26 thể sinh vật tiết môi trường sống Đó enzyme ngồi tế bào (extracellular) Enzyme vi sinh vật thường chiết enzyme ngoại bào 27 2.2.2 Chiết rút enzyme Muốn tìm hiểu tồn hoạt động sống thể sinh vật, phải biết chất biến đổi hóa học xảy mơ tế bào Điều thực tách tế bào khỏi mô chiết rút làm enzyme chứa chúng Từ dạng enzyme tinh khiết thu nghiên cứu sâu sắc chế tác dụng, tính đặc hiệu hoạt động xúc tác chúng Tùy theo đặc tính riêng biệt loại enzyme mà lựa chọn phương pháp làm cho thích hợp Trong q trình tinh chế enzyme, trình tự thủ thuật bước thay đổi , song có nguyên tắc chung Như biết, thể sinh vật, enzyme có tế bào chất cấu tử (nhân, microsome, ty thể, lysosome ) tế bào Tế bào bao bọc lớp màng Lớp màng vi khuẩn đơi bền dày Người ta cịn thấy nhiều enzyme liên kết chặt chẽ với cấu tử tế bào Các phân tử enzyme khơng có khả qua màng tế bào màng cấu tử tế bào Do để chiết rút enzyme nội bào, bước phải phá vỡ cấu trúc tế bào có chứa enzyme chuyển chúng vào dung dịch Có thể phá vỡ cấu trúc tế bào biện pháp học nghiền với bột thủy tinh cát thạch anh, làm đồng hóa thiết bị đồng hóa (homogenizator) Thiết bị có chày thủy tinh gắn với mơtơ quay điều chỉnh tốc độ quay theo yêu cầu Các tế bào chày thủy tinh thành cối bị phá hủy Để việc phá vỡ có hiệu mô thực vật, trước nghiền người ta thường thái nhỏ mẫu để vào ngăn đá cho trương nước (ví dụ mẫu hạt khơ) Cịn mô động vật gan thận, chiết enzyme người ta cần cắt bỏ mô liên kết Muốn tách enzyme cấu tử tế bào, người ta phải dùng yếu tố vật lý hóa học khác sóng siêu âm, dùng dung môi hữu butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate chất detergent Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ cấu tử tế bào quan thường chứa mỡ Sau phá vỡ cấu trúc tế bào, enzyme chiết nước cất, dung dịch đệm thích hợp dung dịch muối trung tính 28 Có số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết rút cần lưu ý Trước hết nhiệt độ Để tránh hoạt tính chí vơ hoạt, cần chiết rút tiến hành kết tủa enzyme nhiệt độ thấp (từ đến 0C) Các thao tác phải nhanh Một số chất điện ly làm tăng trình chiết rút enzyme NaCl, ZnCl2, CaCl2 Tác dụng chúng phụ thuộc vào phương pháp dùng chiết rút Ví dụ dùng máy nung ba chất có tác dụng Nếu để lắng NaCl có tác dụng Vì cần dùng chất điện ly thích hợp Ví dụ chiết rút amylase, cho thêm NaCl 0,1 - 0,2 % vào dung dịch chiết rút hiệu suất chiết rút tăng lên 30% Người ta nhận thấy, thêm vào dịch chiết CaCl2 0,2% làm cho kết tủa enzyme tốt cấu trúc kết tủa tốt Trong trình chiết rút enzyme đối tượng động, thực vật, có trường hợp cịn có mặt chất màu làm ảnh hưởng đến việc làm xác định hoạt độ enzyme Trong trường hợp người ta cho thêm vào chất khử để loại màu Màu hemoglobin hồng cầu chlorophyll số chất màu khác bị loại trừ hỗn hợp ethanol, chloroform với tỷ lệ thích hợp Hoạt độ enzyme superoxide dismutase (SOD) - enzyme chống ơxy hóa xác định sau loại màu khỏi dịch chiết enzyme Ở mẫu từ động vật có sắc tố melanin màu nâu Người ta thường loại màu cột nhựa trao đổi ion cách cho dịch enzyme qua cột lắc Khi qua cột, chất màu bị giữ lại enzyme không bị giữ Ví dụ người ta hay dùng DEAE - cellulose (Diethylamino ethyl - cellulose) than hoạt tính Trong trình phải ý kiểm tra pH Sau loại màu cần kiểm tra lại hoạt độ enzyme Trong dịch chiết, ngồi enzyme cịn có protein cấu trúc, chất cao phân tử khác polysaccharid nucleic acid, chất có phân tử nhỏ đường monose, chất lipid, muối khoáng Để loại chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác Để loại bỏ muối khoáng loại đường tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối dung dịch đệm loãng cách lọc qua gel sephadex Cách làm thẩm tích sau: cho dung dịch enzyme vào túi colodion cellophane (thông thường người ta dùng cellophane tốt hơn), sau đặt túi vào nước cất dung dịch đệm pha lỗng (như đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M chẳng hạn) Màng cellophane màng bán thấm, có kích thước lỗ cho chất có phân tử nhỏ xuyên qua vào dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán Còn lại màng chất protein có phân tử lớn (Hình 2.1) 29 Hình 2.1 Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 kết tủa protein Để loại bỏ protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) chất có phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp phương pháp khác nhau: phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng nhiệt độ pH môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn muối trung tính dung môi hữu cơ, phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel Phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng nhiệt pH môi trường dùng trường hợp enzyme bền với nhiệt bền với acid Thủ thuật tiến hành sau: dịch enzyme giữ 50 70 C hay pH = thời gian xác định Protein bị biến tính loại bỏ cách lọc ly tâm 2.2.3 Các phương pháp tách phần protein enzyme Protein chất lưỡng tính,vì dung dịch acid kiềm chúng bị phân ly sau: kiềm protein - COO- + H+ Protein - COOH acid acid protein - NH+3 Protein - NH2 kiềm Ở số pH xác định, phân tử protein có điện tích tổng số mà độ lớn phụ thuộc vào số lượng nhóm tích điện dương tích điện âm Kết số nồng độ ion hydro cố định, protein khác hỗn hợp có tổng điện tích khác 30 Nhiều phương pháp dùng để tách hỗn hợp protein dựa vào đặc tính Các phân tử protein mang điện tích tổng số (dương âm) dấu đẩy xa nên dễ tan vào dung dịch Mỗi protein có trị số pH định mà tổng số điện tích âm điện tích dương phân tử khơng Trị số pH gọi điểm đẳng điện Ở điểm đẳng điện, độ hòa tan protein thấp nhất, protein dễ bị kết tủa.Dựa vào tính chất này, người ta tách phần protein enzyme hỗn hợp Ở phương pháp tách phần này, người ta sử dụng phương pháp kết tủa thuận nghịch muối dung môi hữu cơ, phương pháp sắc ký cột Nói chung để đạt kết tốt, người ta thường phối hợp hai phương pháp với 2.2.3.1 Dùng muối (NH4)2 SO4 để tách enzyme Phương pháp kết tủa phân đoạn (NH4)2 SO4 dựa sở khác khả kết tủa protein enzyme nồng độ muối (tính theo phần % nồng độ bão hịa) xác định dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp dịch enzyme Các loại muối dùng (NH4)2 SO4, Na2 SO4, MgSO4 người ta nhận thấy muối (NH4)2 SO4 tốt khơng làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết loại enzyme Loại muối lại rẻ phổ biến Độ hịa tan lại lớn (bão hịa 767g/l 250C) Ngồi nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết để kết tủa enzyme khác khác nhiều Ví dụ: Protease nấm mốc dễ bị kết tủa 70% (NH4)2 SO4 bão hịa hồn tồn, cịn amylase mầm lúa bị kết tủa 50% độ bão hòa dung dịch muối Điều nói lên tính kết tủa lựa chọn (NH4)2SO4 cao muối khác Thường dùng hai dạng bột bão hòa - Khi dùng bột: Người ta cho vào dịch chiết enzyme Cách cho ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu enzyme Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo hịa tan muối - Khi dùng dung dịch bão hòa: Trong nhiều sách phương pháp nghiên cứu người ta đưa bảng tính số lượng muối cần thiết để pha dung dịch có độ bão hịa khác nhiệt độ định Khái niệm số phần trăm độ bão 31 hịa hồn tồn đề cập đến Như ví dụ nói, enzyme bị kết tủa 50% (0,5) 70% (0,7) độ bão hịa hồn tồn (NH 4)2 SO4 Khi cho dung dịch (NH4)2 SO4 vào dịch chiết enzyme nồng độ (NH4)2 SO4 khơng tăng đột ngột Sau kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2h để qua đêm, mục đích tạo kết tủa hoàn toàn (ở phương pháp dùng dung mơi hữu khơng cần để lâu) Kết tủa lấy cách ly tâm lọc qua phễu Buckner Khi hòa tan kết tủa lại người ta thường thêm ion Ca++ làm bền (CaCl2 Ca(COOH)2) Ở giai đoạn loại muối, người ta dùng phương pháp thẩm tích trình bày phần trước Thời gian thẩm tích thường 24 - 28h, nước thay nhiều nhanh tốt Có thể loại muối cách lọc qua gel sephadex G25 dẫn suất dextran Ưu phương pháp tiến hành với thời gian ngắn (khoảng 30 '), nên không làm hoạt độ enzyme Muối có trọng lượng phân tử bé bị giữ lại, enzyme có trọng lượng phân tử lớn xuống trước (xem phương pháp lọc gel 2.2.3.4.a) Giai đoạn làm đông khô thành bột trắng Chuyển trạng thái từ dịch nước đá sang trạng thái khí mà khơng qua trạng thái lỏng Để tiện lợi người ta đưa cơng thức cách tính lượng (NH 4)2 SO4 cho vào dung dịch có độ bão hòa cho trước (S1) để đạt đến độ bão hòa cần thiết (S2) Tùy theo trạng thái (NH4)2 SO4 cho thêm vào dung dịch chiết enzyme, mà có cơng thức tính tốn khác - Đối với (NH4)2 SO4 dạng bột 0,515 x V (S2 - S1) x (g) = - 0,272 S2 Trong V thể tích dung dịch S1, S2 độ bão hòa cho trước độ bão hòa cần đạt ví dụ S1= 0,5 S2= 0,7 chẳng hạn Người ta dùng đồ tốn (nomogram) để chiếu xác định lượng (NH4)2 SO4 thêm vào để dung dịch enzyme đạt 32 độ bão hịa định Hoặc đối chiếu bảng có sẵn Lượng (NH4)2 SO4 đưa vào để dung dịch có độ bão hịa định có khác tùy thuộc nhiệt độ thí nghiệm - Đối với (NH4)2 SO4 dạng dung dịch bão hịa Thể tích (tính theo ml) dung dịch bão hòa cần cho vào 100ml dung dịch có độ bão hịa ban đầu S1 để đạt đến độ bão hòa S2 cần thiết tính theo cơng thức sau: 100 (S2 - S1) V (ml) = - S2 2.2.3.2 Dùng dung môi hữu Phương pháp tiến hành dựa sở: độ hòa tan protein phụ thuộc vào tương tác nhóm tích điện phân tử protein với phân tử nước Sự tương tác (cịn gọi hydrate hóa) bị giảm xuống thêm vào dung dịch enzyme dung môi hữu Dung môi hữu thường dùng ethanol, isopropanol, acetone hỗn hợp loại rượu Ở phương pháp ý tiến hành nhiệt độ thấp (từ 50C trở xuống) Dùng dung mơi hữu tiến hành tách phân đoạn 00C đến - 200C, có tác dụng tốt đến độ ổn định protein enzyme Khi có kết tủa, ý lấy nhanh kết tủa khỏi dung môi cách dùng máy li tâm Phương pháp có lợi khơng cần loại muối, có nhược điểm hay có màu 2.2.3.3 Dùng nhiệt Cũng dùng nhiệt để loại bỏ protein enzyme tạp khỏi dịch chiết enzyme Tuy phương pháp dùng enzyme bền với nhiệt 2.2.3.4 Các kỹ thuật sắc ký cột Dịch chiết enzyme loại bỏ phần lớn protein tạp chưa đảm bảo độ đồng cần thiết Do dịch chiết enzyme 33 tiếp tục làm phương pháp sắc ký cột Phương pháp sắc ký (chromatography) hai chữ "chroma" màu sắc " grapho" viết, nghĩa "viết màu" Thuở ban đầu, người ta sử dụng phương pháp sắc ký để tách chất màu sau người ta áp dụng cho việc tách chất không màu a Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - gel filtration) Cơ sở phương pháp lọc gel dựa vào khác kích thước hình dạng phân tử lượng enzyme có hỗn hợp để tách chúng Để đảm bảo cho việc tách enzyme tốt, chất rây phân tử phải chất trơ, không phản ứng với protein enzyme Chất khơng hịa tan tương đối bền với yếu tố học sinh học Ngoài chất sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải chất khơng có tính đàn hồi (khơng co) phải chất ưa nước (hydrophyl) Gel sephadex chất thoả mãn yếu tố Sephadex chế phẩm dextran loài vi sinh vật khác Leuconostoc tạo chúng nuôi cấy môi trường chứa saccharose Trọng lượng phân tử dextran đạt tới hàng triệu lớn Phân tử dextran bao gồm chuỗi gốc glucose tạo thành liên kết glucsid 1,6 Sephadex nhận từ dextran cách xử lý hóa học (do tác dụng epichlohidrin) để tạo lưới phân nhánh có liên kết ngang gọi "sàng phân tử" chất trở thành không tan nước Số liên kết ngang tạo nhiều, kích thước lỗ sàng phân tử nhỏ Phương pháp lọc sephadex tiến hành sau: cho sephadex vào cột thủy tinh dài cân bằng dung dịch đệm có pH định Sau cho dung dịch enzyme lên cột Khi lọc chiết dung mơi thích hợp, phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ (ở muối) khuyếch tán chậm chạp qua lỗ nhỏ hạt Sephadex bị trương phồng, cịn chất có trọng lượng phân tử lớn (ở trường hợp protein enzyme ) khơng có khả vào mà lách nhanh qua hạt sephadex rơi xuống trước, chiết nhanh khỏi cột (Hình 2.2 hình 2.3.) Vì ta tách chất có trọng lượng phân tử cao khỏi chất có phân tử lượng nhỏ Hãng Sephadex (Pharmacia) Thuỵ Điển tung thị trường loại sephadex có kích thước khác 34 có ký hiệu từ G10 đến G200 Số ký hiệu nhằm mức độ nhận (hút) nước chúng Ví dụ G10 để trương phồng 1g gel khơ nhận 1ml nước (1ml/g) muäúi protein Hình 2.2 Hoạt động lọc phân tử sephadex Các sephadex có ký hiệu khác từ G10 đến G200 phục vụ việc lọc phân tử cho phép chất có trọng lượng phân tử khác lọt vào ngưỡng sau đây: Các loại sephadex Trọng lượng phân tử G 10 - 700 G 15 - 1.500 G 25 hạt tinh (F) 100 - 5000 hạt thô (C) G 50 hạt tinh (F) 1500 - 30.000 hạt thô (C) G 75 3.000 - 70.000 G 100 4.000 - 150.000 G 150 5.000 - 400.000 G 200 5.000 - 800.000 35 Các gel lọc phân tử sản xuất cỡ hạt vịng lọc phân tử: hạt thơ (coarse), hạt trung bình (medium), hạt mịn (fine), hạt siêu mịn, mịn (superfine) Cạc phán tỉí låïn khäng thãø âi vo cạc hảt Sephadex Hảt Sephadex Cạc phán tỉí nh âi vo bãn cạc hảt Sephadex Hình 2.3 Tách phân tử theo kích thước sắc ký lọc gel Sự chênh lệch nhiều phân tử lượng enzyme (12700 1.000.000) cho phép nghỉ để tách làm enzyme, phương pháp lọc gel sephadex phương pháp có nhiều triển vọng Nơi có liên kết ngang tách chất có trọng lượng phân tử lớn ngược lại Người ta sử dụng sephadex để loại muối thay cho q trình thẩm tích Cùng nhóm chất rây phân tử có nguồn gốc polysaccharid, chế phẩm dextran sephadex (pharmacia) cịn có Molselect (Reanal) - sản phẩm Hungary ứng dụng nhiều nghiên cứu Có thể dùng để làm đặc chất có trọng lượng phân tử lớn protein, peptid, loại muối khỏi protein enzyme (dùng nhanh so với thẩm tích), lọc gel tách theo trọng lượng phân tử (như protein huyết thanh) tách sản phẩm protein hình thành tác dụng enzyme phân cắt (như γ - G - globulin bị cắt papain) 36 Các Molselect có ký hiệu từ G10 đến G200 phục vụ việc lọc phân tử cho phép chất có trọng lượng phân tử khác lọt vào ngưỡng sau đây: Các loại Molselect Trọng lượng phân tử G - 10