẩn 10 ngày trên môi trƣờng PGA .. .11 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2 .1 Hình thái vi khuẩn Erwina carotovora 8 Hình 4 .1 Các triệu chứng bệnh trên chồi địa lan 25 Hình 4.2 Các triệu chứng bệnh trên giả hành 26 Hình 4.3 Các triệu chứng bệnh trên phát hoa 26 Hình 4.4 Vi khuẩn phân lập từ chồi địa lan bị bệnh trên môi trƣờng PGA 29 Hình 4.5 .1 Khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng KB... trồng địa lan trên địa bàn thành phố Đà Lạt Vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác tác nhân gây ra bệnh để từ đó xây dựng đƣợc quy trình phòng trừ bệnh hữu hiệu giúp giảm thiệt hại do căn bệnh này gây ra cho ngƣời trồng địa lan Với tính cấp thiết của vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài Phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora trên cây địa lan (Cymbidium) bằng phƣơng pháp PCR ... nuôi trồng hoa lan thƣờng gặp những dạng dịch hại phổ biến sau: Bệnh do virus: bệnh do virus gây ra trên hoa lan thƣờng xuất hiện ở hai dạng sau: virus gây khảm lá và virus làm khằn cây Virus gây khảm l : gây hiện tƣợng biến vàng trên lá và hoa Ở lá non có những sọc hay đốm màu xanh nhạt hay màu vàng xen kẽ với những vệt xanh đậm trên phiến lá Trên những cây bị nhiễm nặng, cây không phát triển, bộ... lợi để phát triển nuôi trồng các loại hoa ôn đới trong đó địa lan Cymbidium là một trong những loại hoa ôn đới đặc thù của Đà Lạt 2.2 Giới thiệu về lan Cymbidium 2.2 .1 Phân loại – Phân bố Phân loại: theo Otto Swartz (17 99), chi Cymbidium thuộc: Giới (Kingdom) : Plantae Lớp (Class) : Liliopsida Bộ(Order) : Asparagales Họ (Family) : Orchidacaea Họ phụ (Subfamily) : Epidendroideae Tông (Tribe) : Cymbidiinae... TRANG Đồ thị 4 .1 Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra 28 13 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1. 1 Đặt vấn đề Nói đến hoa Đà Lạt, chúng ta không thể nào không nói đến lan Cymbidium Ngƣời dân Đà Lạt thƣờng gọi lan Cymbidium là địa lan Địa lan Đà Lạt rất phong phú về chủng loại, đa dạng về cấu trúc và màu sắc Loài hoa này từng là “sứ giả” của Đà Lạt ở Đông Âu những năm trƣớc 19 90 Mặc dù... xuất hiện trong những vƣờn lan kém chăm sóc hoặc trên những cây lan bị tách chiết nhiều lần mà 18 không khử trùng dụng cụ Rầy rệp chích hút cũng là một trong những tác nhân làm lây lan dạng bệnh này Virus làm khằn cây: làm cho cây không phát triển bình thƣờng, lá trở nên dày hơn, có màu xanh đậm, mặt lá gồ ghề, phiến lá cứng Bệnh do virus không có thuốc đặc trị Khi thấy trong vƣờn có những cây lan có... Sản phẩm ly trích DNA tổng số của vi khuẩn 33 Hình 4.8 Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 13 30 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 560C) 34 Hình 4.9 Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 13 30 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 580C) 34 Hình 4 .10 Sản phẩm PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 35 12 DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ BẢNG TRANG Bảng 4 .1 Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều... nảy mầm phát triển thành cây mới (Trƣơng Trỗ, 19 88) 2.2.3 Yêu cầu sinh thái đối với Cymbidium Ánh sáng: nhu cầu ánh sáng từ 50 – 70% ánh sáng trực tiếp với độ chiếu sáng trên dƣới 20.000 lux (khoảng 1/ 5 độ chiếu sáng của mặt trời vùng Đà Lạt trong khoảng tháng 4 đến tháng 8, từ 11 – 14 giờ) (Trƣơng Trỗ, 19 88) Nhiệt đ : loài lan môi trƣờng lạnh thƣờng đòi hỏi một chế độ nhiệt rất đặc biệt: khoảng 15 0C . 000٭٭٭ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR Giáo vi n hƣớng dẫn: Sinh vi n thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH. trồng địa lan. Với tính cấp thiết của vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài Phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan (Cymbidium) bằng phƣơng pháp PCR . 1. 2 KHÓA LUẬN NGUYỄN THỊ THANH HÀ, Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.Tháng 8 năm 2006. “PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR