VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Lớp: KSCNSH 06 - 01 LUẬN VĂN BÁO CÁO Định lượng kháng nguyên Cyfra 21- 1 bằng kỹ thuật Real SVTH: Đinh Thị Thu Hằng Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 Mục lục Mở đầu Theo thống kê của Tổ chức Nghiên cứu ung thư Thế giới (International Agency for Research on Cancer_ IARC), ung thư phổi là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong số các bệnh về ung thư. Tổng số người chết vì ung thư phổi Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH 2 2 Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 hàng năm cao hơn tổng số người chết vì ung thư vú, ung thư ruột và ung thư tuyến giáp, và đứng thứ hai trong tổng số tử vong vì bệnh sau các bệnh về tim mạch. Các thống kê từ hiệp hội Ung thư quốc gia của Việt Nam cũng đưa ra những cảnh báo tương tự, số bệnh nhân ung thư phổi gia tăng liên tục trong những năm gần đây. Phần lớn bệnh nhân ung thư khi được phát hiện đã ở giai đoạn cuối không chữa trị được, đa số bệnh nhân bị tử vong. Vì rất nhiều lí do như: hút thuốc lá, môi trường sống bị ô nhiễm, thực phẩm không an toàn… nên căn bệnh nguy hiểm này ngày càng trở nên phổ biến. Mặc dù đây là một căn bệnh rất nguy hiểm nhưng nếu bệnh nhân được phát hiện sớm và được điều trị theo những phác đồ thích hợp thì người bệnh vẫn có cơ hội được cứu sống, thậm chí là khỏi bệnh. Ngoài những phương pháp chẩn đoán ung thư truyền thống như: chụp hình phổi bằng X_quang, chụp CT Scan phổi….các nhà khoa học đang nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra cách chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh ung thư. Sự phát triển như vũ bão của ngành sinh học phân tử đã mở ra một hướng mới trong nghiên cứu Sinh_Y_Dược học. Việc tìm ra những chỉ thị sinh học đã giúp cho các bác sĩ chẩn đoán và phát hiện bệnh một cách nhanh chóng, có độ chính xác cao hơn. Các chỉ thị sinh học có liên quan đến chẩn đoán bệnh ung thư cũng đang được quan tâm. Trong đo, Cyfra21-1 là một chỉ thị có độ nhạy tương đối cao đối với ung thư phổi và đang được nghiên cứu. Do đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 bằng kỹ thuật Real-time PCR”. Để từ đó nghiên cứu và tạo ra một bộ Kít định lượng để có thể chẩn đoán Ung thư phổi một cách nhanh chóng, có độ chính xác cao. Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH 3 3 Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Ung thư phổi 1.1.1. Khái niệm chung về ung thư phổi Ung thư phổi còn được gọi là ung thư phế quản – phổi nguyên phát, gây ra do tế bào ung thư phát triển từ biểu mô phế quản (hiếm khi phát triển từ biểu mô phế Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH 4 4 Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 nang). Ung thư phổi khi đã phát hiện được thường là một khối rắn chắc có đường kính từ 2- 10cm, thậm chí còn lớn hơn. Mặt ngoài khối u thường gồ ghề, nhiều múi, nhăn nhúm. Mặt cắt khối u thường đồng nhất, hay có mầu trắng như tổ chức não. 1.1.2. Phân loại ung thư phổi Tùy thuộc vào hình dạng quan sát được dưới kính hiển vi mà người ta phân chia ung thư phổi thành hai loại chính: ung thư phổi tế bào nhỏ và ung thư phổi không phải tế bào nhỏ. Mỗi loại ung thư phát triển theo những cách khác nhau và được điều trị theo những phác đồ điều trị khác nhau. - Ung thư phổi tế bào nhỏ (small_cell carcinoma) chiếm khoảng 20% trong số các bệnh ung thư phổi, loại này thường phát triển ở phế quản – phổi (không ở ngoại vi phổi). Mặc dù tế bào ung thư là những tế bào nhỏ, nhưng chúng phát triển rất nhanh và tạo thành những khối u lớn, có khả năng lan rất xa trước khi có triệu chứng lâm sàng. Nhiều trường hợp khi phát hiện không thể mổ được nữa, tử vong nhanh. Đây là loại ung thư có quan hệ mật thiết với thuốc lá và là loại ung thư ác tính nhất.[3] Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH 5 5 Hình 1: Ung thư phổi Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 - Ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (non small _cell carcinoma) chiếm khoảng 80% trong số các bệnh ung thư phổi, ung thư phổi không phải tế bào nhỏ thường gặp hơn ung thư phổi tế bào nhỏ. Nó thường phát triển và lan chậm hơn ung thư phổi tế bào nhỏ. Có ba loại ung thư phổi không phải tế bào nhỏ chủ yếu, chúng được đặt tên theo loại tế bào mà từ đó ung thư phát triển.[3] + Ung thư tế bào tuyến (adenocarcinoma, AC): xuất phát từ tế bào tuyến nhầy trong thành phế quản, chiếm tỷ lệ khoảng 30-45% trong các loại ung thư phổi. Đây là loại ung thư phổi phổ biến nhất ở phụ nữ và những người không hút thuốc.[3] + Ung thư tế bào sừng (squamous_cell carcinoma; SCC): hay xuất hiện ở phế quản lớn và làm chít hẹp lòng phế quản.Đây là loại ung thư phổi phổ biến nhất ở nam giới, chiếm tỷ lệ khoảng 30-35% trong các loại ung thư phổi.[3] + Ung thư tế bào lớn (large_cell carcinoma; LCC): hình thành gần bề mặt phổi, chiếm tỷ lệ khoảng 10-15% trong các loại ung thư phổi.[3] 1.1.3. Triệu chứng của bệnh ung thư phổi Những người mắc bệnh ung thư phổi thường có các triệu chứng sau: - Ho không khỏi và ngày càng nặng hơn. - Thường xuyên thấy đau ngực. - Ho ra máu. - Khó thở, ngạt mũi, khản giọng. - Phù nề vùng mặt và cổ. - Mệt mỏi. - Mất cảm giác ngon miệng, sút cân. - Thường xuyên bị viêm phổi và viêm phế quản. 1.1.4. Chẩn đoán bệnh ung thư phổi Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH 6 6 Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 Khi người bệnh bị nghi ngờ mắc ung thư phổi, các bác sĩ sẽ xem xét tiền sử người bệnh, tiền sử hút thuốc, tiếp xúc với các chất ở môi trường tự nhiên và môi trường lao động, các yếu tố di truyền… Sau đó, các bác sĩ có thể cho chụp X_Quang lồng ngực, xét nghiệm tế bào trong đờm (quan sát dưới kính hiển vi những tế bào lấy từ mẫu dịch nhầy ở phổi khi ho), đây là một xét nghiệm đơn giản mà có thể có ích cho việc phát hiện ra bệnh ung thư phổi. Ngoài ra, con có thể sử dụng kĩ thuật Sinh thiết (lấy một mẫu mô nhỏ ở phổi để quan sát dưới kính hiển vi. Qua đó có thể cho biết một người có bị ung thử phổi hay không). Một số thủ thuật dùng để lấy mẫu bệnh phẩm: nội soi phế quản, chọc hút bằng kim, chọc dịch màng phổi, mở lồng ngực… Hiện nay, còn có thêm các xét nghiệm mẫu máu, sử dụng các chỉ thị như Cyfra 21-1 để chẩn đoán bệnh.[1] 1.1.5. Các nguyên nhân dẫn đến bệnh ung thư phổi Các công trình nghiên cứu hiện nay chưa cho biết chính xác nguyên nhân gây ra ung thư phổi. Tuy vậy, người ta cũng xác định được những yếu tố gắn liền với quá trình phát sinh bệnh như: hút thuốc lá, tiếp xúc nhiều với các hóa chất độc hại như amiang, niken…. 1.1.5.1. Nghiện hút thuốc lá, thuốc lào Trong khói thuốc lá có chứa các chất Hydrocacbua thơm nhiều vòng, trong số đó độc nhất là chất 3,4 benzopyrene với hàm lượng 0.5 µg/1 điếu thuốc lá (P.Freour, 1979). Chất này đóng vai trò quan trọng trong phát sinh ung thư phổi. Ngoài ra trong khói thuốc lá còn chứa các chất gây ung thư khác như nitrosamine, benzanthracene. Các chất này cũng là nguyên nhân gây ra bệnh Ung thư phổi. Trong khóa họp vào tháng 11 năm 1982 tại Geneve, các chuyên gia về ung thư phổi đã thống nhất kết luận rằng 80-90% nguyên nhân dẫn đến ung thư phổi là do hút thuốc lá. Tại Việt Nam, theo thống kê trên 389 bệnh nhân mắc ung thư Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH 7 7 Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 phổi đã được phẫu thuật thì: 70% số bệnh nhân có hút thuốc lào, 52% hút thuốc lá, 10,49% hút cả thuốc lá và thuốc lào. Những người hút các loại khác và những người hít phải khói thuốc lá (hút thuốc lá thụ động) cũng có nguy cơ tương tự. Ngừng hút thuốc lá sẽ làm giảm đáng kể khả năng mắc ung thư phổi. 1.1.5.2. Radon Radon là một chất khí phóng xạ không màu, không mùi và không nhìn thấy bằng mắt thường. Trong tự nhiên radon có trong sỏi đá. Nó có thể làm tổn hại tới phổi và từ đó có thể dẫn đến ung thư phổi. Những người làm việc trong hầm mỏ có thể tiếp xúc với khí radon. Ở một số vùng ở Mỹ, người ta còn tìm thấy khí radon ở trong những ngôi nhà. 1.1.5.3. Amiang Amiang là tên gọi của một nhóm các chất khoáng, chúng tồn tại trong tự nhiên dưới dạng sợi và được sử dụng trong một số nghành công nghiệp. Amiang có hai nhóm chính là nhóm amphibole và nhóm serpentine. Nhóm amphibole khi hấp thụ qua đường hô hấp và lưu lại trong phổi sẽ rất khó bị đào thải ra ngoài. Các sợi thuộc nhóm amphibole là nguyên nhân chính gây ra các bệnh ung thư phổi, u trung biểu mô. 1.1.5.4. Nghề nghiệp Các thống kê bệnh học cho thấy, chất phóng xạ đóng vai trò quan trọng trong phát sinh bệnh ung thư. Những người thường xuyên tiếp xúc với các chất phóng xạ, niken, cromat, amian và các chất sinh ra do chưng cất hắc ín thường dễ bị ung thư. Các chất này cũng là nguyên nhân dẫn đến Ung thư phổi ở những người không hút thuốc (chiếm khoảng 15-20%). Nghiên cứu của Doll (1958) cho thấy: công nhân làm việc trong công nghiệp niken bị chết do Ung thư phổi là 26%, cao hơn 9 lần so với những công nhân làm việc trong các ngành công nghiệp khác. Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH 8 8 Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 1.1.5.5. Môi trường Các nhà nghiên cứu đã tìm ra mối liên kết giữa bệnh ung thư phổi và sự phơi nhiễm với một số chất gây ô nhiễm môi trường không khí nhất định (ví dụ: các sản phẩm phụ sinh ra trong quá trình đốt dầu Diezen và những nguyên liệu hóa thạch). Tuy nhiên, mối quan hệ này vẫn chưa được xác định một cách rõ ràng và vẫn đang tiếp tục được nghiên cứu. Nhiều thống kê cho thấy, tỉ lệ mắc ung thư phổi ở các thành phố công nghiệp, đặc biệt là các thành phố có ngành công nghiệp hóa chất cao hơn hẳn so với các vùng nông thôn. Trong bầu khí quyển của các thành phố này có chứa nhiều chất độc hại như benzopyren… Các chất này kích thích và gây ra phản ứng với lớp niêm mạc của đường hô hấp làm cho quá trình tiết chất nhầy bị chậm lại, sau đó biểu mô bị bong ra, rồi lại được tái sinh. Những chu kì như vậy liên tiếp diễn ra đã kích thích sự tăng sản của tế bào đáy, dị sản của tế bào biểu mô đẫn đến sự hình thành và phát triển của các tế bào ung thư. 1.1.5.6. Các yếu tố khác Ngoài những nguyên nhân trên, các nhà khoa học còn phát hiện thấy virus là nguyên nhân gây Ung thư phổi ở khỉ. Điều này đặt ra câu hỏi: liệu ung thư phổi có phải do virus gây ra không? Đây vẫn là một ẩn số lớn đối với các nhà khoa học. Tiền sử bản thân người bệnh cũng là một nguyên nhân gây ung thư phổi. Một người đã mắc ung thư phổi một lần có nguy cơ mắc ung thư phổi lần hai cao hơn so với một người chưa bao giờ mắc bệnh ung thư phổi.Bỏ hút thuốc sau khi được chẩn đoán ung thư phổi có thể ngăn ngừa nguy cơ bị ung thư phổi lần hai. Các nhà nghiên cứu vẫn tiếp tục tìm hiểu những nguyên nhân gây ra bệnh ung thư phổi và tìm kiếm những cách thức để phồng chống căn bệnh này. Chúng ta đã biết, cách tốt nhất để phòng chống bệnh ung thư phổi là bỏ hút thuốc lá, càng Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH 9 9 Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 bỏ hút thuốc lá sớm thì càng tốt. Thậm chí, nếu bạn đã hút thuốc lá trong một thời gian dài thì việc bỏ hút thuốc lá cũng vẫn không bao giờ là quá muộn. 1.2. Kháng nguyên Cyfra 21-1 1.2.1. Kháng nguyên 1.2.1.1. Định nghĩa Kháng nguyên được định nghĩa là một chất tương tác với các phân tử kháng thể và thụ thể kháng nguyên trên các tế bào lympho. Một chất gây miễn dịch là một kháng nguyên được cơ thể nhận biết như một chất ngoại lai và kích thích phản ứng miễn dịch thích ứng. Để đơn giản hóa, kháng nguyên và chất gây miễn dịch đều được xem là kháng nguyên.[2,3] 1.2.1.2. Bản chất hóa học của kháng nguyên Về bản chất hóa học, kháng nguyên là những phân tử protein có khối lượng phân tử lớn (kể cả các protein cộng hợp như các glycoprotein, lipoprotein và nucleoprotein) và các polysaccharide (kể cả lipopolysaccharide). Các kháng nguyên protein và polysaccharide này được tìm thấy trên bề mặt của virus, tế bào vi khuẩn, nấm, đơn bào và tế bào người.[3] 1.2.1.3. Nguồn gốc kháng nguyên 1.2.1.3.1. Kháng nguyên ngoại sinh Kháng nguyên ngoại sinh là kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể từ bên ngoài do: hít, ăn, tiêm. Bằng quá trình nhập nội bào hoặc thực bào, các kháng nguyên này được đưa vào tế bào trình diện kháng nguyên (ACP) và được xử lí thành các Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH 10 10 [...]... epitope) của kháng nguyên Các kháng nguyên đơn dòng có thể là: - Kháng thể đơn dòng chuột - Kháng thể đơn dòng khỉ 17 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 18 - Kháng thể đơn dòng gà - Kháng thể đơn dòng người 1.3.3.3 Phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng - Kỹ thuật hybridoma - Tạo mảnh kháng thể đơn dòng bằng kỹ thuật gene - Kỹ thuật phage display (được dùng để tạo kháng thể... 06_01 35 Theo lý thuyết, kháng thể có ái lực cao với kháng nguyên sẽ cho giá trị OD450 cao hơn Trong nghiên cứu này, phức hệ kháng thể-DNA được sử dụng là đơn dòng vì vậy ái lực với kháng nguyên Cyfra 21-1 là như nhau ở các giếng Do đó, giá trị OD sẽ có ý nghĩa xác định bán định lượng nồng độ kháng nguyên Cyfra 21-1 Như vậy, giếng nào trên khay ELISA có nồng độ kháng nguyên Cyfra 211 ban đầu cao hơn... của kháng nguyên hay kháng thể Chính vì vậy, giải pháp được đưa ra là: enzyme sẽ được gắn với kháng nguyên hay kháng thể Kỹ thuật gắn kết enzyme với kháng nguyên hay kháng thể được phát triển bởi Stratis Avrameas và G.B Pierce Tiếp sau đó, vào năm 1966, Wide và Porath phát triển phương pháp gắn kháng nguyên và kháng thể trên bề mặt rắn (bề mặt của các vi phiếm hay các đĩa) nhờ đó mà kháng nguyên hay kháng. .. chúng ta chỉ biết được kháng nguyên Cyfra 21-1 có tồn tại trong các mẫu hay không, và so sánh được mẫu nào có nồng độ kháng nguyên Cyfra 21-1 nhiều hơn Chính vì vậy, để xác định được một cách chính xác nồng độ kháng nguyên Cyfra trong các mẫu, chúng tôi đã sử dụng phương pháp Real-time PCR 35 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 36 3.4 Kết quả Real-time PCR 3.4.1 Đường chuẩn... CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 26 d: lượng phage có trong dịch nuôi m: nồng độ pha loãng phage 2.2.4 Phương pháp xác định nồng độ DNA, kháng nguyên Việc xác định nồng độ DNA, kháng nguyên, kháng thể phage – scFv cho phép tính toán thành phần phản ứng Real-time PCR để có kết quả tốt nhất Nồng độ DNA, kháng nguyên, kháng thể phage – scFv được xác định bằng cách sử dụng máy đo nồng độ Nanodrop ở... dòng kháng thể phage kháng Cyfra 21-1 có ái lực cao Để khẳng định dòng phage chọn được có mang gene mã hóa cho kháng thể kháng Cyfra 21-1, chúng tôi tiến hành xác định trình tự đoạn gene mong muốn Xác định trình tự gene mã hóa kháng thể Dòng phage sau khi sàng lọc được xâm nhiễm vào E.coli chủng TG1 để làm giầu lên rồi tiến hành tách phagemid, tinh sạch và xác định trình tự Trình tự gene mã hóa kháng. .. quả ELISA ELISA là phương pháp được sử dụng để xác định định tính kháng nguyên có trong mẫu Trong nghiên cứu này, kháng nguyên Cyfra 21-1 với 4 nồng độ khác nhau đã được biết trước và một giếng đối chứng H2O được cố định trên khay ELISA 96 giếng, ủ mỗi giếng với phức hệ kháng thể- DNA Các phức hệ kháng thể-DNA sẽ gắn với kháng nguyên đích thông qua kháng thể biểu lộ trên bề mặt phage 34 Viện Đại học... 1.4.2.3 Ưu điểm của Real-time PCR Ưu điểm chính của Real-time PCR so với PCR truyền thống là cho phép xác định số lượng bản sao khuôn mẫu ban đầu với sự chính xác và độ nhậy cao trong một phạm vi biến thiên rộng Kết quả của Real-time PCR có thể là kết quả định tính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự DNA) hay định lượng (số lượng bản sao DNA) Thêm vào đó, dữ liệu của Real-time PCR có thể được đánh giá... các kháng thể bộc lộ trên phage 31 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 32 Các vòng sàng lọc phage được tiến hành để thu nhận được kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên Cyfra 21-1 Sàng lọc được tiến hành hơn 1 vòng để có thể làm giàu dòng phage mong muốn và loại bỏ được các dòng phage gắn không đặc hiệu Sàng lọc kháng thể phage kháng Cyfra 21-1 sử dụng kháng nguyên Cyfra 21-1. .. nhiệt được theo dõi trực tiếp Real-time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: - Quá trình khuếch đại DNA bằng PCR - Đo độ phát quang tỷ lệ thuận với số lượng phân đoạn DNA tạo thành Hệ thống Real-time PCR bao gồm máy chu trình nhiệt (PCR) được nối với máy phát hiện quang phổ huỳnh quang và máy vi tính Nguyên lý chủ yếu của Real-time PCR là dựa trên cơ sở phát hiện và định lượng thể thông báo huỳnh quang . đo, Cyfra2 1-1 là một chỉ thị có độ nhạy tương đối cao đối với ung thư phổi và đang được nghiên cứu. Do đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 bằng kỹ thuật. là quá muộn. 1.2. Kháng nguyên Cyfra 21-1 1.2.1. Kháng nguyên 1.2.1.1. Định nghĩa Kháng nguyên được định nghĩa là một chất tương tác với các phân tử kháng thể và thụ thể kháng nguyên trên các tế. gà - Kháng thể đơn dòng người 1.3.3.3. Phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng - Kỹ thuật hybridoma - Tạo mảnh kháng thể đơn dòng bằng kỹ thuật gene - Kỹ thuật phage display (được dùng để tạo kháng