BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** TRẦN VĂN KỲ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ CÂY CẢI NGỌT TẠI TP. HCM BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG 16S – 23S rDNA LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí minh -2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ CÂY CẢI NGỌT TẠI TP. HCM BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG 16S – 23S rDNA Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thƣc hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN TRẦN VĂN KỲ KS. HOÀNG XUÂN QUANG Thành phố Hồ Chí Minh -2006- MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** ISOLATING AND IDENTIFYING AGENT CAUSED Brassica chinensis L. LEAF SPOT DISEASE IN HO CHI MINH CITY USING POLYMERASE CHAIN REACTION AND SEQUENCING 16S – 23S rDNA REGION GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Ph.D, LE DINH DON TRAN VAN KY MSc, HOANG XUAN QUANG HCMC, 09/2006 i LỜI CẢM TẠ Xin chân thành gửi lời cảm tạ đến:  Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Ban chủ nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi.  TS. Lê Đình Đôn và KS. Hoàng Xuân Quang đã hƣớng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực tập và giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.  TS. Bùi Minh Trí, Trƣởng Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, anh chị đã sinh thành, dạy dỗ và ủng hộ tinh thần cũng nhƣ vật chất cho tôi.  Các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa – Sinh đã hết lòng giúp đỡ, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.  Các bạn sinh viên thực tập tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa – Sinh, trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi.  Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học Khóa 28 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. ii TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu: “Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá cây cải ngọt tại Tp HCM bằng phƣơng pháp PCR và giải trình vùng 16S – 23S rDNA” đƣợc thực hiện từ ngày 6 tháng 2 năm 2005 đến ngày 30 tháng 7 năm 2006 tại trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam. Đề tài do sinh viên Trần Văn Kỳ thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Lê Đình Đôn và KS. Hoàng Xuân Quang. Đối tƣợng nghiên cứu là vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris gây bệnh đốm lá trên cây cải ngọt. Hiện nay, tại các vùng trồng rau ở Huyện Củ Chi, Hóc Môn và quận 12, thành phố Hồ Chí Minh, bệnh đốm lá đang gây thiệt hại rất lớn cho nông dân trồng rau cải ngọt. Triệu chứng điển hình của bệnh là sự xuất hiện các đốm nhỏ có kích thƣớc 1 – 2 mm trên lá rau. Khi bệnh phát triển, các đốm bệnh lớn dần, có thể lên kết lại dẫn đến lá rau bị vàng và chết. Bệnh làm giảm năng suất cũng nhƣ chất lƣợng cây rau cải ngọt. Mục đích đề tài nhằm định danh tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật PCR, giải trình tự gen nhằm làm cơ sở cho các nghiên cứu phòng và trị bệnh sau này. Các nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Phân lập tác nhân gây bệnh từ các mẫu bệnh thu đƣợc từ các vùng trồng rau ở huyện Củ Chi, Hóc Môn và quận 12, thành phố Hồ Chí Minh. 2. Dùng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen nhằm định danh tác nhân gây bệnh. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: 1. Phân lập đƣợc 8 dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá tại các vùng trồng rau thuộc huyện Củ Chi, Hóc Môn và quận 12, Tp HCM. 2. Sử dụng kỹ thuật PCR đã khuyếch đại vùng 16S – 23S rDNA ITS làm vật liệu giải trình tự và gen hrpF đặc trƣng của vi khuẩn gây bệnh. 3. Do hạn chế phƣơng pháp giải trình tự gen không mang lại kết quả. Tuy nhiên, kết quả PCR cho phép xác định vi khuẩn gây bệnh thuộc giống Xanthomonas campestris pv. campestris. iii MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách các chữ viết tắt vi Danh sách các bảng vii Danh sách các hình viii 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích và yêu cầu 2 1.2.1. Mục đích 2 1.2.2. Yêu cầu 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Tổng quan nghiên cứu ngoài nƣớc 4 2.1.1. Lịch sử phát hiện và sự phân bố. 4 2.1.2. Tác nhân và triệu chứng bệnh 5 2.1.3. Tác động kinh tế của bệnh. 6 2.1.4. Sinh lý, sinh thái và điều kiện phát triển bệnh. 7 2.1.5. Hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn gây bệnh. 8 2.1.6. Phƣơng pháp phân lập và dịnh danh tác nhân gây bệnh 8 2.1.7. Những nghiên cứu về phát hiện và dịnh danh tác nhân gây bệnh bằng phƣơng pháp sinh học phân tử………………… 10 2.2. Tổng quan nghiên cứu trong nƣớc 12 2.3. Vùng ITS (rDNA intergenic spacer) và gen hrpF (hypersensitive reaction and pathogenicity). 13 2.3.1. Gen hrpF (hypersensitive reaction and pathogenicity). 13 iv 2.3.2. Ribosome DNA (rDNA). 13 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 15 3.1. Thời gian và địa điểm 15 3.1.1. Thời gian 15 3.1.2. Địa điểm 15 3.2. Vật liệu 15 3.3. Hóa chất 15 3.3.1. Các hóa chất dùng ly trích DNA từ vi khuẩn 15 3.3.2. Các hóa chất dùng trong điện di 16 3.3.3. Hóa chất cho phản ứng PCR (do công ty Bio – Rad cung cấp) 16 3.3.4. Môi trƣờng 17 3.4. Dụng cụ, thiết bị 17 3.5. Phƣơng pháp 17 3.5.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu bệnh 17 3.5.2. Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật từ mẫu bệnh 18 3.5.3. Phƣơng pháp chủng bệnh trên rau cải trồng trong nhà lƣới 18 3.5.3.1. Phƣơng pháp trồng cây kí chủ 18 3.5.3.2. Chủng bệnh 19 3.5.4. Phƣơng pháp ly trích DNA từ vi khuẩn 20 3.5.5. Phƣơng pháp PCR 20 3.5.5.1. Khuếch đại đoạn DNA trong vùng ITS của vi khuẩn 20 3.5.5.2. Khuếch đại đọan DNA trong gen hrpF 22 3.5.6. Phƣơng pháp điện di và đọc kết qủa 22 3.5.6.1. Điện di trên gel agarose 22 3.5.6.2. Đọc kết quả điện di 22 3.5.7. Phƣơng pháp xác định trình tự gen từ sản phẩm PCR. 23 3.5.7.1. Chuẩn bị khuôn DNA. 23 3.5.7.2. Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). 24 3.5.7.3. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại. 25 3.5.7.4. Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy sequencer. 25 v 3.5.7.5. Quy trình tóm tắt các bƣớc đọc trình tự. 26 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1. Kết quả thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn gây bệnh. 27 4.2. Kết quả chủng bệnh trên rau cải ngọt trồng trong nhà lƣới 28 4.3. Kết quả ly trích và pha loãng DNA vi khuẩn. 31 4.4. Kết quả phản ứng PCR. 32 4.4.1. Kết quả PCR khuếch đại vùng ITS. 32 4.4.2. Kết quả điện di tinh sạch sản phẩm PCR 32 4.4.3. Kết quả PCR khuếch đại vùng hrpF. 33 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC 39 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CTAB :Cethyltrimethylammonium bromide EDTA :Ethyleneediamine tetraacetic acid ng : nano gram cDNA : complementary DNA nm : nano mol g : micro gram m : micro mol M : micro mol/lít l : micro lít TE : tris EDTA dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate TAE : tris acetic EDTA UI : unit international bp : base pair Kb : kilo base SDS : Sodium dodecyl sulphate PDA : Potato Dextrose agar RFLP : Restriction Fragment Lengh Polymorphism RAPD : Random Amplification of Polymorphic DNA Tm : melting temperature ctv : cộng tác viên PCR : Polymerase Chains Reaction UV : Ultra violet CC : Củ Chi HM : Hóc Môn Q12 : Quận 12 DC : Đối chứng vii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 1.1 Sự phát triển của một số loài vi khuẩn Xanthomonas trên môi trƣờng bán chọn lọc 9 Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR……………………………………… 20 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan 322…21 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi XCR và XCF……… 21 Bảng 3.4 Lƣợng DNA tối ƣu cho phản ứng đọc trình tự………………………. 23 Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự…………… 24 Bảng 4.1 Danh mục các dòng vi khuẩn sử dụng trong đề tài……………… 26 [...]... nhân gây bệnh là việc cần thiết nhằm làm cơ sở cho các nghiên cứu phòng trừ sau này Đó là lý do tôi chọn thực hiện đề tài: Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá cây cải ngọt tại Tp HCM bằng phƣơng pháp PCR và giải trình tự vùng 16 S – 23S rDNA Đề tài là một phần trong chƣơng trình nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên cây họ thập tự của Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Đại Học Nông Lâm Tp HCM 1. 2 Mục đích và. .. nhà lƣới - Chọn lọc các dòng vi khuẩn gây bệnh trong số các dòng thu thập đƣợc dựa vào kết quả chủng bệnh - Ly trích DNA và thực hiện phản ứng PCR định danh tác nhân gây bệnh - Đọc trình tự vùng 16 S – 23S rDNA Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 .1 Tổng quan nghiên cứu ngoài nƣớc 2 .1. 1 Lịch sử phát hiện và sự phân bố 4 Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây rau họ thập tự phân bố rộng rãi, chúng đã đƣợc ghi nhận... năm từ 19 89 – 19 92 bệnh xuất hiện và gây hại nặng trên cây cải bông (Shyam, 19 94) Vi kuẩn gây bệnh đã đƣợc tìm thấy từ hạt cải bắp ở Nhật Bản năm 19 88 (Shiomi, 19 92) Ở Hàn Quốc, đốm lá là bệnh quan trọng trên cây cải bắp (Kim, 19 86) Schaad và Taveechi (19 83) đã báo cáo rằng: bệnh xuất hiện ở vùng phía bắc, tây bắc và miền trung Thái Lan Theo CPC (Crop protection compendium) (20 01) cho đến nay, bệnh đã.. .DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2 .1 Sản phẩm rep – PCR trong nghiên cứu của Youfu Zhao và ctv………………………………… 10 Hình 2.2 Cấu trúc vùng 16 S – 23S rDNA ITS của vi khuẩn Xanthomonas.………………………………………… ………… 11 Hình 3 .1 Sơ đồ tóm tắt quy trình đọc trình tự sản phẩm PCR …………… 25 Hình 4 .1 Lá cải bị bệnh thu thập ngoài ruộng rau…………………………… 26 Hình 4.2 Vết bệnh trên lá cải thu thập ngoài... 1. 2 .1 Mục đích Định danh tác nhân gây bệnh đốm lá trên cây cải ngọt làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn sau này nhằm phòng trừ bệnh có hiệu quả, giảm thiểu thiệt hại cho nông dân trồng rau 3 1. 2.2 Yêu cầu - Thu thập mẫu bệnh phẩm tại các vùng trồng rau Củ Chi, quận 12 , Hóc Môn - Phân lập vi sinh vật từ mẫu bệnh phẩm - Chủng bệnh trên cây rau cải trồng trong nhà lƣới - Chọn lọc các dòng vi khuẩn gây. .. đốm lá trên cây củ cải trắng và cây cải ngựa (horseradish), kết quả cho thấy, tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Xanthomonas campesrtis pv armoraciae hoặc Xanthomonas campesrtis pv raphani Ở Queensland, Australia, tác nhân gây bệnh đốm lá họ thập tự do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv campestris gây nên Vi khuẩn thƣờng gây hại mạnh trên các giống cải (Moffett, M.L và ctv, 19 76) Nhƣ vậy, tác nhân gây bệnh. .. mặt lá Tác nhân là do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv armoraciae gây nên Xanthomonas campestris pv campestris và các chủng khác thuộc loại này nhƣ X campestris pv abbrans, raphani, armmoraciae, và incanae đƣợc biết đến nhƣ là những chủng gây bệnh đốm lá hoặc cháy lá chữ V trên các cây trồng họ thập tự (J.G Vicente, 20 01) Cũng theo J.G Vicente và ctv (2006) phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm. .. năm 19 60 và 19 70, bệnh gây hại rất nặng rên cánh đồng trồng cải bắp của bang Texas Năm 19 72 và 19 73, bệnh đã gây thành dịch cho các khu vực Đông – Bắc, và các bang phía tây nƣớc Mỹ, khoảng 70% cây con lấy từ típ ƣơm cây đều bị nhiễm bệnh, sự thiệt hại này ƣớc tính là khoảng 7 1 triệu USD Ở Canada, trong vụ Đông 19 79 – 19 80, bệnh gây tổn thất khoảng 60% sản lƣợng cải bắp Ở miền nam tỉnh Buenos Aires –. .. Bắc Mỹ và Nam Mỹ (Bradbury, 19 86) Bệnh đƣợc ghi nhận lần đầu tiên vào năm 19 29 trên cây cải ngựa, năm 19 30 phát hiện trên củ cải trắng và củ cải đỏ (Youfu Zhao và ctv, 2005) Bệnh cũng đƣợc tìm thấy ở nhiều vùng thuộc nƣớc Mỹ nhƣ Riverside, Santa Barbara, Santa Clara (Matsumoto, 19 75) Bệnh này đƣợc ghi nhận gây hại trên họ thập tự ở Argentina (Gaetan, 19 95) và ở Brazil trong năm 19 92 (Leit, 19 94) Ở... trên lá sẽ thấy các đốm màu nâu Bệnh cũng xuất hiện ở phần thân và cuống lá làm cho lá bị cong lại và vết bệnh có màu đen Bệnh làm giảm năng suất, giá trị thƣơng phẩm của rau, giảm thời gian bảo quản nên giá trị kinh tế không cao Hơn nữa, ngoài cải ngọt, bệnh cũng gây hại trên khá nhiều các loại cây trồng khác cùng họ thập tự nh : cải bắp, súp lơ, cải thảo, cải xanh Chính vì vậy, xác định đƣợc tác nhân . LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ CÂY CẢI NGỌT TẠI TP. HCM BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG 16 S – 23S. tài: Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá cây cải ngọt tại Tp. HCM bằng phƣơng pháp PCR và giải trình tự vùng 16 S – 23S rDNA . Đề tài là một phần trong chƣơng trình nghiên cứu bệnh. ii TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu: Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá cây cải ngọt tại Tp HCM bằng phƣơng pháp PCR và giải trình vùng 16 S – 23S rDNA đƣợc thực hiện từ ngày 6 tháng