Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 11 Nụ hoa Tạo thể tiền chồi Nhân nhanh Vườn ươm Cây giống Vườn sản xuất * Các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus: Sau khi đã nuôi cấy thành công cây sạch bệnh thì việc nhân nhanh và duy trì nguồn giống sạch bệnh là vô cùng quan trọng. Chính vì vậy, ở giai đoạn này việc chuẩn đoán bệnh virus tái nhiễm là không việc không thể thiếu, để từ đó phát hiện ra các cá thể nhiễm bệnh và loại ra khỏi nguồn giống. Có một số phương pháp chuẩn đoán bệnh virus như sau: - Phương pháp chuẩn đoán bằng mắt (thông qua triệu chứng bệnh): Đây là phương pháp đơn giản nhất cho phép có thể xác định bệnh virus thông qua biểu hiện của cây trồng. Phương pháp này đòi hỏi phải có kinh nghiệm quan sát và so sánh do có thể nhầm lẫn với một số loại bệnh không phải virus gây ra. Phương pháp này cũng không thể cho phép xác định chính xác loại bệnh virus đang nhiễm. Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 12 - Phương pháp chuẩn đoán bằng cây chỉ thị: Vào những năm 1940, phương pháp này được coi là phương pháp nhạy và chính xác nhất để xác định bệnh virus. Nhờ phương pháp này đã xác định được 2 virus phổ biến là X và A (Leviel 1986). Phương pháp này dựa trên những biểu hiện đặc trưng của cây chỉ thị khi nhiễm bệnh. Người ta đã tìm ra khoảng 200 cây chỉ thị chủ yếu thuộc họ cà (Solanaceae), họ rau dền (Amaranthaceae), họ rau muối (Chenopodaceae), họ đậu (Fabaceae), họ cúc (Asteraceae), trong đó họ cà chiếm ưu thế. Tuy nhiên phương pháp này vẫn bộc lộ một số nhược điểm như: + Thời gian chuẩn đoán kéo dài do phải qua một quá trình ủ bệnh mới xuất hiện triệu chứng. + Việc xuất hiện các triệu chứng đặc trưng còn phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, v.v. + Phương pháp lây nhiễm cho cây chỉ thị khá phức tạp, có loại phải truyền qua côn trùng truyền bệnh (các vecto truyền bệnh) rất phức tạp. + Tốn khá nhiều công để trồng trọt, chăm sóc cây chỉ thị, nuôi dưỡng côn trùng truyền bệnh. Cần có nhà nuôi cấy cách ly. Kinh phí đầu tư lớn. + Việc chuẩn đoán bệnh cuốn lá bằng phương pháp này khó tiến hành. + Phương pháp này chỉ sử dụng khi số lượng cá thể ít. Ví dụ như bệnh hoa lá dưa leo (Cucumic Mosaic Virus) sử dụng cây chỉ thị là cây Chenopodium quinoa. - Phương pháp huyết thanh: Phương pháp này được đánh giá là nhanh và hiệu quả. Có thể cho kết quả sau 48 giờ. Do đó chi phí cho xét nghiệm là ít. Muốn xem phản ứng huyết thanh người ta trộng lẫn huyết thanh đặc hiệu cho mỗi loại virus với dịch cây cần chuẩn đoán bệnh. Kết quả thu được kết tủa ở dạng bông hay dạng mây mờ (phản ứng kháng nguyên + kháng thể). Phương pháp này đã có nhiều cải tiến như làm sạch protein virus trước khi tiêm vào thỏ; tạo ra kháng thể đơn dòng có tính đặc hiệu rất cao đã nâng cao chất lượng của huyết thanh. - Phương pháp chuẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử: Kính hiển vi điện tử có độ phóng đại từ một đến hàng chục vạn lần, có thẻ quan sát được các sợi, thể hạt của virus. Tuy nhiên phương pháp này còn hạn chế do: + Chi phí cho thiết bị khá lớn. + Số lượng mẫu hạn chế, phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu khá phức tạp. + Không phát hiện được virus cầu do chúng khá giống cơ quan tử của tế bào. - Phương pháp chuẩn đoán bằng test ELISA (enzym linked immunosorbent assay): Test ELISA là một tiến bộ trong lĩnh vực chuẩn đoán bệnh virus hại cây trồng. Phương pháp có độ đặc hiệu cao. Chính xác, nhậy, nhanh, dễ tiến hành nên nhanh chóng trở thành phương pháp thông dụng. Test ELISA được Enguall và Permann (1971;1972) đề cập đầu tiên trong lĩnh vực nhân y. Từ năm 1986 nó được sử dụng như một test có độ nhạy rất cao để chuẩn đoán virus ở thực vật (Clark, Adams và Barbara 1976). Với khả năng phát hiện Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 13 nhạy, mọi virus nhất là virus cuốn lá hại khoai tây (nồng độ thấp), phương pháp này là tốt nhất, dễ sử dụng (Casper 1977). Nguyên lý của phương pháp vẫn dựa vào phản ứng kháng nguyên và kháng thể, nhưng kháng thể được liên kết với một enzym (enzym linked). Phức enzym – kháng thể- kháng nguyên sẽ dễ nhận biết do một phản ứng màu nhờ hính sự có mặt của emzym xúc tác. Phản ứng màu thường là sử dụng các phản ứng phân giải 4- nitrophenolphosphat bởi photphataza. Khi tách phosphat, α-nitrophenol sẽ có màu vàng. Mỗi enzym có thể xúc tác cho hàng ngàn phân tử cơ chất nên tín hiệu màu được khuếch đại rất rõ. Phản ứng test được tiến hành khi gắn trên các mặt bản thử plastic, nên có tên gọi là immunosorbent. Như vậy, trên bản thử lỗ nào có màu vàng, nơi ấy có mặt phức kháng nguyên – kháng thể - enzym, tức là có virus. Cho đến nay có thể nói test ELISA là công cụ chính trong việc chuẩn đoán bệnh virus. Bằng phương pháp ELISA có thể chuẩn đoán chính xác cả mặt định tính và định lượng. - Chuẩn đoán bằng kỹ thuật phân tích ADN: Phương pháp này cho kết quả nhanh và chính xác. Phương pháp thông dụng gọi là phương pháp PCR. Nguyên lý chung của phương pháp là xác định trực tiếp sự có mặt của phần lõi axit nucleic của virus. Phần lõi này có trình tự rất đặc hiệu tùy theo mỗi loại virus. Từ đó mà có thể là phát hiện trực tiếp qua bảng phản ứng PCR. Sử dụng các cặp mồi là các đoạn nucleotid (dài từ 10-30 nu) có trình tự bổ sung với hai đầu (phía 3’) của hai sợi đoạn ADN cần nhân. Sau thời gian cho phản ứng trên máy PCR khoảng 3 giờ có thể lấy mẫu và đánh giá kết quả. Nếu mẫu sạch virus tức là không có khuôn ADN của virus thì cặp mồi không bắt cặp, quá trình nhân ADN không xảy ra. Còn ở mẫu bệnh, sự nhân ADN diễn ra mạnh mẽ (sau 30 chu kỳ có thể nhân hàng trăn triệu đoạn ADN). Có thể nhận biết ADN qua phương pháp điện di. Từ đây cso thể kết luận mẫu có nhiễm bệnh hay không. Tuy nhiên, một số virus có cấu tạo phần axit nucleic là ARN, trong trường hợp này cần phải chuyển ARN virus sang dạng ADN (cADN) sau đó phát hiện ADN này bằng phương pháp PCR. Phương pháp này được coi là vũ khí vô cùng lợi hại của con người. Phương pháp này có thể phát hiện virus ở nồng độ rất thấp với độ chính xác rất cao. Chính vì vậy, phương pháp này đã được ứng dụng rất nhiều trong công nghệ sản xuất các giống sạch bệnh virrus hiện nay. Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 14 Chuyên đề 5: Trình bày kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro và ứng dụng của chúng trong công tác giống cây trồng? o 0 o * Khái niệm về cây đơn bội: Các cây trồng khác nhau thường có mức bội thể khác nhau. Có thể là đơn bội (n), lưỡng bội (2n), tứ bội (4n), v.v. Tuy nhiên phổ biến trong tự nhiên là lưỡng bội (2n) và tứ bội (4n). Như vậy, với các loại cây trồng này kiểu hình thể hiện ra ngoài là sự tác động tổng hợp của nhiều kiểu gen, phụ thuộc và tính trạng là lặn hay trội. Trong công tác chọn giống người chú ý nhiều tới thể đơn bội (n), bởi lẽ cây trồng ở dạng đơn bội thường rất khó tồn tại trong tự nhiên. Nó chỉ sống được trong điều kiện nhân tạo của con người. Cây đơn bội mang bộ NST (n), vì vậy để cho nó sống được người ta phải tiến hành đồng hợp tử tuyệt đối, tức là tạo ra alen hoàn toàn giống nhau. Những biểu hiện của cây đơn bội (kiểu hình) thể hiện chính xác kiểu gen mà nó đang có, kể cả các gen lặn. Đây sẽ là nguồn vật liệu di truyền vô cùng quý giá trong công tác chọn giống. * Các đường hướng tạo cây đơn bội: Cơ thể thực vật trong tự nhiên chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế bào đơn bội. Nếu như chúng phát triển thành cây thì cây đó có mức bội thể đơn bội (n). Tuy nhiên trong tự nhiên rất hiếm gặp các cây đơn bội, vì vậy các nhà khoa học đã tiến hành nghien cứu bằng các con đường khác nhau nhằm tạo ra cây đơn bội làm nguồn vật liệu cho công tác chọn giống. Vào năm 1924, Blakeslee và cộng sự đã chứng minh được rằng có thể thu được các dòng nhị bội thuần đồng hợp bằng cách nhị bội hóa các thể đơn bội. Đến năm 1964, hai ông Guka & Maheshwari (Ấn Độ) đã lần đầu tiên tạo thành công cây đơn bội bằng nuôi cây bao phấn cà độc dược. Tiếp sau đó với các đóng góp của Nitsch và Noieel (1973-1976) đã càng khẳng định việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy là hoàn toàn có thể thành công. Cho đến nay, đã có khoảng 170 loài cây trồng được tạo ra bằng con đường đơn bội. Việc tạo cây đơn bội có thể có nhiều hướng khác nhau: - Tạo cây đơn bội (dòng thuần) bằng con đường tự phối. Đây là một hướng có thể coi là thủ công và rất mất thời gian. Thường phải mất đến 5-7 thế hệ mới tạo được dạng đồng hợp tử. Đây cũng là một phương pháp khó thực hiện và tốn kém. - Tạo cây đơn bội bằng in vitro. Đây là phương pháp chiếm ưu thế bởi sự tiện dụng và nhanh chóng của phương pháp này. Chỉ mất 1 thế hệ để tạo ra cây đơn bội. Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua việc kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây khi nuôi cấy bao phấn, hạt phấn và gần đây, người ta còn nuôi cây kích thích các tế bào trứng (noãn chưa thụ tinh) phát triển thành cây đơn bội. Đặc biệt với cây ngô đã nhanh chóng tạo hàng loạt cây đơn bội ứng dụng trong công tác giống cây trồng. Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 15 * Khả năng ứng dụng trong nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống cây trồng: Cây đơn bội có thể ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau: - Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen. - Tạo đột biến ở mức đơn bội. - Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ công tác giống cây trồng. Sơ đồ các hướng ứng dụng cây đơn bội: Dòng thuần ổn định (F 1 , F 2 ) Chọn giống ưu thế lai dòng đồng hợp tử tuyệt đối Nhị bội hóa số lượng NST (Tự phát, xử lý, colchicine) Cá thể đơn bội Lai với các thể đơn bội khác bằng dung hợp tế bào trần Nuôi cây tế bào trần (lai Soma) của các thể đơn bội Gây đột biến, chọn lọc in vitro Tái sinh cây Nguyên liệu khởi đầu cho chọn giống * Kỹ thuật tạo cây đơn bội: - Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn: + Nguyên lý: Nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích các hạt phấn này phát triển thành cây đơn bội. Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 16 Sự phát sinh cây đơn bội từ hạt phấn được gọi là sự sinh sản đơn tính đực (androgensis). Khi nuôi cấy hạt phấn đơn nhân in vitro có thể có 3 phương thức sinh sản đơn tính đực như sau:  Sinh sản đơn tính đực trực tiếp như ở thuốc lá, cà độc dược. Khi đó hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tạo phôi 1n, phôi này sẽ phát triển thành cơ thể 1n (cây 1n).  Sinh sản đơn tính đực gián tiếp như ở lúa, ngô. Khi đó hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tạo mô sẹo 1n, nhân nhanh thành chồi 1n, phát triển thành cây 1n.  Sinh sản đơn tính đực hỗn hợp: Qua trình này diễn ra tương tự như sinh sản đơn tính đực gián tiếp, nhưng sự thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết như ở cây cà chua. + Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn: Bước 1: Chọn bao phấn. Giai đoạn phát triển của hạt phấn có vai trò quyết định trong việc tạo cây đơn bội, tốt nhất là hạt phấn ở giai đoạn sắp phân bào giảm nhiễm lần một. Bao phấn của những hoa đầu tiên của cây cho kết quả cao hơn hoa muộn. Bước 2: Xử lý nụ hoa. Xử lý nhiệt độ thấp cho nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn để cấy sẽ kích thích sự phân chia của tiểu bào tử để tạo cây đơn bội. Chế độ xử lý lạnh phụ thuộc vào loại cây. Ví dụ: lúa Japonica xử lý ở 10 0 C trong 2-3 tuần; lúa Indica xử lý ở 7 0 C trong 1 tuần; thuốc lá xử ý ở 2-3 ngày. Bước 3: Chọn môi trường thích hợp. Môi trường nuôi cấy thích hợp là điều vô cùng quan trọng. Với mỗi loại cây trồng khác nhau thì lại có môi trường thích hợp khác nhau. Chẳng hạn, với họ hòa thảo cần nhiều auxin, đặc biệt 2,4 D ở nồng độ cao để khởi động sự phân chia đầu tiên (lúc mì 10 -5 mol 2,4 D trong 12 ngày); Cây họ cà cần ít hơn, khoảng 10 -6 mol. Về hàm lượng đường cũng khác nhau, ở ngô là 60- 120g saccarose/l, lúa 50-60 g saccarose/l, cây họ cà 20-40g saccarose/l, v.v. Ngoài ra một số hỗn hợp tự nhiên như dịch chiết khoai tây, nước dừa tỏ ra có tác dụng tốt trong nuôi cấy bao phấn. Còn các nguyên tố đa lượng và vi lượng ít ảnh hưởng trong nuôi cấy bao phấn. Bước 4: Chọn lọc cây đơn bội. Không phải tất cả các cây tái sinh khi nuôi cấy bao phấn đều là cây đơn bội, vì vậy để xác định cây đơn bội có thể sử dụng một số phương pháp như đếm số lượng NST, đo gián tiếp hàm lượng ADN của tế bào, trồng cây tái sinh và so sánh với cây mẹ về hình thái, kích thước, khả năng sinh trưởng. + Kỹ thuật nuôi cây cấy hạt phấn: Các bước nuôi cấy hạt phấn tương tự như nuôi cấy bao phấn, tuy nhiên hạt phấn được rời khỏi bao phấn trước khi nuôi. Các hạt phấn này thước được nuôi cấy trong môi trường lỏng kèm theo chế độ lắc hay nuôi cấy trong môi trường bán lỏng. Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 17 Sơ đồ tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn: Cây đơn bội Phôi hóa Tạo callus Cây đơn bội Nuôi cây bao phấn môi trường dinh dưỡng đặc hiệu - Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh: Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh gọi là sự sinh sản đơn tính cái hay trinh nữ sinh (gynogensis). Đã có nhiều thành công trong việc nuôi cây bao phấn và hạt phấn để tạo cây đơn bội. Tuy nhiên, khi đi sâu vào nghiên cứu và thực hiện người ta thấy rằng, nuôi cấy bằng bao phấn và hạt phấn đã bộc lộ nhiều nhược điểm như tỷ lệ bạch tạng là rất cao. Đặc biệt với các loại cây như hành, củ cải đường, hướng dương, v.v. đã không cho kết quả như mong muốn. Trên cơ sở đó, vòa những năm 70 các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu giải quyết cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh và đã thu được nhiều thành tựu. Tỷ lệ tạo cây đơn bội bằng trinh nữ sinh biến động ở các loại cây khác nhau. Đối với hành, củ cải đường tỷ lệ này là 5-20%; ở lúa là 1,5-12%; ở dâu tằm là 3-6%, … Tuy nhiên kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn nhiều khó khăn và phức tạp do việc tách tế bào trứng rất khó và dễ gây thương tổn. Nhằm tăng hiệu quả của quá trình này, người ta tập trung nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen cây mẹ, giai đoạn phát triển của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi cấy, … Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 18 Trong các cây ngũ cốc, ở cây ngô việc nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tương đối đơn giản và thu được nhiều thành công hơn cả. Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 19 Chuyên đề 6. Kỹ thuật tách, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần (protoplast) o 0 a. Khái niệm tế bào trần Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào chỉ còn phần nguyên sinh chất, nhân, các cơ quan tử khác và màng sinh chất là ranh giới phân biệt bên trong và bên ngoài tế bào trần. b. Phương pháp tách tế bào trần * Nguyên tắc: - Sử dụng hỗn hợp enzym cellulolaza và hemicellulolaza, pectinaza để phân giải thành tế bào và giải phóng các tế bào trần. - Một nguyên tắc cơ bản là sau khi thành tế bào được tách ra, tế bào trần phải được phóng thích vào môi trường có áp suất thẩm thấu cao để tránh nước xâm nhập vào không bào, gây vỡ tế bào chất bằng việc bổ sung các chất gây áp suất thẩm thấu như saccarose, manitol, sorbitol, Ca 2+ … - Nồng độ chất áp suất thẩm thấu và thời gian lưu giữ tối đa thay đổi cho phù hợp với từng loại cây trồng. Đây là phương pháp dùng phổ biến và có hiệu quả cao: Có thể thu được từ 1g lá tươi có thể thu được 6÷12 triệu tế bào trần. * Các bước tiến hành - Chọn nguyên liệu: ex ivtro: mô lá non (cần phải khử trùng), in vitro: lá, mô sẹo, tế bào huyền phù. - Xử lý gây co nguyên sinh chất (CaCl 2 , đường monitol …0,5÷0,7M) - Xử lý hỗn hợp enzym cellulolaza và hemicellulolaza, pectinaza - Tách và làm sạch protoplast: lọc, ly tâm. - Kiểm tra khả năng sống (fluorescein diacetate) và tạo huyền phù protoplast có mật độ phù hợp (10 4 ÷10 7 /ml) Ví dụ về kỹ thuật tách tế bào trần + Ở cây thuốc lá Nguyên liệu thực vật: lá thứ 3 từ trên xuống. Hỗn hợp enzym: cellulolaza 1% macerozyme 0,02% driselaza0,05% Thời gian ủ: 16h (ngâm qua đêm) + Ở cây ngô Nguyên liệu thực vật: tế bào hạt phấn. Hỗn hợp enzym: cellulolaza 2% macerozyme 0,1% pectolyaza 0,05% Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 20 Thời gian ủ: 4÷12h (ngâm qua đêm) Các tế bào trần sau khi tách thành tế bào được lọc qua rây có kích thước 50÷80µm, rồi rửa bằng dung dịchkhông có enzym bằng ly tâm. c. Quá trình tái sinh của tế bào trần và các yếu tố ảnh hưởng * Quá trình tái sinh: - Nuôi cấy protoplast: thường chia 2 giai đoạn . nghệ sản xuất các giống sạch bệnh virrus hiện nay. Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 14 Chuyên đề 5: Trình bày kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro và ứng dụng. 6÷ 12 triệu tế bào trần. * Các bước tiến hành - Chọn nguyên liệu: ex ivtro: mô lá non (cần phải khử trùng), in vitro: lá, mô sẹo, tế bào huyền phù. - Xử lý gây co nguyên sinh chất (CaCl 2 ,. từ hạt phấn được gọi là sự sinh sản đơn tính đực (androgensis). Khi nuôi cấy hạt phấn đơn nhân in vitro có thể có 3 phương thức sinh sản đơn tính đực như sau:  Sinh sản đơn tính đực trực tiếp