Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương BÀI 10 : PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ COLIFORM I XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ 1.1 Mơi trường hố chất - Mơi trường sử dụng Plate Count Agar (PCA) có pH 7,0 ÷ 0,2 Mơi trường pha chế , phân phối vào bình thuỷ tinh hay ống nghiệm hấp khử trùng 1210C 15 phút Các bình ống nghiệm chứa mơi trường chưa sử dụng bảo quản tủ lạnh 2-80C Trước sử dụng môi trường phải đun chảy làm nguội 450C bể điều nhiệt Ngồi mơi trường trên, cịn sử dụng mơi trường khác Tryptose Glucose Agar, Nutrient Agar - Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Pepton Water) dùng pha loãng chứa 8,5g NaCl 1g pepton 100ml nước Dung dịch chứa bình chứa 0,5-1,0 lít, hấp khử trùng phân phối thành thể tích xác 9ml vào ống nghiệm vơ trùng 1.2 Quy trình phân tích 1.2.1 Chuẩn bị mẫu nước trước phân tích Trước tiến hành phân tích, thực việc đồng mẫu sau : mẫu dạng rắn dùng dụng cụ kéo, kẹp khử trùng cân xác 10g (hay 25g) mẫu vào bao PE Tất thao tác cần phải tiến hành điều kiện vô trùng Thêm vào lượng mẫu 90ml (hay 225ml) dung dịch pha loãng SPW Thực đồng mẫu máy dập mẫu (stomacher) Thời gian dập mẫu phụ thuộc vào tính chất lý mẫu, khơng q 2,5 phút Trong trường hợp khơng có máy dập mẫu thực thao tác đồng mẫu sau : xát nhuyễn mẫu điều kiện vơ trùng Cân xác điều kiện vô trùng (225ml) nước SPW hấp khử trùng Lắc thời gian định (ít phút) Đối với mẫu dạng lỏng, hút 10ml (hoặc 25ml) cho vào bình tam giác chứa 90ml (hay 225ml) nước SPW hấp khử trùng, lắc Sau làm đồng phương pháp trên, dung dịch mẫu thu có độ pha lỗng 10 lần so với ban đầu Dịch mẫu đồng tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân cách dùng pipet vơ trùng (hoặc pipetman với đầu típ vơ trùng) chuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng Trộn mẫu ống nghiệm cho đồng máy rung (vortex) hay dùng pipet hút đảo dịch mẫu 89 Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương lên xuống 5-10 lần Dung dịch mẫu có độ pha lỗng 10-2 Sau sử dụng pipet pipetman có đầu tip chuyển 1ml dịch mâũ vào ống nghiệm thứ chứa dung dịch pha lỗng thao tác tương tự để có dịch mẫu với độ pha loãng 10-3 Tiếp tục thực tương tự để có độ pha lỗng thập phân theo độ pha loãng cần thiết Lưu ý pipet đầu tip pipetman nguy bị nhiễm q trình thao tác (chạm tay, chạm mặt ngồi ống nghiệm, mặt ngồi bình chứa ), cần phải thay pipet đầu tip vô trùng khác 1.2.2 Cấy mẫu Chọn hay độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa 25-250 tế bào vi sinh vật 1ml để cấy lên đĩa petri Dùng pipet vô trùng pipetman với đầu típ vơ trùng chuyển 1ml dịch mẫu pha lỗng chọn vào đĩa petri vơ trùng Tương ứng với độ pha lỗng cấy 2-3 đĩa (tức thực 2-3 lần lặp lại) Sau cấy đổ vào đĩa 10-15 ml môi trường PCA đun chảy ổn định 450C Trộn dịch mẫu với môi trường cách xoay trịn đĩa petri xi ngược chiều kim đồng hồ, chiều 3-5 lần sau đổ môi trường Đặt đĩa mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc Lật ngược ủ đĩa tủ ấm nhiệt độ 30 ÷10oC 72 Nhiệt độ thời gian ủ thay đổi theo quy định tiêu chuẩn 1.2.3 Cách tính kết Đếm tất số khuẩn lạc xuất đĩa sau ủ Chọn đĩa có số đếm từ 25-250 để tính kết Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí 1g hay 1ml mẫu tính sau : A (CFU/g hay CFU/ml) = N n1Vf1 + + nVf i i Trong : A : số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn 1g hay 1ml mẫu N : tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn Ni : số lượng đĩa cấy độ pha lỗng thứ i V : thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào đĩa Fi : độ pha loãng tương ứng Ví dụ : trường hợp phân tích 1g mẫu cụ thể nhận kết sau : 10-3 10-4 Nồng độ pha loãng Kết Đĩa 235 26 Đĩa 246 21 A= 235 + 246 + 26 = 2,4 x105(CFU/g) x1x0, 001 + 1x1x0, 0001 90 Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương Các kết tổng số vi khuẩn hiếu khí thường biểu diễn dạng số mũ số thập phân Trường hợp có khuẩn lạc vi sinh vật mọc loang, vết loang tính khuẩn lạc Nếu số khuẩn lạc chiếm 1/3 đĩa phải ghi nhận điều đánh dấu kết nhận Nếu độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm đĩa > 250, ví dụ nồng độ 10-5 số đếm lớn 250, kết ghi : >2,5 x107 CFU/g Nếu độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm đĩa < 25, ví dụ nồng độ 10-1 số đếm nhỏ 25, kết ghi : < 2,5 x 102 CFU/g Quy trình định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí thực phẩm tóm tắt Chøn bë dëch âäưng nháút hồûc pha long máùu âãø cọ âäü pha long 10-1, 10-2, 10-3 Chn näưng âäü pha long thêch håüp, chuøn 1ml máùu vo âéa petri vä trng (mäùi näưng âäü cáúy âéa) Rọt vo mäùi âéa 10-15ml mäi trỉåìng PCA â âỉåüc lm ngüi âãún 450C, làõc cho máùu phán tạn âãưu vo mäi trỉåìng , åí 300C 72 giåì Chn cạc âéa cọ säú khøn lảc khong 25-250 khøn lảc /âéa âãø âãúm Tênh kãút quaí : täøng vi sinh váût hiãúu khê máùu (CFU/g hoàûc CFU/ml) II 2.1 COLIFORMS VÀ ESCHERICHIA COLI Định nghĩa Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân E.coli - Coliforms trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí kỵ khí tuỳ ý , có khả lên men lactose sinh acid sinh 37oC 2448 Trong thực tế phân tích, Coliforms cịn định nghĩa vi khuẩn có khả lên men sinh khoảng 48 ủ 37oC môi trường canh Lauryl Sulphate canh Brilliant Green Lactose Bile Salt Nhóm 91 Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương Coliforms xem nhóm vi sinh vật thị : số lượng diện chúng thực phẩm, nước hay loại mẫu môi trường dùng để thị khả diện vi sinh vật gây bệnh khác Nhiều nghiên cứu cho thấy số Coliforms thực phẩm cao khả diện vi sinh vật gây bệnh khác cao Tuy nhiên mối quan hệ vi sinh vật gây bệnh vi sinh vật thị cịn nhiều tranh cãi Nhóm Coliforms gồm giống : Escherichia với loài E coli, Citrobacter, Klebsiella Enterobacter Tính chất sinh hố đặc trưng nhóm thể qua thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) Citrate (iC) thường gọi tóm tắt chung IMViC - Coliforms chịu nhiệt Coliforms có khả lên men lactose sinh khoảng thời gian 24 ủ 44oC môi trường canh EC - Coliforms phân (Faeceal Coliforms hay E coli giả định) Coliforms chịu nhiệt có khả sinh indole ủ khoảng 24 44,5oC canh Trypton Coliforms phân thành phần hệ vi sinh ruột đường người động vật máu nóng khác sử dụng để thị mức độ vệ sinh trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống để thị ô nhiễm mẫu môi trường - E coli Coliforms phân cho kết thử nghiệm IMViC ++ (Indol +, Methyl Red +, Voges-Proskauer -, Citrate -) 2.2 Định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân E coli phương pháp MPN 2.2.1 Nguyên tắc : Số lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân E coli mẫu nước, thực phẩm chứa mật độ thấp nhóm vi khuẩn xác định phương pháp MPN (Most Probale Number) Phương pháp dựa vào nguyên tắc mẫu pha loãng thành dãy thập phân (hai nồng độ khác 10 lần); mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp ủ ống nghiệm chứa mơi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham Mỗi nồng độ pha loãng ủ từ đến ống lặp lại Theo dõi sinh đổi màu để định tính diện ống thử nghiệm ; ống dương tính Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính nồng độ pha lỗng dựa vào bảng MPN để suy số lượng vi sinh vật tương ứng diện 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu 92 Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương 2.2.2 Mơi trường hố chất - Mơi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate) - Môi trường lỏng Brilliant Green Lactoase Bila Salt (canh BGBL) - Môi trường lỏng E coli (E coli medium, canh EC) Các môi trường lỏng chuẩn bị ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược Sau khử trùng, thị sử dụng ống nghiệm khơng có bọt khí bên ống Durham - Canh Tryptone - Môi trường rắn Simmon Citrate Agar (Thạch simmon Citrate) - Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Pepton Water) - Thuốc khử Kovac’s - Canh MR-VP - Thuốc thử Methyl Red - Thuốc thử a-napthol 2.2.3 Quy trình phân tích Chuẩn bị đồng mẫu pha loãng mẫu để có dịch mẫu có độ pha lỗng -1 10 a Định lượng Coliforms Tuần tự cấy 1ml dịch mẫu pha loãng 10-1 vào ống nghiệm giống nhau, ống chứa 10ml canh LSB Thực tương tự với dịch mẫu pha loãng 10-2 10-3 Đây trường hợp xác định MPN hệ số độ nồng độ ống nghiệm lặp lại (hệ x hay ống nghiệm) Nếu nghi ngờ số lượng Coliforms mẫu cao, phải sử dụng mẫu có độ pha lỗng cao Ủ ống nghiệm 370C 48 Ghi nhận : ống có sinh Dùng que cấy vịng (khun cấy) cấy chuyển dịch mẫu ống LSB (+) sang ống chứa canh BGBL ủ 370C 48 Ghi nhận số ống cho kết (+) (có sinh hơi) ứng với pha loãng b Định lượng Coliforms chịu nhiệt Dùng que cấy vòng chuyển vòng dịch mẫu từ ống canh LSB sang môi trường canh EC, ủ 44,50C ± 0,20C 24 Đếm số lượng ống cho kết (+) (sinh hơi) độ pha loãng c Định lượng Coliforms phân Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ ống (+) môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB Ủ đĩa 370C 24 Các khuẩn lạc trịn, dẹt hình đĩa có ánh kim tím khuẩn lạc Coliforms phân hay E coli giả định Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn1mm cấy vào canh Trypton, 93 Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương ủ 44,5 ± 0,2oC 24 Nhỏ thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm Ống nghiệm có xuất màu đỏ môi trường vài phút ống (+) Thực tương tự cho ống (-) môi trường EC Ghi nhận số lượng ống cho kết (+) môi trường Trypton tương ứng với độ pha loãng d Định lượng E.coli Trước tiên thực tương tự trường hợp định lượng Coliforms phân Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ ống (+) môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB Ủ đĩa 370C 24 để tìm khuẩn lạc E coli giả định (trịn, dẹt hình đĩa có ánh kim tím) Chọn khuẩn lạc đường kính lớn 1mm câý vào môi trường MRVP, Simmom Citrate Aga để thực thử nghiệm IMViC Khuẩn lạc E.coli giả định cho kết thử nghiệm IMViC ++ E coli Ống nghiệm cho kết (+) môi trường EC khuẩn lạc E.coli giả định môi trường EMB cho kết thử nghiệm IMViC ống nghiệm E.coli (+) Thực tương tự cho tất ống nghiệm cho kết qủa (+) môi trường EC tạo khuẩn lạc E.coli giả định môi trường EMB Ghi nhận số lượng ống nghiệm có E.coli (+) độ pha loãng mẫu 2.2.4 Cách đọc kết Ở tất trường hợp nêu trên, từ số lượng ống nghiệm có E.coli (+) độ pha lỗng mẫu dùng bảng MPN thích hợp (bảng 3x3 tức ống nghiệm) để tính mật độ vi sinh vật mẫu biểu diễn dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng 2.3 Định lượng Coliforms, Coliforms phân phương pháp đếm khuẩn lạc 2.3.1 Nguyên tắc Mẫu đồng hố cấy lượng định lên mơi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose Đếm số khuẩn lạc lên men lactose sinh acid sau ủ 37± 10C 24-48 Ngồi lactose mơi trường chọn lọc cho Coliforms chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương chất thị pH neutra red, crystal violet Trên môi trường khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính lớn 0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa muối mật Việc khẳng định thực cách nuôi cấy môi trường canh chọn lọc BGBL Để định lượng Coliforms phân, thực tương tự thay đổi nhiệt độ ủ 440C Mật độ Coliforms hay Coliforms phân tính dựa số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỷ lệ khẳng định độ pha loãng mẫu trước cấy vào đĩa 94 Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương Để phát phận tế bào Coliforms bị tổn thương hay bị giảm sức sống trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, phận khơng tăng trưởng mơi trường chọn lọc, trước tiên mẫu cấy vào môi trường không chọn lọc TSA, trước bổ sung mơi trường chọn lọc 2.3.2 Mơi trường hố chất - Môi trường Trypton Soya Agar (TSA) chuẩn bị bình hay chai thuỷ tinh, hấp khử trùng bảo quản 4-80C Trước sử dụng môi trường đun chảy làm nguội 450C bể điều nhiệt - Violet Red Bile Agar (VRB) chuẩn bị chai thuỷ tinh, đun chảy làm nguội 450C bể điều nhiệt trước sử dụng Có thể sử dụng mơi trường Desoxycholate Agar thay cho VRB - Môi trường canh Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) phân phối 10ml vào ống nghiệm vô trùng chứa ống durham úp ngược Hấp khử trùng Sau hấp kiểm tra ống để đảm bảo khơng có bọt khí ống durham - Môi trường canh EC Broth chuẩn bị tương tự trường hợp môi trường BGBL - Môi trường canh Trypton Broth phân phối 5ml vào ống nghiệm hấp khử trùng - Thuốc thử Kovac’s hay Indol 2.3.3 Quy trình phân tích Mẫu đồng hố pha loãng tương tự phần định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí cho chứa