BÀI LUẬN Lí DO LỰA CHỌN LĨNH VỰC, ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU 1.1 Lựa chọn lĩnh vực nghiên cứu: Đối phó với bệnh tật từ lâu hoạt động mang tính sinh tồn người Khoa học phát triển, người có điều kiện nâng cao khả đối phó với bệnh tật Cao nữa, khơng đối phó thụ động điều trị mà người chủ động phòng chống bệnh tật qua biện pháp y tế dự phòng mà tiêu biểu đời phát triển vắc xin Vắc xin học mở đầu thành công vào cuối kỷ 18 bác sĩ thú y Jenner E (Anh) với vắc xin làm từ chủng đậu bũ tiờm cho cậu bé 13 tuổi Phillip J Hiện nay, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) công nhận tiêm vắc xin phương cách bảo vệ hiệu quả, giúp nhân loại tránh nhiều bệnh truyền nhiễm Trong kỷ qua, vắc xin loại dược phẩm đặc biệt, góp phần lớn đẩy lùi nhiều bệnh tật giảm tỷ lệ tử vong cho người Vắc xin sử dụng tồn giới, góp phần tốn số bệnh truyền nhiễm làm giảm đáng kể số mắc, chết nhiều loại bệnh tật khác, làm giảm đáng kể gánh nặng công tác điều trị Tiêm chủng vắc xin trở thành phương tiện hiệu cho cơng tác chủ động phịng chống bệnh Việt Nam nước thuộc vùng nhiệt đới với mô hình bệnh tật chủ yếu bệnh truyền nhiễm, dịch bệnh dễ xảy thay đổi môi trường, lối sống, giao lưu quốc tế tăng Do đó, biện pháp để phòng chống dịch bệnh sử dụng vắc xin đặc hiệu Nhưng vấn đề an toàn vắc xin, chất lượng vắc xin đã, thách thức lớn với nhà khoa học Việt nam toàn giới Lịch sử phát triển vắc xin phải ghi nhận số “thảm họa” vắc xin [3] Những phản ứng không mong muốn vắc xin cho người mặt trái, gõy cản trở cho công tác vận động tiêm chủng Ngày nay, với phát triển không ngừng khoa học công tác kiểm định đánh giá chất lượng vắc xin, tỷ lệ xuất phản ứng phụ nghiêm trọng vắc xin giảm nhiều, vấn đề xác định nguyờn nhân cách khắc phục khó khăn khơng nhỏ quốc gia Tuy vậy, trước phát triển nhanh chóng đất nước xu hội nhập hồ bình, nhu cầu phịng bệnh vắc xin tăng lên đáng kể Ngoài vắc xin dùng chương trình tiêm chủng mở rộng, nhu cầu vắc xin khác hình thành gia tăng nhanh chóng Người dân khơng địi hỏi có vắc xin để dùng mà phải vắc xin có chất lượng tốt, cách dùng thuận tiện đặc biệt phải an tồn Chớnh tơi chọn lĩnh vực nghiên cứu này, với mong muốn với Thày, Cụ, nhà khoa học trước đồng nghiệp tìm phương pháp góp phần giải khó khăn 1.2 Lý lựa chọn đề tài Bệnh cúm đe doạ toàn cầu Trong ba kỷ qua, khoảng 30 đến 40 năm, giới lại chứng kiến đại dịch cúm Trước có vắc xin, đợt dịch có hàng triệu người chết Năm 1918 chứng kiến đại dịch cúm nghiêm trọng lịch sử giới, chí cịn cho đại dịch kinh hoàng loại bệnh dịch Tác nhân gây dịch virus cúm A/H1N1 gây tổn thất chưa thấy Chỉ thời gian ngắn, người bệnh nhanh chóng bị suy hơ hấp tử vong Người ta ước tính khoảng 50 triệu người tử vong toàn giới Số tử vong cao người trẻ khoẻ mạnh độ tuổi từ 25 đến 35 Khoảng 25% dân số nước Mỹ Vương quốc Anh bị mắc bệnh Năm 1957 đánh dấu “dịch cúm châu Á” Tác nhân gây dịch virus cúm A/H2N2 có độc tính thấp vi rút gây đại dịch xảy năm 1918-1919 giới có chuẩn bị ứng phó tốt Virus phát Singapore sau lan khắp giới Nhờ tiến khoa học, dịch bệnh nhanh chóng xác định, biện pháp y tế cần thiết triển khai, có việc sử dụng vắc xin Tuy số lượng người chết vỡ cỳm mức triệu Năm 1976 New Jersey, Mỹ, xuất dịch cúm khiến người chết Virus chủ yếu tồn lợn, 45 triệu liều vắc xin cúm lợn dùng Không thiệt mạng thờm vỡ cỳm lợn, có 25 người chết biến chứng vắc xin Một ủy ban điều tra thành lập cho ngừng sử dụng vắc xin cúm Năm 2003, cúm gia cầm phát Hàn Quốc, chớnh phủ lệnh tiêu hủy gần triệu gà vịt Cũng năm này, khoảng 400 ca nhiễm cúm gia cầm phát Việt Nam Năm sau đó, hầu hết 64 tỉnh thành xuất cúm [16] Tính đến 12/2009 có 46 người tử vong cúm A/H5N1 VN, có 12 thai phụ [2] Tại Việt Nam: Hội chứng cúm thường xảy quanh năm khắp đất nước với tỷ lệ mắc trung bình năm cuối thập kỷ 90 ghi nhận 1.627,2/ 100.000 dân, xếp thứ 10 bệnh trun nhiễm có tỷ lệ mắc cao Việt Nam Năm 2004, Việt Nam có 1.650.459 trường hợp mắc, tử vong đuợc thông báo, đứng thứ sè 10 bệnh có tỷ lệ mắc cao Có thể núi cỳm bệnh truyền nhiễm gõy dịch nguy hiểm, từ mức nhẹ đến nặng, gõy ảnh hưởng khơng nhỏ đến đời sống, sức khỏe người phát triển kinh tế xã hội quốc gia toàn cầu [10] Theo nghiên cứu Marc J.Satorn Shahi, cố vấn y tế châu Á Singapore, chi phí cho bệnh cúm nước Đông Nam Á khoảng 8,7 tỷ USD/ năm khám chữa bệnh [8] Ngoài ra, cộng thêm tổn thất giỏn tiếp lớn sản xuất - phải tiêu hủy hàng triệu gia cầm; phát triển kinh tế xã hội - người bệnh phải nghỉ việc điều trị Như vậy, việc triển khai sử dụng vắc xin cộng đồng cần thiết Trong điều kiện xảy dịch cúm, việc sử dụng vắc xin thuốc kháng virus hai biện pháp hữu hiệu nhất, làm giảm tỷ lệ mắc tỷ lệ chết Năm 2009, theo ước lượng WHO, tồn giới cú 150 triệu liều vắc xin ngừa cúm A/H1N1 phân phối, 95 triệu liều tiêm, 30% loại vắc xin có tá dược Các phản ứng mẫn thông báo gồm mề đay, phù mạch sốc phản vệ, dao động từ nhẹ đến nghiêm trọng Trong sốc phản vệ đe dọa tính mạng khơng chăm sóc y tế kịp thời [1] Ở nước ta, bệnh cúm bị “xem thường”, nên chưa có ý‎ thức phòng bệnh cao Vắc xin cỳm, vỡ vậy, lâu không ý‎; công tác kiểm định chưa quan tâm mực Việc kiểm sốt chặt chẽ chất lượng vắc xin góp phần làm giảm thiểu tai biến tiêm vắc xin, đảm bảo tính an tồn hiệu cho người sử dụng vắc xin Vắc xin cúm có nhiều loại, kiểm định chất lượng khác nhau, khơng thống nhất; gõy khó khăn cho nhập khẩu, phân phối sử dụng Khơng thế, quy trình kiểm định vắc xin cúm lại chưa chuẩn hoá, phù hợp với điều kiện nước Xuất phát từ lý‎ trờn, tụi nhận thấy Việt nam thực cần thiết phải có quy trình đánh giá chất lượng vắc xin cúm đạt tiêu chuẩn, phù hợp, giảm thiểu tối đa rủi ro sử dụng Góp phần nâng cao chất lượng phịng bệnh chăm sóc sức khỏe ban đầu y học tương lai, nâng cao chất lượng sống cho nhân dân Do đó, tơi lựa chọn thực đề tài: “Chuẩn hóa quy trình kiểm định vắc xin cúm Việt nam” MỤC TIÊU VÀ MONG MUỐN ĐẠT ĐƯỢC KHI ĐĂNG KÝ ĐI HỌC NGHIÊN CỨU SINH Tôi mong muốn hoàn thành mục tiêu đề tài: 1) Đánh giá quy trình kiểm định vắc xin cúm 2) Đề xuất quy trình kiểm định chuẩn Lí DO LỰA CHỌN CƠ SỞ ĐÀO TẠO Qua tìm hiểu tơi biết: Viện kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế Bộ Y tế, sở định Chính phủ, giao trọng tâm công việc cho Viện phát triển mạnh kiểm định phịng thí nghiệm Viện lại có nhiều cán có kinh nghiệm, tâm huyết với nghề kiểm định Bên cạnh đó, viện có Khoa chuyờn môn (Khoa kiểm định vắc xin virus, Khoa kiểm định vắc xin vi khuẩn, Khoa kiểm định Hoá-Lý‎, Khoa Sinh phẩm y tế, Khoa Môi trường thực nghiệm Khoa Động vật thực nghiệm), giỳp tụi thực nội dung, mục tiêu đề tài KINH NGHIỆM, KIẾN THỨC, SỰ CHUẨN BỊ TRONG VẤN ĐỀ DỰ ĐỊNH NGHIÊN CỨU 4.1 Bệnh cúm Cúm bệnh viêm đường hô hấp cấp tÝnh vi rút cúm (influenza), lây lan nhanh Bệnh lây chủ yÕu từ người bệnh sang người lành qua tiếp xúc trực tiếp đường hơ hấp, niêm mạc mắt Bệnh cúm từ gia cầm lây sang người (hay gọi bệnh cúm gia cầm) có tỷ lệ tử vong cao Bệnh có biểu sốt, đau đầu, đau cơ, đau họng, ho…, dẫn đến viêm phổi gây tổn thương phủ tạng khác với tỷ lệ tử vong cao không phát sớm để điều trị kịp thời Virus cúm thường gây tử vong đối tượng bị suy giảm miễn dịch hệ miễn dịch khơng hồn hảo người già, trẻ em, người bị nhiễm HIV người có nguy viêm phổi [17] 4.2 Virus cúm 4.2.1 Cấu trúc Virus cúm phân lập lần đầu năm 1933, thành viên nhóm Orthomyxovirus, thuộc họ Orthomyxoviridae gồm có tý‎p: Cóm A, B C, tý‎p A B gây bệnh cho người Hạt virus cúm bao bọc lớp lipid kộp cú nguồn gốc từ tế bào vật chủ bứt khỏi tế bào Trên lớp màng nhô glycoprotein thuộc hai nhúm chớnh Hemagglutinin (HA) Neuraminidase (NA) Vai trò HA giúp virus gắn vào thụ thể tế bào vật chủ để kích thích tế bào vật chủ “nuốt” virus vào (endocytosis), cịn vai trị NA không rõ ràng, cú lẽ nú giỳp virus bứt khỏi tế bào vật chủ cách cắt sialic acid khỏi glycoprotein virus tế bào vật chủ Bên lớp vỏ lipid kép lớp protein bao quanh vỏ nhân (nucleocapsid), bên lõi ARN gồm đoạn khác Các loại cúm A, B C khác số lượng đoạn RNA cấu trúc protein protein nhõn Cỳm A loại gõy đại dịch cho người vật nuôi nhiều [15] Khả thay đổi cấu trúc kháng nguyờn: Cấu trúc hemagglutinin (H) thay đổi tạo thành H mới, tạo thành typ cúm mới, gõy nên dịch Các KN (N) thay đổi, đăc biệt virus typ A B Do vậy, virus cúm A B có nhiều thứ tý‎p (Subtype) Sự khác cấu trúc HA NA chủng virus cúm khác sử dụng để phân loại chúng Các chủng virus cúm gõy đại dịch cho người A/H0N1, H1N1, H2N2, H7N7, H5N1 Điều đỏng chỳ ý‎ đại dịch cúm thường lặp lại có tính chu kỳ, nhiều chủng virus cỳm gõy Hình 1: Cấu trúc virus cóm Hình 2: Mơ hình cấu trúc virút cúm H5N1 Hinh 3: Virus H5N1 chuỗi cầu màu xanh tìm cách phá hủy tế bào màu hồng ( Lennart Nilsson/ Theo AFP, VNM) 4.2.2 Các týp virus cúm [11]: - Cóm A (Influenza týp A) Cóm A gây nhiễm cho người, chim, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi động vật khác Nhưng loài chim hoang dã vật chủ thiên nhiên virút Cóm A chia phân tý‎p dựa vào protein bề mặt hạt virus Những protein gọi hemagglutinin (HA) neuraminidase (NA) Có 16 phân tý‎p HA khác phân tý‎p NA, có nhiều phối hợp khác HA NA có số tý‎p cóm A H1N1, H3N2 H2N2 lưu hành thường xuyên quần thể người Các phân tý‎p khác tìm thấy động vật H7N7, H3N8 gây bệnh cho ngựa Phân tý‎p cóm A đặt tên theo protein bề mặt HA NA chúng Ví dơ: H7N2 biểu thị HA protein NA protein Tương tự vậy, H5N1 có HA protein NA protein - Cóm B (Influenza týp B): Cóm B thường gặp người Khơng giống với cúm A, cóm B khơng xếp loại theo phân tý‎p Mặc dù cúm B gây thành dịch người chưa gây đại dịch cúm A - Cóm C (Influenza týp C) Virus C gây bệnh nhẹ người khơng gây thành dịch Virus cóm C khơng có phân tý‎p 4.2.3 Chủng virus (strains) Cóm B phân tý‎p cóm A đặc trưng tên chủng, có rÊt nhiều chủng cúm B phân tý‎p cóm A Các chủng cúm xuất để thay chủng cũ Quá trình xảy thay đổi tý‎p gọi tượng trôi kháng nguyên (Drift) trượt kháng nguyên (Shift) Mét xuất chủng cúm người, kháng thể xuất sau nhiễm virus tiêm vắc xin với chủng cúm cũ bảo vệ nhiễm chủng 4.2.4 Sự biến đổi virus cúm Virus cúm biến đổi nhiều cách Một tý‎p gọi trơi kháng ngun có nghĩa biến đổi xảy Ýt liên tục thời gian dài Sản phẩm virus biến đổi khơng nhận thấy kháng thể tạo sớm chủng virus cúm Quá trình sau: người mắc cúm thể sinh kháng thể kháng virus đó, chủng virus xuất hiện, kháng thể kháng chủng cũ không nhận virus nhiễm chủng virút xảy Đó lý‎ chÝnh giải thÝch người ta lại tái nhiễm virus cóm, hai ba chủng virus sử dụng để chế tạo vắc xin phải cập nhật để kiểm tra lại biến đổi virus cúm lưu hành Vì vậy, cần tiêm vắc xin cúm hàng năm [10], [12] Mét tý‎p khác gọi trượt kháng nguyên hay đổi chỗ kháng nguyên (antigen shift) Hiện tượng trượt kháng nguyên đột ngột, biến đổi chủ yÕu cúm A Kết virút hình thành, gây bệnh cho người có protein HA HA NA mà nhiều năm khơng tìm thấy người Nếu phân tý‎p cúm đưa vào quần thể dân cư, người có Ýt khơng có bảo vệ với virus virus lây dễ dàng từ người sang người đại dịch xảy Những biến đổi virus cóm thường mức độ trơi kháng ngun Trong trường hợp có “trượt kháng ngun” xảy virus cóm A phải trải qua hai loại trôi trượt kháng nguyên, virus cóm B biến đổi q trình ổn định dài trôi kháng nguyên 4.2.5 Cúm A lây từ động vật sang người Hình Các lồi nhiễm cúm A, nhóm HA NA Virus cóm A tìm thấy nhiều động vật: gà, vịt, lợn, cá voi, ngựa, hải cẩu Tuy nhiên, phân tý‎p thÝch nghi với loài động vật loại trừ gia cầm chim vật chủ cho tất phân tý‎p cóm A Các phân tý‎p gây dịch rộng khắp người trước H3N2, H2N2, H1N1, H1N2 Phân tý‎p H1N1 H3N2 gây dịch cúm lợn; H7N7 H3N8 gõy dịch ngựa Cho đến năm 1998 có virus cóm A/H1N1 lưu hành quần thể lợn Mỹ Tuy nhiên năm 1998, virus cóm A/H3N2 từ người nhiễm vào quần thể lợn gây dịch cúm lợn [7] 10 - Đánh giá phịng thí nghiệm: Rất quan trọng, bao gồm thử nghiệm mặt hóa học (nhận dạng, tính chất hóa lý‎); sinh vật học (vơ khuẩn, an tồn, cơng hiệu chất gõy sốt) Các thử nghiệm phải thực theo thường quy thống toàn cầu quốc gia - Đánh giá lâm sàng yêu cầu bắt buộc vắc xin thực với nội dung hiệu an toàn - Đánh giá thực địa xác định hiệu bảo vệ vắc xin thể khả bảo vệ thể bệnh nhiễm trùng tương ứng 4.4.2 Kiểm tra tính chất sinh học 4.4.2.1 Kiểm tra vơ khuẩn: Để xác định vô khuẩn vắc xin Vắc xin phải khơng có tạp khuẩn nấm phát triển môi trường kiểm tra suốt thời gian theo dõi 4.4.2.2 Kiểm tra an toàn: Phải thực động vật tất vắc xin trước cấp giấy phép xuất xưởng Vắc xin kháng nguyờn dị nguyờn nên thể có phản ứng phụ (ít nhiều) sau tiêm So sánh với xuất kháng thể bảo vệ dạng chế xuất phản ứng phụ phức tạp đa dạng, việc kiểm tra an toàn cần đặc biệt trọng Trong thử nghiệm an tồn có thử nghiệm để xác định độc tố từ thân sản phẩm thử nghiệm để phát sinh vật nhiễm chất nhiễm có độc tính tồn vắc xin 4.4.2.3 Kiểm tra cơng hiệu (potency): Mục đích xác định hàm lượng hoạt chất vắc xin Hiệu lực vắc xin đảm bảo thử nghiệm thực giai đoạn trình sản xuất sản phẩm cuối Ở khía cạnh đó, kết đạt thử nghiệm cơng hiệu liên quan đến hiệu lực bảo vệ người Tùy loại vắc xin mà phương pháp xác định công hiệu khác Theo quy định, vắc xin tiêm cho động vật thí nghiệm 19 phù hợp sau khoảng thời gian định lấy máu để xác định hiệu giá kháng thể xác định mức độ bảo vệ việc thử thách trực tiếp với chủng thử thách Hiên Việt nam kỹ thuật miễn dịch khuếch tán đơn (SRD) phương pháp thường sử dụng cho việc xác định hàm lượng kháng nguyên vắc xin, làm tiêu chuẩn đánh giá hiệu lực vắc xin cúm 4.4.2.4 Thử nghiệm chất gõy sốt: Được thực để phát thành phần gõy sốt có sản phẩm Thử nghiệm Limulus phát nội độc tố có độ nhạy cao nhiều so với thử nghiệm thỏ 4.4.3 Kiểm tra lý hóa học Tuỳ theo loại vắc xin, thường kiểm tra mặt sau đõy: - Trạng thái bên : Màu sắc, độ đục, thể tích vắc xin, nhãn - Độ pH - Hàm lượng protein toàn phần - Các thành phần hóa học có vắc xin formaldehyt, thimerosal, nhôm - Kiểm tra hạn sử dụng 4.4.4 Kiểm định đánh giá chất lượng vắc xin cúm theo khuyến cáo WHO [18], [19], [20] - Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA): Kháng nguyên ngưng kết hồng cầu virus chuẩn độ trờn cỏc phiến nhựa 96 giếng với dung dịch hồng cầu gà 0.5% Phản ứng (+) có ngưng kết HC Độ pha lỗng cao cho tượng ngưng kết hiệu giá ngưng kết - Phản ứng ức chế ngưng kết HC: Huyết chứa kháng thể có khả ức chế ngăn không cho tượng ngưng kết HC xảy Phản ứng dương tính HC lắng hồn tồn (-) HC bị ngưng kết - Thử nghiệm vô khuẩn 20 - Hàm lượng HA: xác định phương pháp miễn dịch khuếch tán đơn NRA phê chuẩn WHO quy định vắc xin cúm phải chứa 15 àg HA cho chủng virus sử dụng cho liều người - Phương pháp LAL, xác định Endotoxin (nội độc tố): Không 200 EU/ml - Xác định protein toàn phần - Phương pháp xác định Ovalbumin (bằng phương pháp ELISA) Ovalbumin protein chớnh cú lòng trắng trứng, chất hay gây dị ứng với người động vật Hàm lượng cho phép không 2000 ng/ml - Phương pháp Kijehdal, xác định nitơ tổng số - Khả bất hoạt: Trung hòa formalin mẫu thử dung dịch NaHSO3 Sau trung hòa cấy 0,2 ml nồng độ khơng pha lỗng, pha lỗng 1/10, 1/100 vào khoang niệu phôi gà ấp 10-11 ngày tuổi, ủ 33 34ºC ngày Thu hoạch 0.5 dịch niệu nang từ trứng sống trộn chung cho nồng độ tiếp tục cấy nồng độ 10 trứng Không ngưng kết HC tất trứng - Kiểm tra hồi độc : mẫu thử pha lỗng có nồng độ tương đương vắc xin thành phẩm, sau ủ nhiệt độ 37ºC - tuần Các bước thực tương tự - Kiểm tra an toàn chung: Thử chuột nhắt chuột lang - Xỏc định tiêu lý húa khác: pH, điều kiện bảo quản, chất bảo quản, chất hấp phụ… - Kiểm tra đáp ứng miễn dịch: Tiêm bắp cho chuột bắp chuột lang 0,1ml 0,2 ml vắc xin hấp phụ kháng nguyên tinh chế cú cựng nồng độ với vắc xin hấp phụ cách 20 ngày Sau mũi tiêm thứ hai 10 ngày lấy máu làm phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu 21 4.4.5 Ý nghĩa thành phần hóa học vắc xin vấn đề kiểm định - Độ pH : Vắc xin cúm dạng tiêm cần có pH giống máu Mặc dù vậy, độ pH điều chỉnh cho phù hợp, lý‎ ổn định vắc xin - Thimerosal: hợp chất hữu có chứa thủy ngân (Hg), dùng làm chất bảo quản Với lượng nhỏ ngăn chặn vi khuẩn vi sinh vật khác nhiễm vào vắc xin Thủy ngân có hại cho não, da Lượng thimerosal vắc xin nhỏ, nguy tác dụng phụ có lý‎ thuyết Tuy nhiên, lượng thủy ngân không vượt giới hạn cho phép TCYTTG [6] - Focmaldehyt: hóa chất có tác dụng làm bất hoạt độc tố làm bền tính kháng nguyên Hàm lượng focmaldehyt không vượt 0,02% (trọng lượng/ thể tích) - Chất hấp phụ nhơm (Al) : Tác dụng tăng kích thích đáp ứng miễn dịch KN có vắc xin Tác dụng khơng việc giải phóng từ từ tác nhân gây miễn dịch mà việc tạo phản ứng viêm nội kích thích việc giải phóng cytokin FDA giới hạn lượng hấp phụ khơng q 0,85 mg nhơm liều vắc xin - Protein:chính KN đăc hiệu để kích thích đáp ứng miễn dịch Thường có nguồn gốc vi sinh vật gây bệnh phải làm giảm hoạt tính Các protein có cấu trúc phân tử phức tạp, dễ dàng bị biến tính nhiệt độ thời gian, phải kiểm tra chất lượng nghiêm ngặt theo lô, loạt, công đoạn sản xuất 4.4.6 Kiểm tra trình sản xuất Kiểm tra q trình sản xuất có tầm quan trọng lớn chắn sai sót làm ảnh hưởng đến chất lượng vắc xin thành phẩm 22 4.4.7 Một số kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng nghiên cứu 4.4.5.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Là kỹ thuật tương đối đơn giản cho phép nhân nhanh số lượng không hạn chế nguyên đoạn ADN định nhờ xúc tác ADN polymerase Tất ADN polymerase hoạt động mạch ADN từ mạch khuôn cần diện mồi đặc hiệu Mồi đoạn ADN ngắn có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn ADN polymerase nối dài mồi để hình thành mạch Căn vào đặc điểm thường gặp vi sinh vật (VSV) quan tâm, người ta thiết kế gen mồi (primer) phù hợp nhằm khuếch đại vùng ổn định Khi đưa gen mồi vào hỗn hợp ADN tách chiết từ VSV, ADN có chứa đoạn gen có trình tự nucleotide bổ sung với trình tự gen mồi thỡ chỳng cặp đôi với nhau, sau gen mồi kéo dài phía đầu 3’ nhờ ADN polymerase Nhờ đoạn ADN nhân lên cách đặc hiệu nhiều lần, sau điện di gel agarose nhuộm ethidium bromide để đọc kết [5] 4.4.5.2 Kỹ thuật xác định trình tự nucleotit Những phương pháp đọc trình tự axid nucleic sử dụng cải tiến từ phương pháp enzym học thông qua việc sử dụng dideoxy nucleotid Sanger cộng (1977) Phương pháp dựa vào tổng hợp ADN mạch bổ sung nhờ enzym ADN polymerase cho trình tự ADN mạch đơn cần xác định Đặc trưng phương pháp loại nucleotid thơng thường cịn sử dụng thêm loại dideoxy nucleotid deoxy nucleotid nhóm 3’OH thay H Điều khiến cho dideoxy nucleotid không cịn khả hình thành cầu nối phosphodieste đó, q trình tổng hợp bị ngừng lại 23 Trong kỹ thuật đọc trình tự nucleotid tự động, dideoxy nucleotid đánh dấu chất huỳnh quang có màu khác Nh vậy, tất oligo nucleotid chấm dứt trình tự loại dideoxy nucleotid có màu Sau điện di ống vi quản, tạo dãy phân đoạn ADN nucleotid Thiết bị phát huỳnh quang (detector) phát băng theo thời gian, băng xa phát trước Kết xác định trình tự xử lý‎ phần mềm máy tính chun dụng Có thể ứng dụng kỹ thuật để xác định xác đoạn gen đặc hiệu chủng virus cúm sản xuất vắc xin sử dụng cho nghiên cứu 4.4.5.3 Phân tích protein kỹ thuật điện di biến tính gel polyacrylamid (SDS-PAGE) Kỹ thuật ứng dụng kiểm định vắc xin để xác định trọng lượng Protein Ovalbumin có vắc xin vắc xin bán thành phẩm Đây kỹ thuật ứng dụng, Việt nam chưa tiến hành SDS -PAGE tiến hành theo Laemmli phương pháp dùng để xác định trọng lượng phân tử protein hỗn hợp Dưới tác dụng SDS (Sodium Dedocyl Sulfate), hỗn hợp dung dịch đệm nhiệt độ tối thiểu 60 oC, cầu nối disulfua bị đứt gãy, vùng kỵ nước toàn protein bao phủ phân tử SDS tích điện âm Việc biến tính khơng giúp tất protein có chung dạng cấu trúc mà cịn đồng hố tồn chúng thành phân tử tích điện âm để dễ dàng di chuyển cực dương điện trường Bản gel để phân tách protein chứa sợi polyme gồm monomeracrylamid tạo nên rãnh có kích thước khác Chất màu brommophenol blue dung dịch đệm cho biết thời điểm kết thúc trình chạy điện di Chất nhuộm coomassie với gốc sulfonic có khả liên kết với gốc amin protein qua 24 tương tác tĩnh điện Van der Waals, thơng qua quan sát vạch protein NHỮNG DỰ ĐỊNH VÀ KẾ HOẠCH 5.1 Dự định - Tiếp cận, học hỏi tất kiến thức bản, kiến thức cập nhật, công tác kiểm tra đánh giá chất lượng vắc xin sở đào tạo lựa chọn (Viện kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế); lý‎ thuyết thực hành kỹ thuật, làm thực nghiệm - Dịch tài liệu có liên quan theo quy định TCYTTG (WHO) (các phương pháp, quy trình, kỹ thuật kiểm định vắc xin) - Tiếp cận, tìm hiểu sở sản xuất vắc xin, phương pháp kiểm định sản xuất - Tiến hành nghiên cứu theo mục tiêu đề tài, làm thử nghiệm cần thiết theo chuyên đề nghiên cứu - Giải thích đưa giải pháp khắc phục vấn đề vướng mắc, khó khăn quy trình kiểm định vắc xin cúm Việt nam - Đề xuất quy trình kiểm định vắc xin cúm đạt tiêu chuẩn WHO, phù hợp với điều kiện nước ta + Dự kiến địa điểm tiến hành làm nghiên cứu: + Viện kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế + Công ty vắcxin sinh phẩm số Kế hoạch: 5.2.1 Chuẩn bị vật liệu cho nghiên cứu - Vắc xin chứa chủng virus cúm mẫu chuẩn - Vắc xin cúm chọn làm thử nghiệm - Trứng gà cú phụi 10 - 11 ngày 25 - Chuột nhắt trắng, chuột lang; thỏ trưởng thành - Dung dịch hồng cầu gà - Các môi trường thioglycolate, Tryp Soyabean Broth (TSB) - Nguyên vật liệu để làm kỹ thuật miễn dịch khuếch tán đơn (SRD): Kháng thể kháng HA cúm chuẩn, kháng nguyên HA cúm chuẩn, bể ổn nhiệt 60 ºC , tủ ấm 37 ºC, tủ mát 20 - 25 ºC, máy lắc, lị vi sóng - Bộ kit LAL test - Labo an toàn, mỏy siờu ly tâm lạnh, máy đo pH, máy phân tích hàm lượng protein micro, tủ lạnh loại - Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn, dung dịch đệm, mơi trường - Các dụng cụ phịng thí nghiệm 5.2.2 Kế hoạch kinh phí thực 5.2.2.1 Kế hoạch thực Thời gian 9/2010 10/2010 đến 10/2012 11/2012 - 12/2012 1/2013 - 5/2013 6/2013 – 10/2013 Cơng việc Thơng qua đề cương, hồn chỉnh đề cương Thực đề tài Tập hợp số liệu, tiến hành đánh giá, đề xuất quy trình chuẩn Viết luận văn Bảo vệ luận văn 5.2.2.2 Kinh phí thực Căn vào nhu cầu đáng thiết thực Viện kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế nờn định lựa chọn thực đề tài Vỡ vậy, đề xuất đồng ý‎ tài trợ kinh phí nghiên cứu từ Viện 5.3 Phương pháp nghiên cứu: - Nghiên cứu tiến cứu - Thực nghiệm phịng thí nghiệm 26 5.3.1 Phương pháp pha chế thuốc thử dung dịch chuẩn - Tùy theo loại thuốc thử dung dịch chuẩn 5.3.2 Phương pháp giám sát vi sinh, thiết bị điều kiện kiểm định - Tiến hành kiểm tra trang thiết bị, hóa chất điều kiện cho kiểm định bao gồm tủ cấy vô trùng, phòng kiểm định nhân 5.3.3 Phương pháp kiểm tra tính chất sinh học 5.3.3.1 Kiểm tra vơ khuẩn Cấy trực tiếp 2ml vắc xin vào môi trường thioglycolate / 30-35ºC Soyabean / 20 - 25ºC, theo dõi 14 ngày Trong suốt thời gian theo dõi tồn ống mơi trường phải suốt, khơng màu thị màu 5.3.3.2 Kiểm tra an toàn chung Tiến hành chuột nhắt chuột lang + Chuột nhắt tuần tuổi, khơng có biểu bệnh lý‎, tăng trọng bình thường thời gian cách ly ngày Tiờm 0,5 ml vào phúc mạc cho theo dõi ngày Thử nghiệm đạt yêu cầu chuột khỏe mạnh, biểu bệnh lý‎, tăng trọng bình thường + Chuột lang cân nặng 300 - 350g, khơng có biểu bệnh lý‎, tăng trọng bình thường thời gian cách ly ngày Cách tiến hành đánh giá tương tự 5.3.3.3 Kiểm tra chất gõy sốt Mỗi loạt bán thành phẩm cuối phải kiểm tra chất gây sốt thỏ trưởng thành + Thỏ: Cân nặng 1,5 kg, nhiệt độ ≤ 39,8ºC, cách ly ngày nhiệt độ 20 - 25ºC + Dụng cụ: Nhiệt kế chia độ tới 0,1ºC, bơm tiờm vô trùng 27 Không cho thỏ ăn mà cho uống nước vòng 16 h trước tiêm Đo nhiệt độ ban đầu thỏ trước tiêm 15’ Tiêm mẫu thử nghiệm vào tĩnh mạch tai thỏ, liều tiêm 1ml mẫu thử / kg trọng lượng Theo dõi nhiệt độ lần h, cách không 60’ Nhiệt độ cao thỏ ghi nhận h sau tiêm coi nhiệt độ tối đa Hiệu số nhiệt độ ban đầu nhiệt độ tối đa coi có phản ứng Hiệu số âm tính phản ứng đọc 5.3.3.4 Kiểm tra công hiệu: Năm 1979 WHO khuyến cáo áp dụng kỹ thuật miễn dịch khuếch tán đơn (SRD), triển khai Việt nam Là phương pháp sử dụng cho việc xác định hàm lượng kháng nguyên HA (Haemagglutinin antigen) vắc xin cúm + Nguyên lý: Kháng ngun hịa tan từ lỗ hình trịn khuếch tán xung quanh cách đặn vào lớp gel thạch có độ dày định chứa kháng thể tương ứng Sự tiếp xúc KN - KT tương ứng tạo vịng tủa hình trịn, diện tích hình trịn tủa tỷ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên 3.4 Phương pháp kiểm định thành phần hóa học vắc xin 5.3.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein chuẩn (Phương pháp Lowry) + Nguyên lý: Protein vắc xin tủa axit tricloaxetic định lượng theo phương pháp Lowry Các dung dịch protein chuẩn albumin bũ cú nồng độ 25, 50,100,150 àg/ml Đo mật độ quang bước sóng 750 nm + Đánh giá: Theo tiêu chuẩn WHO hàm lượng protein không lần hàm lượng Haemagglutinin tổng, không 200 àg protein chủng virus không tổng 600 àg protein/ml (vắc xin cúm) 28 5.3.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng chất bảo quản thimerosal + Nguyên lý: Dựa sở thimerosal phản ứng với dithizon tạo thành hợp chất có độ hấp phụ cực đại bước sóng 480 nm + Đánh giá: Không àg thimerosal/ml (vắc xin cúm) 5.3.4.3 Phương pháp xác định formaldehyt tồn dư + Nguyên lý: Định lượng cách đo cường độ màu 3,5-diaxetyl, 4dihydrothidin bước sóng 415 nm Phức hợp tạo thành phản ứng formaldehyt với axetylaxeton + Đánh giá: Không 100 àg/ml (vắc xin cúm) 5.3.4.4 Phương pháp xác định hàm lượng nhôm Al(OH)3 + Nguyên lý: Được xác định cách đo màu phản ứng với stilbazơ Phản ứng làm cho muối nhơm khơng tan có mẫu thử làm tan hồn tồn + Đánh giá: Khơng q 1,25 mg/ml (vắc xin cúm) 5.3.5 Phương pháp chuẩn hóa thử nghiệm hiệu lực vắc xin Chuẩn hóa có nghĩa bao gồm phương pháp tiến hành để kết nhận so sánh cách tồn diện thời gian địa điểm Ví dụ: so sánh kết số thử nghiệm phịng thí nghiệm, tiến hành vào thời gian khác so sánh kết số thử nghiệm thực phòng thí nghiệm khác Để so sánh kết đó, điều quan trọng phải chuẩn hóa tồn dụng cụ, chế phẩm hóa chất kể sinh phẩm chuẩn Đồng thời toàn thử nghiệm phải tiến hành theo qui trình chuẩn (SOP) Mẫu vắc xin thử cần xét nghiệm song song với chế phẩm chuẩn điều chỉnh phù hợp với tiêu chuẩn quốc tế chế phẩm chuẩn quốc tế 29 5.4 Dự kiến kết - Đánh giá kết quả: + Theo lô, loạt vắc xin thử nghiệm + Theo chuyên đề nghiên cứu - Thông qua tất hoạt động nghiên cứu: + Đánh giá quy trình kiểm định vắc xin cúm + Đề xuất quy trình kiểm định chuẩn 5.5 Dự kiến bàn luận Bàn luận theo kết nghiên cứu DỰ KIẾN VIỆC LÀM VÀ CÁC NGHIÊN CỨU TIẾP THEO SAU KHI TỐT NGHIỆP Với mục đích xây dựng quy trình kiểm định chuẩn (Chuẩn hóa quy trình kiểm định vắc xin cúm Việt nam) đề tài thực hiện, hoàn thành thu kết có giá trị, tơi mong muốn ứng dụng sớm tốt Điều giúp cho cơng tác kiểm định vắc xin cỳm cú quy trình kiểm định đạt tiêu chuẩn, rõ ràng, khắc phục khó khăn, vướng mắc Cũng chớnh vậy, kiểm soát chặt chẽ chất lượng loại vắc xin cúm sản xuất nước vắc xin ngoại nhập, giảm tối đa rủi ro đáng tiếc cho người cần sử dụng vắc xin Nếu phép có điều kiện tơi trực tiếp đem kết đề tài áp dụng sở sản xuất kiểm định vắc xin, qua đú cú thờm kinh nghiệm thực tế sản xuất, kiểm định vắc xin cúm loại vắc xin khác Đồng thời tơi có kiến thức đầy đủ hơn, sâu sắc lĩnh vực nghiên cứu sản xuất kiểm định vắc xin Và nữa, mong muốn tham gia vào nghiờn cứu lĩnh vực 30 ĐỀ XUẤT NGƯỜI HƯỚNG DẪN Với lũng kớnh trọng, xin phép mời PGS.TS Lê Văn Phủng, Chủ nhiệm Bộ môn Vi sinh, ĐHYHN, làm Thầy hướng dẫn cho tơi 31 MỤC LỤC Lí DO LỰA CHỌN LĨNH VỰC, ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU 1.1 Lựa chọn lĩnh vực nghiên cứu: .1 1.2 Lý‎ lựa chọn đề tài 2 MỤC TIÊU VÀ MONG MUỐN ĐẠT ĐƯỢC KHI ĐĂNG KÝ ĐI HỌC NGHIÊN CỨU SINH Lí DO LỰA CHỌN CƠ SỞ ĐÀO TẠO KINH NGHIỆM, KIẾN THỨC, SỰ CHUẨN BỊ TRONG VẤN ĐỀ DỰ ĐỊNH NGHIÊN CỨU .5 4.1 Bệnh cúm 4.2 Virus cúm 4.2.1 Cấu trúc 4.2.2 Các tý‎p virus cúm [11]: 4.2.3 Chủng virus (strains) 4.2.4 Sự biến đổi virus cúm 4.2.5 Cúm A lây từ động vật sang người 10 4.3 Vắc xin cúm 11 4.3.1 Vắc xin 11 4.3.1.1 Cơ chế hoạt động vắc xin 11 4.3.1.2 Ba loại vắc xin kinh điển 11 4.3.1.3 Một số loại vắc xin nghiên cứu .12 4.3.1.4 Tai biến dùng vắc xin 13 4.3.2 Vắc xin cúm 14 4.3.2.1 Các loại vắc xin cúm: 14 4.3.2.2 Sản xuất vắc xin cúm: .15 4.4 Kiểm định vắc xin 18 4.4.1 Yêu cầu chung 18 4.4.2 Kiểm tra tính chất sinh học 19 4.4.3 Kiểm tra lý‎ hóa học 20 4.4.4 Kiểm định đánh giá chất lượng vắc xin cúm theo khuyến cáo WHO [18], [19], [20] 20 4.4.5 Ý nghĩa thành phần hóa học vắc xin vấn đề kiểm định 22 4.4.6 Kiểm tra trình sản xuất .22 4.4.7 Một số kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng nghiên cứu 23 4.4.5.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 23 4.4.5.2 Kỹ thuật xác định trình tự nucleotit .23 4.4.5.3 Phân tích protein kỹ thuật điện di biến tính gel polyacrylamid (SDSPAGE) 24 NHỮNG DỰ ĐỊNH VÀ KẾ HOẠCH 25 5.1 Dự định 25 Kế hoạch: .25 5.2.1 Chuẩn bị vật liệu cho nghiên cứu 25 5.2.2 Kế hoạch kinh phí thực .26 5.2.2.1 Kế hoạch thực 26 5.2.2.2 Kinh phí thực 26 5.3 Phương pháp nghiên cứu: .26 Nghiên cứu tiến cứu .26 5.3.1 Phương pháp pha chế thuốc thử dung dịch chuẩn .27 5.3.2 Phương pháp giám sát vi sinh, thiết bị điều kiện kiểm định .27 5.3.3 Phương pháp kiểm tra tính chất sinh học 27 5.3.3.1 Kiểm tra vô khuẩn 27 5.3.3.2 Kiểm tra an toàn chung 27 5.3.3.3 Kiểm tra chất gõy sốt 27 5.3.3.4 Kiểm tra công hiệu: 28 3.4 Phương pháp kiểm định thành phần hóa học vắc xin 28 5.3.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein chuẩn (Phương pháp Lowry) .28 5.3.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng chất bảo quản thimerosal 29 5.3.4.3 Phương pháp xác định formaldehyt tồn dư .29 5.3.4.4 Phương pháp xác định hàm lượng nhôm Al(OH)3 29 5.3.5 Phương pháp chuẩn hóa thử nghiệm hiệu lực vắc xin 29 5.4 Dự kiến kết .30 5.5 Dự kiến bàn luận 30 DỰ KIẾN VIỆC LÀM VÀ CÁC NGHIÊN CỨU TIẾP THEO SAU KHI TỐT NGHIỆP .30 ĐỀ XUẤT NGƯỜI HƯỚNG DẪN .31 ... dựng quy trình kiểm định chuẩn (Chuẩn hóa quy trình kiểm định vắc xin cúm Việt nam) đề tài thực hiện, hoàn thành thu kết có giá trị, mong muốn ứng dụng sớm tốt Điều giúp cho cơng tác kiểm định vắc. .. khăn quy trình kiểm định vắc xin cúm Việt nam - Đề xuất quy trình kiểm định vắc xin cúm đạt tiêu chuẩn WHO, phù hợp với điều kiện nước ta + Dự kiến địa điểm tiến hành làm nghiên cứu: + Viện kiểm. .. trình kiểm định vắc xin cúm 2) Đề xuất quy trình kiểm định chuẩn Lí DO LỰA CHỌN CƠ SỞ ĐÀO TẠO Qua tìm hiểu tơi biết: Viện kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế Bộ Y tế, sở định Chính phủ,