ĐẶT VẤN ĐỀ H. influenzae là thành viên của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp trên. Trong đó, H. influenzae typ b (Hib) có ở 1-5% trẻ em khoẻ mạnh và không có biểu hiện bệnh [16]. Tỷ lệ mang vi khuẩn thấp nhất ở người lớn và trẻ nhỏ, cao nhất ở lứa tuổi mẫu giáo [36], [54], [58]. Tuy vậy, trong một số điều kiện nhất định như ở các hộ, các trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày thì tỷ lệ trẻ mang vi khuẩn có thể cao hơn một cách đáng kể. Mặc dù nhiều nghiên cứu đã cho thấy tỷ lệ mang vi khuẩn Hib của trẻ nhỏ là dưới 5%. Tuy nhiên, tỷ lệ mang vi khuẩn Hib tại các trung tâm như vậy được báo cáo là 15-25% [26], [36], [54]. Đường lây truyền của H. influenzae từ người này sang người khác thường thông qua các hạt dịch bắn ra từ đường hô hấp hoặc bởi sự tiếp xúc với chất tiết của miệng. Những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất lan truyền và khả năng vi khuẩn thiết lập sự xâm chiếm còn chưa được hiểu rõ [36]. Hiện nay H. influenzae cũng được biết đến là căn nguyên chính gây viêm màng não mủ và viêm phổi cho trẻ nhỏ. Tuy nhiên, tại các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng ở trong nước H. influenzae vẫn được xếp vào loài vi khuẩn khó nuôi cấy bởi luôn đòi hỏi môi trường phải có cả hai yếu tố phát triển (growth factors) là X và V. Vì vậy, phần lớn chỉ những phòng xét nghiệm vi sinh tuyến tỉnh và Trung Ương mới có điều kiện để nuôi cấy chẩn đoán vi khuẩn này. Thêm vào đó, việc xác định typ huyết thanh và typ sinh học hầu như tại các bệnh viện đều ít thực hiện, phần lớn chỉ sử dụng trong nghiên cứu, bởi vậy để xác định được những đặc điểm này đòi hỏi phòng xét nghiệm phải đầu tư thời gian và sinh phẩm đặc thù [3], [16]. Cho nên, chẩn đoán xác định H. influenzae thường không được thực hiện một cách hoàn chỉnh. 1 1 Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi thực hiện chuyên đề: "Haemophilus influenzae typ b: Đặc điểm sinh học và tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn" nhằm đưa ra những thông tin cơ bản nhất về vi khuẩn này để góp phần cho công tác chẩn đoán và phòng bệnh do Haemophilus influenzae typ b trên lâm sàng. Chuyên đề thực hiện với 2 mục tiêu: 1. Tìm hiểu lịch sử phát hiện và đặc điểm sinh học đặc trưng của Haemophilus influenzae typ b 2. Đánh giá tỷ lệ trẻ khỏe mạnh có mang Haemophilus influenzae typ b và các yếu tố ảnh hưởng. 2 2 Chương I ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA HAEMOPHILUS INFLUENZAE TYP B 1.1. Haemophilus influenzae: lịch sử và tên gọi H. influenzae được phân lập lần đầu bởi Richard Pfeiffer từ đờm của một bệnh nhân bị viêm phổi - cúm trong đại dịch cúm năm 1890. Lúc đó, vi khuẩn này được hiểu lầm là nguyên nhân gây ra bệnh cúm nên được gọi là trực khuẩn cúm (Influenzae bacteria). Mãi cho đến khi đại dịch cúm xảy ra trong những năm 1918-1919, người ta mới biết H. influenzae chỉ là thành viên của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp trên và không phải lúc nào cũng gây bệnh. Đến năm 1933, khi phát hiện ra virus cúm là căn nguyên của bệnh cúm, vai trò của H. influenzae mới được làm sáng tỏ: virus cúm gây ra bệnh cúm, còn Haemophilus influenzae chỉ là vi khuẩn “ăn theo” (second invader) sau khi các tế bào đường hô hấp đã bị tổn thương nặng nề bởi virus cúm [3], [16], [17]. Vì vậy, vi khuẩn này có tên là H. influenzae được xuất phát từ nhu cầu đòi hỏi môi trường giàu chất dinh dưỡng, đó là các yếu tố phát triển có ở máu (Haemophilus: ưa máu), đặc biệt là yếu tố X (hemin) và yếu tố V (NAD hoặc NADP). Thêm vào đó, vi khuẩn này lại có mối liên quan lịch sử với bệnh cúm (Influenzae: bệnh cúm). Cho nên, vi khuẩn được gọi tên là như vậy [3], [16]. 1.2. Đặc điểm sinh học đặc trưng của Haemophilus influenzae typ b 1.2.1. Hình thái và cấu trúc [3], [16]. H. influenzae là một trong những loài vi khuẩn nhỏ nhất, còn được gọi là cầu trực khuẩn vì vi khuẩn này có dạng trực khuẩn ngắn (1,0–1,5µm) nhưng uốn cong ở hai đầu trông như hình cầu. Tuy nhiên, khi vi khuẩn này ở dịch não tuỷ hình thể có thể kéo dài ra gấp vài lần so với chiều dài thông thường (Hình 1.1). H. influenzae có đặc tính bắt màu Gram âm, không di động và không hình thành nha bào. Thành tế bào vi khuẩn này có cấu trúc bề 3 3 mặt lipopolysaccharide–protein tương tự như thành của các vi khuẩn Gram âm khác. Ngoài ra, H. influenzae được phân loại thành 2 nhóm: loại không vỏ polysaccharide (non-typeable không xác định được typ huyết thanh) và loại có vỏ (typeable xác định được typ huyết thanh). Loài H. influenzae (Hi) có vỏ bọc được phân loại tiếp tục theo các typ huyết thanh từ a đến f tuỳ thuộc vào đặc tính kháng nguyên của vỏ polysaccharide do gen qui định [3][16][17]. Vỏ bọc typ b là một dạng trùng hợp của ribose, ribitol và phosphate, được gọi là polyribosyl - ribitol - phosphate (PRP). Polysaccharide bề mặt này liên quan mạnh mẽ đến tính gây độc của vi khuẩn, đặc biệt là H. influenzae typ b (Hib), là nguyên nhân của nhiều trường hợp nhiễm trùng hệ thống nghiêm trọng bao gồm cả viêm màng não mủ (trên 90% các ca nhiễm khuẩn lan tràn do Hib). Hình 1.1 Hình thể của H. influenzae typ b trên tiêu bản nhuộm gram dịch não tuỷ dưới kính hiển vi quang học. Trên thực tế lâm sàng, nếu nhuộm gram bệnh phẩm dịch não tủy từ bệnh nhân mà trên vi trường cho thấy nhiều vi khuẩn gram (-) nhỏ, đa hình thái thì đây là dấu hiệu rất quan trọng gợi ý cho chẩn đoán sớm viêm màng não mủ do H. influenzae typ b [16]. 4 4 1.2.2. Sức đề kháng H. influenzae typ b là loại vi khuẩn chịu đựng rất kém với các yếu tố ngoại cảnh. Trong bệnh phẩm, chúng chết nhanh chóng nếu để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, để khô hoặc lạnh giá. Các chất sát khuẩn thông thường tiêu diệt vi khuẩn này một cách dễ dàng [61]. Vì vậy, bệnh phẩm để chẩn đoán vi sinh nên được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 2h, hoặc không quá 6h ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (24 - 28 o C). Nếu là tăm bông phải giữ trong môi trường vận chuyển (bảo quản), có thể giữ ở nhiệt độ 4 - 8 o C tối đa 24h trong môi trường vận chuyển [61]. 1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy [3] 1.2.3.1. Điều kiện nuôi cấy H. influenzae là loại vi khuẩn khó nuôi cấy. Chúng không mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường, chỉ mọc khi trong môi trường đã có sẵn cả hai yếu tố X và V. Yếu tố X có lẽ không phải là một chất thuần tuý mà là hỗn hợp của các chất màu có chứa sắt (như hemin và hematin), khi không có hai yếu tố này trong môi trường nuôi cấy thì chúng không phát triển được. H. influenzae dùng yếu tố X để tổng hợp một số enzym như catalase, peroxidase và các cytochrom của hệ thống vận chuyển điện tử. Máu và các sản phẩm của máu, kể cả hemin là nguồn nguyên liệu truyền thống được sử dụng để sản xuất yếu tố X. Thạch máu (5%) có khả năng cung cấp đủ lượng yếu tố X mà H. influenzae cần thiết phát triển. Khi dùng hematin tinh chế thì nồng độ cần thiết là 0,1 – 1,0 µg/ml. Yếu tố V là NAD hoặc NADP mặc dù có mặt trong máu, nhưng một phần do chúng nằm bên trong tế bào. Mặt khác, trong máu của nhiều loài động vật có NADase, nên trong máu tươi không có NAD ở dạng tự do. Trong thạch chocolate, NAD được giải phóng ra khỏi tế 5 5 Hình 1.2. Hiện tượng khuẩn lạc "vệ tinh" của Haemophilus influenzae xung quanh các khuẩn lạc Staphylococcus aureus bào và NADase bị phá huỷ. Khi dùng NAD tinh chế, nồng độ cần thiết là 0,2 - 1,0 µg/ml. H. influenzae hiếu khí, đòi hỏi CO 2 (2-5%) khi mới phân lập. Mọc tốt trên môi trường chocolate và Levinthal ở nhiệt độ khoảng 23-39 0 C, tối ưu là 37 0 C. Không mọc được trên thạch máu cừu; nếu mọc trên các loại thạch máu khác (ví dụ máu thỏ) thì không gây tan máu và khuẩn lạc nhỏ hơn nhiều so với trên chocolate trong cùng các điều kiện nuôi cấy khác. Cũng trên thạch máu, người ta thấy các khuẩn lạc H. influenzae mọc xung quanh các khuẩn lạc Staphylococcus aureus bội nhiễm thì rất to, trong khi đó ở những vùng xa thì hoặc là không mọc, hoặc là rất bé. Hiện tượng này gọi là hiện tượng “vệ tinh” (satellitism), do khả năng tiết ra yếu tố V của vi khuẩn bội nhiễm đã giúp H. influenzae phát triển được thạch máu thông thường. 1.2.3.2. Các môi trường nuôi cấy và đặc điểm khuẩn lạc Để nuôi cấy H. influenzae, có 3 loại môi trường có thể được được sử dụng [3], [16], [17], [61]: + Thạch chocolate có hoặc không có 300µg Bacitracin/ml môi trường (có tác dụng ức chế các vi khuẩn khác, đặc biệt là liên cầu) để tìm H. 6 6 influenzae. Đây là loại môi trường thường được sử dụng nhất trong nuôi cấy và phân lập H. influenzae. + Thạch máu thỏ tươi 7% : Sau khi nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường phân lập, ủ ấm trong khí trường 5% CO 2 (nếu không có tủ ấm CO 2 , môi trường nuôi cấy được đặt trong một chuông thủy tinh và đốt 1 cây nến trong quả chuông này. Sau khi ngọn nến tắt, khí trường bên trong quả chuông có thể là 3 - 5% CO 2 ) ở 37 o C trong thời gian 18 - 24h. (1) (2) Hình 1.3: (1). Khuẩn lạc H. influenzae mọc trên môi trường chocolate ; (2). Khuẩn lạc H. influenzae mọc trên môi trường thạch máu thỏ tươi 7%. Sau 18 - 24h, quan sát các khuẩn lạc của H. influenzae mọc trên môi trường với đặc điểm: khuẩn lạc nhỏ kích thước khoảng 1-2 mm, tròn, vồng nhẹ và hơi trong, óng ánh khi chiếu sáng và không gây tan huyết. Sau 16 - 18h nuôi cấy, Haemophilus influenzae phát triển thành những khuẩn lạc bóng mờ, vồng nhẹ, đường kính từ 1- 2mm và không gây tan huyết. 7 7 Vi khuẩn Hib luôn có vỏ, khuẩn lạc thường sáng bóng, nhày ướt, óng ánh khi ánh sáng chiếu vào và có đường kính lớn hơn. Ngoài ra, môi trường nuôi cấy vi khuẩn thuần nhất thường có mùi hăng đặc biệt (hăng indole). Sau 24 - 48h, trạng thái mất vỏ xuất hiện, tính óng ánh biến mất, vi khuẩn tự ly giải và có thể tính chất bắt màu Gram thay đổi. Trên môi trường lỏng, Haemophilus influenzae thường phát triển làm đục môi trường. Tình trạng mất vỏ xảy ra sớm hơn trên môi trường thạch, vì vậy nếu muốn xác định vỏ cần chọn thời điểm nuôi cấy thích hợp (18h). Những đặc điểm này cũng cần phân biệt với các loại Heamophilus khác ở những đặc điểm sau đây: Tính chất Loài Tan huyết Cần yếu tố X Cần yếu tố V Cần CO 2 H. influenzae - + + + H. parainfluenzae - - + - H. hemolyticus + + + - H. parahemolyticus + - + ± H. aphrophilus - + - + H. paraphrophilus - - + + Bảng 1.1: Những đặc điểm sinh học sinh học để phân biệt H. influenzae với các Haemophilus khác. 1.2.3.2. Tính chất sinh hóa đặc trưng của H. influenzae và phương pháp xác định Tính chất sinh hóa đặc trưng của H. influenzae là nhu cầu đòi hỏi bắt buộc 2 yếu tố phát triển là X và V trong môi trường nuôi cấy. Tính chất này có thể được xác định bằng một trong các thử nghiệm sau [3], [16], [17], [61]: - Thử nghiệm với yếu tố X và V: 8 8 Sử dụng một đĩa môi trường thạch dinh dưỡng Trypticasein Soya, cấy vi khuẩn phân lập được nghi ngờ là H. influenzae lên một nửa đĩa thạch bằng cách ria dày theo 3 hướng. Sau đó, đặt các khoanh giấy X, V và XV lên vùng nuôi cấy, khoảng cách giữa các khoanh giấy là 1,5 - 2,0 cm. Ủ ở 37 o C với khí trường 5% CO 2 qua đêm rồi đọc kết quả: + Nếu vi khuẩn chỉ mọc xung quanh khoanh giấy XV hoặc giữa 2 khoanh giấy X và V thì đó chính là H. influenzae, nếu chỉ mọc xung quanh V thì đó là H. parainfluenzae. + Nếu vi khuẩn chỉ mọc xung quanh khoanh giấy X và XV thì đó là H. aphrophilus. + Nếu vi khuẩn mọc xung quanh khoanh giấy XV hoặc giữa 2 khoanh giấy X và V, có gây tan huyết thì đó là H. hemolyticus. Hình 1.4: Thử nghiệm với yếu tố X, V bằng 2 khoanh giấy X, V cho kết quả là vi khuẩn đòi hỏi bắt buộc phải có cả 2 yếu tố X, V cho sự phát triển. 9 9 Hình 1.5: Thử nghiệm với bằng 3 khoanh giấy X, V và XV, cho thấy vi khuẩn đòi hỏi bắt buộc phải có cả 2 yếu tố X và V cho sự phát triển. Hình 1.6: Vi khuẩn chỉ đòi hỏi bắt buộc phải có cả 1 yếu tố V cho sự phát triển (H. parainfluenzae) 1 0 1 0 [...]... lành mang Hib có thể đã dẫn đến đánh giá tỷ lệ mang vi khuẩn Hib ở trẻ nhỏ dưới mức thực tế Với nhiều kỹ thuật nuôi cấy có độ nhạy cao, hiện nay các phương pháp xác định tỷ lệ trẻ mang Hib hoặc trẻ b mắc nhiễm trùng, do đó đã giải thích được sự xuất hiện của miễn dịch tự nhiên (natural immunity) [6] 3 5 3 5 KẾT LUẬN Haemophilus < /b> influenzae < /b> typ < /b> b (Hib) là loại vi khuẩn có đặc điểm sinh học đặc biệt Hib... giới và chủng tộc với tỷ lệ mang Hib [26], [36] 2.3 Trẻ khỏe mạnh mang Hib và sự lan truyền b nh tật 3 2 3 2 Hầu hết b nh nhân mắc b nh do Hib đều không tiếp xúc với những người đang mắc các b nh nhiễm trùng xâm nhập do Hib, b i vì vi khuẩn này không có ổ chứa ở ngoài cơ thể Do đó, những người mang Hib không có triệu chứng được xác định nguồn lây nhiễm chính Mối liên quan giữa tỷ lệ người khỏe mạnh mang. .. HƯỞNG 2.1 Khái niệm người khỏe mạnh có mang Haemophilus < /b> influenzae < /b> typ < /b> b và các phương pháp xác định 2.1.1 Khái niệm về người khỏe mạnh mang vi khuẩn (Hib) Người khỏe mạnh mang vi khuẩn (carriers) là những người mang vi khuẩn gây b nh trong cơ thể mà không có biểu hiện triệu chứng hoặc không phát hiện thấy dấu hiệu đáp ứng miễn dịch của cơ thể [6] Trạng thái mang vi khuẩn của cơ thể có thể tồn tại... tế, tỷ lệ trẻ mang Hib thường ít hơn 5%, nhưng tỷ lệ mang vi khuẩn Hib tại các trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày được b o cáo chiếm khoảng 15-25% [22], [31], [54] Điển hình, trong một nghiên cứu lâu dài 18 tháng tại một trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày ở Dallas, người ta thấy mặc dù không có một trường hợp nào mắc b nh nhưng tỷ lệ mang vi khuẩn Hib trung b nh là 10%, trong đó: ở trẻ từ 18-35 tháng tuổi tỷ. .. trên môi trường ID) và xác định kháng nguyên typ < /b> b (b ng phương pháp ngưng kết trên lam kính hoặc với mồi đặc hiệu của phản ứng PCR) - Typ < /b> sinh học chủ yếu tập trung ở biotype II, tiếp theo là I và các typ < /b> khác chiếm tỷ lệ rất thấp (xác định typ < /b> sinh học thường xác định b ng thanh Api 10S – Bio Mérieux) Người khỏe mạnh mang Hib là nguồn lây chủ yếu vi khuẩn này trong cộng đồng và cũng là nguồn lây... của vi khuẩn này giữa các cơ thể là bao lâu? Giới hạn vị trí quần thể vi khuẩn định cư là ở chỗ nào và liều lượng vi khuẩn là bao nhiêu để đảm b o cho quá trình lây truyền thành công? Có hay 3 3 3 3 không b t cứ mối liên quan nào giữa mức độ liều nhiễm trùng hoặc số lượng vi khuẩn cơ thể mang với khả năng xảy ra b nh nhiễm trùng xâm nhập? [6] 2.4 Người lành mang Hib và sinh b nh học Sinh b nh học cho... trẻ khỏe mạnh mang H influenzae < /b> đều được định typ < /b> huyết thanh Nghiên cứu của Staphanie H Factor và cộng sự về tỷ lệ trẻ dưới 5 tuổi có mang Hib tại Châu Á, cho thấy tỷ lệ chung là 6% Trong đó: 3% (trẻ 2 – 5 tháng); 10% (trẻ 6 - 11 tháng); 5% (trẻ 12 - 23 tháng); 8% (trẻ 24 - 35 tháng); 4% (trẻ 36 - 47 tháng) và 5% (trẻ 48 - 59 tháng) [22] Nghiên cứu khác của Gómez, Elizabeth và cộng sự về dịch tễ học. .. sóc trẻ ban ngày cũng góp phần làm cho tỷ lệ mang vi khuẩn Hib ở trẻ nhỏ có thể cao hơn một cách đáng kể Một số nghiên cứu cho thấy tại những cơ sở chăm sóc trẻ, khi có xảy một nhiễm khuẩn xâm lấn do Hib, tỷ lệ mang vi khuẩn này ở những đứa trẻ khác trong nhóm là 58% ở các trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày và 91% ở các nhà giữ trẻ nhỏ hơn Tương tự, trong một gia đình, khi có một trường hợp b nhiễm b nh... sự về dịch tễ học của trẻ khỏe mạnh mang Hib tại Santo Domingo, nước cộng hòa Dominic cho thấy tỷ lệ trẻ mang Hib: 1,5% (trẻ dưới 5 tháng); cao nhất 12,5% (trẻ 6 - 11 tháng); 6% (trẻ 12 - 23 tháng); 7,9% (trẻ 24 - 35 tháng); 9,8% (trẻ 2 5 2 5 36 - 47 tháng) [26] Tại Thổ Nhĩ Kỳ, nghiên cứu của Muge Oguzkaya – Artan và cộng sự cho thấy tỷ lệ trẻ nhỏ ở lứa tuổi 5 – 7 mang Hib với tỷ lệ là 4,2% [45] Nghiên... trên Trong đó, H influenzae < /b> typ < /b> b có ở 1-5% trẻ em khoẻ mạnh và không có biểu hiện b nh [16] Tỷ lệ mang vi khuẩn thấp nhất ở người lớn và trẻ nhỏ, cao nhất ở lứa tuổi mẫu giáo [34], [54], [59] Hầu hết các điều tra đều cho thấy, nuôi cấy từ tăm b ng b nh phẩm ngoáy họng miệng hay họng mũi phát hiện thấy Hib có khoảng 3 - 5% trẻ nhỏ dưới năm tuổi [30], [52], đây là lứa tuổi với tỷ lệ mang Hib được xem là . đề: "Haemophilus influenzae typ b: Đặc điểm sinh học và tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn& quot; nhằm đưa ra những thông tin cơ b n nhất về vi khuẩn này để góp phần cho công tác chẩn đoán và phòng b nh do. ĐỀ H. influenzae là thành vi n của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp trên. Trong đó, H. influenzae typ b (Hib) có ở 1-5% trẻ em khoẻ mạnh và không có biểu hiện b nh [16]. Tỷ lệ mang vi khuẩn. Haemophilus influenzae typ b trên lâm sàng. Chuyên đề thực hiện với 2 mục tiêu: 1. Tìm hiểu lịch sử phát hiện và đặc điểm sinh học đặc trưng của Haemophilus influenzae typ b 2. Đánh giá tỷ lệ trẻ khỏe mạnh