CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH THƯỜNG DÙNG – PHẦN Ngày nay, kỹ thuật miễn dịch dùng lâm sàng phong phú đa dạng, mà nhà lâm sàng rõ ràng nên có số kiến thức định kỹ thuật này, tối thiểu phải nắm độ xác độ tin cậy kỹ thuật mà yêu cầu Mục đích chúng tơi chương trình nhằm giới thiệu nguyên lý kỹ thuật miễn dịch lâm sàng dùng phổ biến sở chẩn đoán điều trị giới; đồng thời nêu lên số nhận định chúng tơi khó khăn phân tích kết đạt Các thử nghiệm la-bơ phân cấp độ tùy theo giá trị chúng trường hợp bệnh nhân cụ thể Một số thử nghiệm xếp vào loại cần thiết (essential) cho chẩn đoán theo dõi, số thuộc loại tùy chọn (optional) có ích số cịn lại loại để nghiên cứu Một số xét nghiệm trở nên vơ ích u cầu không lúc, chỗ Các phân chia chúng tơi giúp nhà lâm sàng có định thích hợp cho thử nghiệm Trong chương này, không mô tả chi tiết phương pháp tiến hành kỹ thuật nội dung sách chuyên đề kỹ thuật miễn dịch mà dự kiến cho xuất mai Có ba nhóm kỹ thuật xây dựng để đánh giá lực miễn dịch phận riêng lẻ đáp ứng miễn dịch Các yếu tố dịch thể immunoglobulin, kháng thể, thành phần bổ thể protein đặc hiệu khác định lượng xác Giới hạn bình thường cho yếu tố trình bày kết phân tích theo lâm sàng cách dễ hiểu Ngược lại, thử nghiệm thành phần tế bào khó thực khó phân tích Chưa có kỹ thuật gọi chuẩn phương pháp đánh giá tế bào, mà la-bơ người ta thường làm cách khác Để cho việc phân tích kết tốt, cần phải có liên hệ chặt chẽ nhà miễn dịch nhà lâm sàng Các thử nghiệm in vivo nhằm đánh giá yếu tố dịch thể lẫn tế bào có giá trị khảo sát thiếu hụt miễn dịch mẫn khó chuẩn hóa 12.1 Định lượng immunoglobulin protein đặc hiệu khác Định lượng immunoglobulin (Ig) tỏ cần thiết bệnh nhân nhiễm trùng nặng lặp lặp lại nhiều lần bệnh nhân rối loạn tăng sinh lympho Việc định lượng nhiều lần giúp phân biệt thiếu hụt miễn dịch thoáng qua thường xuyên giúp theo dõi điều trị bệnh tăng sinh lymphô Việc định lượng tỏ có ích bệnh cảnh có giảm gammaglobulin máu nhiễm trùng HIV, bệnh gan SLE Hình 12.1 Sơ đồ minh họa điểm cân đối tỉ lệ kháng nguyên – kháng thể để tạo tủa Khi thừa kháng nguyên kháng thể liên kết chéo xảy nên tủa khơng có Kỹ thuật thường dùng phổ biến miễn dịch kết tủa (immunoprecipitation) Tủa miễn dịch hình thành kháng nguyên kháng thể kết tủa tương ứng diện với nồng độ tương ứng tối ưu (cân bằng) (Hình 12.1) Miễn dịch khuyếch tán đơn (single radial imminodifusion, RID) kỹ thuật Mancini sử dụng mô tả Kỹ thuật sử dụng kháng huyết hòa tan vào thạch đun lỏng, hỗn hợp thạchkháng huyết đổ rải lên phiến kính đặt mặt phẳng ngang Sau thạch đơng, người ta đục lỗ trịn thạch cho huyết cần đo huyết chứng vào Kháng nguyên, mà trường hợp immunoglobulin, khuyếch tán theo hướng ly tâm từ lỗ vùng thạch có chứa kháng huyết chung quanh Bởi nồng độ kháng thể (kháng huyết thạch) cố định nên kháng nguyên lỗ khuyếch tán nồng độ giảm dần có tỷ lệ thích hợp với nồng độ kháng thể thạch vịng tủa hình thành Đối với mẻ người ta làm ba lỗ chứa kháng nguyên với nồng độ biết trước để vẽ thành đường chuẩn (Hình 12.2) Hình 12.2 Đường chuẩn dùng định lượng protein đặc hiệu khuyếch tán đơn, kỹ thuật Mancini Lỗ 1-3 chứa nồng độ, chuẩn biết loại protein muốn đo Trên trục tọa độ đường chuẩn vẽ QC = quality control, kiểm tra chất lượng Điều khơng thuận lợi phương pháp vịng tủa phải 48 ổn định Phương pháp tương đối nhạy (giới hạn mg/lít) đáng tin cậy (hệ số biến động kỹ thuật viên thành thạo 3-10% với điều kiện kháng huyết tốt) Người ta xây dựng phương pháp cải tiến khác để đọc kết nhanh vòng giờ, phương pháp xác Ở nồng độ thấp, phức hợp miễn dịch tồn dạng hạt nhỏ nhũ dịch làm tán sắc ánh sáng Sự tán sắc đo với máy gọi máy đo độ đục (nephelometer), phức hợp miễn dịch để tự nhiên đo; dùng máy đo khác gọi máy phân tích ly tâm (centrifugal analyzer), lực ly tâm làm cho phức hợp miễn dịch hình thành nhanh Cả hai phương pháp địi hỏi khơng có chất bẩn gây tán sắc nhũ bọt khí hạt nhũ tương lỏng Khi nồng độ kháng thể cố định, độ cản tia tỉ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên Đây phương pháp thực nhanh dễ tự động hóa; ta có kết xác sau lấy máu 1-2 Bảng 12.1 Một số protein định lượng khuyếch tán đơn 1 Protein huyết (a) Protein tham gia đáp ứng miễn dịch: Immunoglobulin: IgG, IgA, IgM, tiểu lớp IgG, (IgD) Thành phần bổ thể: C1q, C3, C4, yếu tố B, (C2, C5, C6,C7, C8, C9) Chất ức chế bổ thể: C1INH (H,I) b2 microglobulin a (b) Một số protein pha cấp: a1 antitrypsin a2 macroglobulin Protein phản ứng C Orosomucoid (c) Protein vận chuyển: Transferin Haptoglobin (d) Protein đông máu: Ceruloplasmin Fibrinogen Sản phẩm thối hóa fibrinogen (FDP)# (e) “Dấu hiệu điểm u’’ Kháng nguyên ung thư CEA Phosphatase kiềm thai HCG Lysozyme a-FP Nước tiểu Chuỗi nhẹ tự – týp kappa lambda Dịch não tuỷ (CSF) IgG Albumin Cả miễn dịch khuyếch tán đơn đo độ đục dùng để định lượng nhiều loại protein huyết thanh, nước ối, dịch não tủy, nước bọt dịch tiêu hóa (Bảng 12.1) Các huyết chuẩn dùng để vẽ đường chuẩn thang chuẩn phải theo quy định Tổ chức Y tế Thế giới Hiện giới có đủ huyết chuẩn cho phép đo protein huyết thường quy, với điều kiện lượng protein phải lớn 5mg/lít dịch đo Mỗi phịng thí nghiệm bệnh viện phải tự xác định giới hạn bình thường cho protein giới hạn thay đổi tùy theo phương pháp, kháng huyết thanh, huyết chuẩn dùng tùy theo nhóm dân tộc mà ta khảo sát Giới hạn bình thường đa số protein thay đổi tùy theo tuổi, trẻ em Chúng ta đo nồng độ IgG albumin dịch não tủy; albumin khơng tổng hợp não nên tỉ lệ IgG/albumin số gián tiếp nói lên mức độ IgG dịch não tủy tế bào lympho tổng hợp não Ngày thử nghiệm cần thiết để khảo sát nhiễm trùng tình trạng myelin hệ thần kinh trung ương Kỹ thuật khuyếch tán miễn dịch điện di (electroimmunodifusion), mà người ta thường gọi điện di “hỏa tiễn”, có độ xác độ nhạy cao khuyếch tán đơn, giới hạn kỹ thuật 1mg/lít Protein khảo sát cho chạy điện trường vào gel chứa kháng thể tương ứng (Hình 12.3) Giả sử đạt đến điểm ổn định cuối cùng, thấy có tương quan tuyến tính chiều cao cột tủa với nồng độ kháng nguyên Trong thời gian cho chạy điện di không ngắn so với khuyếch tán đơn tự nhiên, phương pháp khơng thích hợp cho việc định lượng Ig protein tích điện nên di chuyển chậm điện di Có nhiều kháng thể đơn clơn khơng cho tủa với kháng nguyên tương ứng, điều giải thích có q epitope cho phản ứng với kháng huyết Tuy nhiên, có hỗn hợp kháng thể đơn clơn tạo tủa miễn dịch; tiểu lớp Ig đo theo cách này, ví dụ trường hợp định lượng IgG2 để chẩn đốn thiếu hụt IgG2 Hình 12.3 Sơ đồ minh họa hình ảnh điện di miễn dịch hỏa tiễn Độ cao cung tủa tỉ lệ thuận với nồng độ kháng ngun Tủa nhìn thấy rõ sau nhuộm Các nồng độ chuẩn dùng để vẽ đường chuẩn, từ tính nồng độ chưa biết dựa vào chiều cao x đo 12.2 Khảo sát định tính immunoglobulin 12.2.1 Huyết Tất mẫu huyết người lớn đề nghị định lượng Ig nên sàng lọc trước điện di protein huyết để tìm diện paraprotein (các dải đơn clôn) Nền đỡ thường dùng màng cellulose acetate Tấm màng ướt cho vào hộp điện di dung giấy thấm giúp cho việc cung cấp liên tục dung dịch đệm Các mẫu huyết cho lên màng phía cực âm dòng điện cho qua màng 45 phút Sau lấy màng ra, dải protein thấy cho nhuộm với thuốc nhuộm thích hợp (Hình 12.4) Chúng ta ln nhớ phải cho chạy mẫu huyết bình thường song song với huyết thử để dễ so sánh Những dải đơn clơn (dải M) lạ xuất vị trí màng điện di cần tách chúng để khảo sát sâu Trên màng điện di xuất “dải giả” (false band), sản phẩm hemoglobin (thấy rõ mẫu nghiệm có màu hồng) fibrinogen (khi mẫu huyết tương huyết máu để đông không hồn tồn) Do có nhược điểm IgG bị tủa mẫu đơng lạnh đọng lại gần vị trí lỗ chứa mẫu Do đó, điều quan trọng làm xét nghiệm cần phải gửi mẫu nghiệm sớm máu phải đông hồn tồn Hình 12.4 Ngun lý điện di protein huyết Các dải M định lượng dụng cụ gọi mật độ kế (densitometer); dụng cụ đọc độ đậm đặc thuốc nhuộm bắt màu vào dải cho ta biểu đồ tương ứng với dải điện di (Hình 12.5) Tỉ lệ loại protein riêng tính thành phần trăm so với tổng lượng protein có mẫu nghiệm; tỉ lệ bách phân chuyển số lượng tuyệt đối (g/lít) cách tính đơn giản ta biết nồng độ protein toàn thể huyết Đo mật độ phương pháp quan trọng để định lượng protein dải đơn clôn, khảo sát mẫu kép có lẩn nhiều immunoglobulin đa clơn Hình 12.5 Phân tích điện di protein mật độ kế để định lượng dải M (A= albumin) ... tiến hành kỹ thuật nội dung sách chuyên đề kỹ thuật miễn dịch mà dự kiến cho xuất mai Có ba nhóm kỹ thuật xây dựng để đánh giá lực miễn dịch phận riêng lẻ đáp ứng miễn dịch Các yếu tố dịch thể... kháng nguyên – kháng thể để tạo tủa Khi thừa kháng ngun kháng thể liên kết chéo xảy nên tủa khơng có Kỹ thuật thường dùng phổ biến miễn dịch kết tủa (immunoprecipitation) Tủa miễn dịch hình thành... với nồng độ tương ứng tối ưu (cân bằng) (Hình 12 .1) Miễn dịch khuyếch tán đơn (single radial imminodifusion, RID) kỹ thuật Mancini sử dụng mô tả Kỹ thuật sử dụng kháng huyết hòa tan vào thạch đun