Chơng Kiểm nghiệm thuốc phơng pháp sinh học Mục tiêu học tập Viết đợc đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy vi khuẩn, nấm mốc, nấm men để áp dụng thử nghiệm vi sinh vật Biết phơng pháp làm môi trờng nuôi cấy vi sinh vật nêu đợc phơng pháp tiệt trùng Trình bày đợc mục đích, nguyên tắc, phơng pháp thử vô trùng ®Õm sè l−ỵng vi sinh vËt gam (1 ml) dợc phẩm Nêu đợc vai trò phơng pháp sinh học kiểm nghiệm chất kháng sinh, trình bày đợc thử nghiệm định lợng chất kháng sinh phơng pháp khuếch tán 4.1 Mở đầu Trong ngành Dợc có nhiều phơng pháp khác để kiểm tra chất lợng thuốc nh phơng pháp hoá học, phơng pháp vật lý, phơng pháp sinh học Phơng pháp hoá, lý tiến hành nhanh xác nhng áp dụng đợc với chất có thành phần hoá học đà biết không đánh giá đợc chất sinh học dợc phẩm Để xác định đặc tính sinh học theo yêu cầu số dợc phẩm nh: hoạt lực tác dụng chất kháng sinh, vô trùng, độ nhiễm khuẩn, độc tính bất thờng số loại thuốc, hay hiệu lực tính an toàn vaccin ngời ta phải dùng phơng pháp sinh học 4.1.1 Nguyên tắc Phơng pháp sinh học dựa nguyên tắc: So sánh hiệu lực tác dụng đặc tính riêng chất thử với chất chuẩn tơng ứng điều kiện thời gian thÝ nghiƯm Trong lÜnh vùc kiĨm nghiƯm thc, hai loại thử nghiệm sinh học đợc áp dụng nhiều là: Kiểm nghiệm thuốc phơng pháp thử động vật Kiểm nghiệm thuốc thử nghiƯm vi sinh vËt 115 4.1.2 ChÊt chn Trong thư nghiƯm sinh häc chÊt chn lµ mét u tè quan trọng để đánh giá chất lợng chất thử Chất chuẩn đợc chia làm hai loại: Chất chuẩn gốc: chất đồng có độ tinh khiết cao Chất chuẩn gốc thờng đợc làm viện nghiên cứu quốc gia quốc tế riêng chất chuẩn sinh häc − ChÊt chn thø cÊp: cịng lµ chÊt cã độ tinh khiết cao, có hoạt tính sinh học đợc xác định theo chất chuẩn gốc quốc tế tơng ứng Chất chuẩn phải đợc bảo quản ống thuỷ tinh nhiệt độ thích hợp tuỳ theo mẫu (thờng nhiệt độ < 5oC) điều kiện khô, tránh ánh sáng 4.1.3 Đánh giá kết Thử nghiệm sinh häc th−êng cã thêi gian thÝ nghiƯm kÐo dµi vµ phụ thuộc vào nhiều yếu tố nh tính chất đáp øng cđa sinh vËt thÝ nghiƯm, ng−êi lµm thÝ nghiƯm, điều kiện thử nghiệm Các yếu tố thờng không ổn định Vì kết thử nghiệm sinh học phải đợc đánh giá toán thống kê Độ xác phép thử đợc thể giới hạn tin cậy 4.2 Kiểm nghiệm thuốc phơng pháp thử động vật 4.2.1 Nguyên tắc Kiểm nghiệm thuốc phép thử động vật dựa ®¸p øng cđa ®éng vËt thÝ nghiƯm ®èi víi c¸c chế phẩm đợc đa vào thể liều lợng theo quy định thí nghiệm để đánh giá chất lợng chế phẩm cần thử 4.2.2 Động vật thí nghiệm Động vật dùng thí nghiệm phải đồng đều, khiết nòi giống, khoẻ mạnh không nhiễm bệnh, thai đợc nuôi dỡng đầy đủ Mỗi thí nghiệm có nhu cầu khác giống, trọng lợng, tuổi động vật Chất lợng động vật định độ xác phép thử 4.2.3 Thử in vivo in vitro Thử nghiệm đợc thực thể động vật sống gọi thử in vivo Ngời ta dựa thông số nh nhiệt độ thể, nhịp tim, điện tâm đồ, điện nÃo đồ, thay đổi huyết áp, phản xạ hệ thần kinh tỷ lệ sống, chết động vật thí nghiệm để đánh giá tác dụng chất lợng thuốc Phép thử đợc tiến hành quan cô lập động vật, nh tim, tử cung, ruột, máu gọi thử in vitro 116 4.2.4 Liều (Dose) Liều lợng chế phẩm thử đa vào thể động vật lần cho tõng mơc ®Ých thÝ nghiƯm VÝ dơ: LiỊu LD0, LD50, LD100, MLD, liều thử chất hạ áp, liều thử chất gây sốt 4.2.5 Các thử nghiệm động vật đợc áp dụng kiểm nghiệm thuốc Trong dợc điển thờng có thử nghiệm sau đợc thực phép thử động vật nh: Thử độc tính bất thờng Thử chất hạ huyết áp Thử chất gây sốt Định lợng hormon: gonadorelin, corticotrophin, insulin, oxytocin, menotrophin, − KiÓm tra tÝnh an toàn vaccin sinh phẩm Xác định hiệu lực vaccin antitoxin 4.3 Kiểm nghiệm thuốc phép thử vi sinh vật 4.3.1 Đại cơng vi sinh vật Vi sinh vật thể sống có kích thớc nhỏ mà mắt thờng nhìn thấy đợc Nếu cần quan sát hình dạng chúng phải dùng kính hiển vi Trong tự nhiên, vi sinh vật tồn phong phú đa dạng, chúng đóng vai trò tích cực vào vòng tuần hoàn vật chất Nhiều loại vi sinh vật đợc ứng dụng lĩnh vực y tế, công nghiệp, nông nghiệp nh vi sinh vật có khả lên men rợu, sinh tổng hợp kháng sinh, vitamin, acid amin, vi sinh vật cố định đạm thực vật Trong trình hoạt động sống, bên cạnh đặc tính có ích, vi sinh vật gây nhiều tác hại cho ngời, động vật, thực vật nh: làm biến đổi chất lợng thuốc, hỏng thực phẩm, số có khả gây bệnh sinh độc tố có hại Để phục vụ cho việc kiểm nghiệm thuốc thử nghiệm vi sinh vật, ta cần tìm hiểu số đặc điểm hai nhóm vi sinh vËt lµ vi khuÈn vµ vi nÊm 4.3.1.1 Vi khuÈn (Bacteria) ã Đặc điểm: Vi khuẩn vi sinh vật đơn bào có cấu tạo tế bào tiền nhân (Procaryote), có kích thớc nhỏ Đờng kính tế bào phần lớn thay đổi khoảng 0,2 2,0àm, chiều dài từ - 8àm Vi khuẩn có nhiều hình dạng khác nhau, nh hình cầu, hình que, xoắn, dấu phảy Vi khuẩn sinh sản vô tính, 117 số tạo bào tử Mỗi tế bào vi khuẩn có bào tử Một số vi khuẩn có khả di động nhờ có mặt nhiều lông (flagella) ã Phân loại: Việc phân loại vi khuẩn phức tạp, phải dựa vào nhiều đặc điểm, hình thái, sinh lý, sinh hoá để chia vi khuẩn thành họ, chi, loài khác Với mục đích phục vụ cho công tác kiểm nghiệm thuốc, ta không sâu vào nghiên cứu phân loại, nhng cần tìm hiểu vi khuẩn, theo nhóm dựa hình thể, tính chất bắt màu thuốc nhuộm Gram khả hô hấp chúng Theo hình thể: + Cầu khuẩn (Coccus): Vi khuẩn hình cầu đứng riêng rẽ (Micrococcus), thành đám (Staphylococcus), chuỗi (Streptococcus), hay xếp thành đôi (Diplococcus) + Trực khuẩn (Bacillus): Vi khuẩn hình que ngắn đứng riêng lẻ hay thành chuỗi (Bacillus anthracis) hình que hai đầu tròn (Escherichia coli) + Xoắn khuẩn (Spirillum): Vi khuẩn hình lò xo nh: Treponema Pallidum + PhÈy khuÈn (Vibrio): Vi khuÈn h×nh dÊu phẩy nh Vibrio cholerae Theo tính chất bắt màu thuèc nhuém Gram + Vi khuÈn cã mµu tÝm sau nhuém Gram: Vi khuÈn Gram + + Vi khuÈn có màu đỏ sau nhuộm Gram: Vi khuẩn Gram Theo đặc tính trình hô hấp: + Sử dụng oxy tự trình hô hấp: Vi khuẩn hiếu khí + Phát triển đợc điều kiện hiếu khí kỵ khí, có trình hô hấp nitrat: vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc + Chỉ sống điều kiện kỵ khí, có trình hô hấp sulfat: Vi khuẩn kỵ khí bắt buộc ã Sinh sản vi khuẩn: log N thời gian Hình 4.1: Đờng cong sinh tr−ëng cđa vi khn 118 − Vi khn sinh s¶n cách phân đôi tế bào Sự phân chia tế bào xảy nhanh Trong điều kiện môi trờng thích hợp yếu tố kìm hÃm tế bào vi khuẩn sau sinh 250.000 tế bào Tuy nhiên, nhân lên vi khuẩn vô tận, phụ thuộc vào nhiều yếu tố Trong môi trờng nuôi cấy, sinh sản vi khuẩn sau thời gian định bị ngừng lại nhiều nguyên nhân nh: thức ăn bị hết dần, vi khuẩn tiết chất kìm hÃm phát triển chúng Tốc độ phát triển cđa vi khn m«i tr−êng nu«i cÊy tÜnh thay đổi theo thời gian tuân theo quy luật định bao gồm pha: Pha lag, pha logarit, pha ổn định pha tử vong (Hình 4.1) Sự phát triển vi khuẩn môi trờng lỏng quan sát sau khoảng 18 - 24 nuôi cấy Chúng làm đục môi trờng, tạo váng bề mặt lắng cặn đáy ống nghiệm Trên môi trờng đặc, khuẩn lạc vi khuẩn thờng nhỏ khuẩn lạc vi nấm, bề mặt nhẵn, bóng, ớt nhăn nheo, Khuẩn lạc vi khuẩn tạo sắc tố với màu nh: trắng (Staphylococcus albus), vàng (Staphylococcus aureus), hồng (Micrococcus), xanh (Pseudomonas aeruginosa), Mỗi vi khuẩn có đặc tính riêng hình dạng, kích thớc, màu sắc khuẩn lạc Các đặc tính giúp cho việc xác định vi khuẩn trình kiểm nghiệm dợc phẩm 4.3.1.2 Vi nấm (Microfungi) ã Đặc điểm: Vi nấm có cấu tạo tế bào nhân thật (Eucaryote) Tế bào vi nấm nhỏ Muốn quan sát cần dùng kính hiển vi Nấm chất diệp lục, sống hoại sinh ký sinh, sinh sản vô tính hữu tính Vi nấm bao gồm hai loại nấm men nấm mốc Trong kiểm nghiệm vi sinh vật, cần phát hai loại có dợc phẩm ã Nấm men (Yeast): Nấm men có cấu tạo đơn bào, sinh sản chđ u b»ng nÈy chåi TÕ bµo nÊm men cã kích thớc, hình dạng khác tuỳ loài Chúng hình cầu, bầu dục, hình chanh, hình ống Khuẩn lạc nấm men bao gồm nhiều cá thể thờng thuộc loài phát triển từ cá thể mẹ tạo thành khối Khuẩn lạc nấm men thờng to khuẩn lạc vi khuẩn, bề mặt có nếp nhăn trơn nhẵn, không tạo sợi Nấm men đợc sử dụng nhiều công nghiệp thực phẩm nh làm bánh mỳ, bia, rợu Nhng nhiều nấm men gây bệnh làm hỏng thực phẩm, thuốc 119 ã Nấm mốc (Mold): Nấm mốc có cấu tạo sợi, sinh sản bào tử, sống hoại sinh, chúng thờng phát triển bề mặt chất dới dạng lớp hình sợi, mạng nhện khối sợi Sợi nấm nhỏ, đờng kính trung bình 5àm, chiều dài vài chục centimet Sợi nấm có vách ngăn vách ngăn Toàn sợi nấm nhánh phát triển từ bào tử nấm đan kết thành khối gọi hệ sợi nấm Trên môi trờng thạch nuôi cấy, hệ sợi nấm phát triển thành khối có tiết diện hình tròn gần tròn gọi khuẩn lạc Khuẩn lạc đợc đặc trng màu sắc sợi nấm bào tử Bề mặt khuẩn lạc mợt, dạng hạt, dạng sợi xốp Nấm sinh sản bào tử: Bào tử vô tính bào tử hữu tính Sự sinh sản vô tính hữu tính đan kết trình sinh trởng nấm Vì vậy, nấm phát triển nhanh bề mặt chất Nấm mốc thờng gây biến đổi màu sắc, mùi vị, chất lợng thuốc Một số sinh độc tố (Mycotoxin) có hại cho ngời động vật 4.3.1.3 Sự ảnh hởng yếu tố ngoại cảnh trình phát triển vi sinh vật Sinh trởng trao đổi chất vi sinh vật liên quan chặt chẽ đến điều kiện môi trờng bên Các điều kiện bao gồm hàng loạt yếu tố khác nhau, tác động qua lại với Đa số yếu tố có đặc tính tác dụng chung biểu điểm hoạt động: Tối thiểu, tối u, cực đại Khi yếu tố có tác dụng tối u, vi sinh vật phát triển với tốc độ cực đại Nếu yếu tố có tác dụng cực đại , vi sinh vật ngừng sinh trởng thờng chết Các yếu tố bên có ảnh hởng đến đời sống vi sinh vật vật lý, hoá học sinh học, yếu tố vật lý đáng ý Yếu tố vật lý bao gồm nhiệt độ, độ ẩm ánh sáng: ã Nhiệt độ: Nhiệt độ yếu tố quan trọng đời sống vi sinh vật Mỗi loài vi sinh vật có giới hạn nhiệt độ phát triển thích hợp Nói chung vi sinh vật, nhiệt ®é ph¸t triĨn th−êng tõ 15 – 45oC ë nhiƯt độ cao làm thay đổi trình trao đổi chÊt cđa vi sinh vËt, vi sinh vËt bÞ chÕt Các tế bào sinh dỡng thờng bị chết nhiệt độ 60oC/20 - 30 phút Các bào tử bị tiêu diệt nhiệt độ 120oC/ 30 40 phút Tính chất đợc ứng dụng việc tiệt trùng Nhiệt độ thấp có tác dụng kìm hÃm ph¸t triĨn cđa vi sinh vËt (trõ vi sinh vËt a lạnh) 120 ã Độ ẩm: Hầu hết trình sống vi sinh vật có liên quan đến nớc Khi thiếu nớc xảy tợng loại nớc khỏi tế bào vi sinh vật, trao đổi chất bị giảm, tế bào chết Vì vậy, để bảo quản dợc phẩm, dợc liệu tránh khỏi tác động vi sinh vật cần có giới hạn độ ẩm định ã ánh sáng: ánh sáng mặt trời gồm tia bøc x¹ nh−: tia tư ngo¹i, hång ngo¹i, tia gamma có tác dụng phá huỷ tế bào vi sinh vật, đặc biệt tia tử ngoại Bức xạ UV bớc sóng khoảng 260nm, có tác dụng diệt khuẩn mạnh nhÊt D−íi ¶nh h−ëng cđa tia UV, vi sinh vËt bị chết đột biến tuỳ theo liều lợng Để ngăn ngừa tác hại vi sinh vật thuốc tác nhân vật lý cần đợc vận dụng trình sản xuất bảo quản dợc phẩm, nhằm hạn chế tối đa số lợng vi sinh vật gây nhiễm ban đầu Đồng thời chế phẩm dợc phải đợc quy định giới hạn vi sinh vật cho phÐp 4.3.2 M«i tr−êng nu«i cÊy vi sinh vËt Môi trờng nuôi cấy chất dinh dỡng thích hợp nhằm đảm bảo cho vi sinh vật sinh trởng phát triển Môi trờng cần có điều kiện sau: Đầy đủ chất dinh dỡng theo yêu cầu thí nghiệm, có pH khoảng quy định phải vô trùng Môi trờng gồm loại: Môi trờng tự nhiên: nguyên liệu có nguồn gốc từ động vật hay thùc vËt (nh− cao thÞt, cao men, pepton, tinh bét…) Thành phần thay đổi tuỳ theo nguồn gốc nguyên liệu Môi trờng tổng hợp: bao gồm hoá chất khiết đà đợc quy định thờng hoà tan nớc Môi trờng bán tổng hợp: thành phần môi trờng có nguyên liệu tự nhiên tổng hợp Pha chế môi trờng khâu quan trọng thí nghiệm vi sinh vật Độ xác kết thí nghiệm phụ thuộc nhiều vào chất lợng môi trờng 4.3.2.1 Phơng pháp pha chế môi trờng Khi pha chế môi trờng cần tiến hành qua bớc sau: ã Chuẩn bị dụng cụ hoá chất: Dụng cụ pha chế môi trờng tốt men thuỷ tinh Các dụng cụ phải rửa sạch, tiệt trùng nóng trớc sử dụng 121 Nguyên liệu pha chế môi trờng phải đảm bảo chất lợng, hoá chất phải tinh khiết Nếu dạng bột tinh thể phải khô, không đổi màu, không chảy nớc ã Cân đong nguyên liệu: Các nguyên liệu phải đợc cân đong xác, hoá chất nguyên tố vi lợng gây ức chế vi khuẩn (muối mật, sắt) phải đợc cân cân phân tích ã Hoà tan nguyên liệu: Thờng dùng nớc cất nớc khử khoáng để pha môi trờng Các hoá chất đợc hoà tan nóng lạnh tuỳ theo tính chất chúng Môi trờng thạch nên hoà tan lạnh nóng nhẹ Môi trờng có thạch cần đun cho thạch tan hoàn toàn sau cho thành phần khác vào ã Điều chỉnh pH: Khi điều chỉnh pH môi trờng nên thực nhiệt độ 45 - 50oC để pH bị thay đổi sau tiệt trùng Các dung dịch NaOH 1N HCl 1N thờng ®−ỵc sư dơng ®Ĩ ®iỊu chØnh pH Sau ®iỊu chỉnh pH, cần bổ sung nớc cho đủ thể tích quy định ã Làm môi trờng Các môi trờng lỏng (bao gồm chất hoà tan) phải để dƠ quan s¸t sù ph¸t triĨn cđa vi sinh vËt Sau hoà tan chất, môi trờng đục cần phải lọc qua vải gạc giấy ã Đóng ống tiệt trùng: Môi trờng đợc cho vào ống nghiệm bình nón bình cầu, tuỳ theo yêu cầu thí nghiệm Khi đóng ống, không đợc để môi trờng dính vào miệng ống bình Môi trờng cần phải đợc tiệt trùng sau đóng gói Nếu để lâu, tạp khuẩn phát triển làm hỏng môi trờng Các môi trờng thông thờng đợc tiệt trùng 110oC/30 phút 120oC/ 20 phút Môi trờng có chất dễ bị phá huỷ nhiệt, cần tiệt trùng nhiệt độ thấp phơng pháp Tyndall, Pasteur, dùng lọc vi khuẩn Môi trờng đợc lấy khỏi nồi hấp sau tiệt trùng xong Nếu để lâu nồi hấp môi trờng bị chuyển màu giảm chất lợng Pha chế môi trờng từ hỗn hợp bột môi trờng chế sẵn: nhiều nớc giới có loại môi trờng dới dạng bột khô chứa đầy đủ thành phần theo yêu cầu, môi trờng đợc làm từ nguyên liệu, hoá chất tinh khiết nên chất lợng môi trờng đảm bảo ổn định Khi làm thí nghiệm môi trờng đợc pha với nớc theo tỷ lệ quy định, nhng phải 122 dùng nớc cất nớc khử khoáng, trung tính để pha chế Nếu bột môi trờng đà cũ cần phải kiểm tra lại pH sau làm môi trờng 4.3.2.2 Bảo quản môi trờng Môi trờng bột khô đợc giữ 10 - 12oC điều kiện khô, tránh ánh sáng Môi trờng đà pha chế đợc bảo quản – 10oC – th¸ng tuú theo thành phần môi trờng 4.3.2.3 Các phơng pháp tiệt trùng Tiệt trùng trình làm cho vật sản phẩm không vi sinh vật sống đợc Tiệt trùng đợc thực phơng pháp vật lý, hoá học Chọn phơng pháp tiệt trùng phụ thuộc vào tính chất lý hoá độ bền vững môi trờng ã Tiệt trùng nhiệt khô: Phơng pháp dùng để tiệt trùng dụng cụ thí nghiệm bền với nhiệt nh bông, băng, vải, gạc, dụng cụ thuỷ tinh Điều kiện tiệt trùng là: 180oC/ 30 phút 170oC/ giờ, 160oC/2 Các dụng cụ thuỷ tinh để đóng môi trờng phải đợc tiệt trùng khô trớc dùng ã Tiệt trùng nớc: Phơng pháp dùng nhiệt ớt thờng đợc dùng để tiệt trùng môi trờng nuôi cấy dụng cụ phẫu thuật Môi trờng thờng đợc tiệt trùng nồi hấp 121oC/ 15 phút Các môi trờng dễ bị hỏng nhiệt nh môi trờng có đờng, sữa, bia, máu, albumin cần tiệt trùng nhiệt độ thấp phơng pháp sau: Tiệt trùng gián đoạn (phơng pháp Tyndall): Môi trờng đợc hấp - lần nhiệt độ không 100oC 30 - 40 phút, cách 24 Giữa hai lần hấp cho môi trờng vào ủ 28 32oC/ 24 cho bao tử nảy mầm Các bào tử sống sót nảy mầm bị tiêu diệt lần hấp Khử trùng nhiệt độ thấp (phơng pháp Pasteur): Đun cách thuỷ môi trờng 60oC/ 30 phút, 73oC/ 15 phút sau làm lạnh đột ngột dới 10oC Phơng pháp không diệt đợc bào tử ã Phơng pháp lọc: Phơng pháp lọc đợc dùng để tiệt trùng chất dễ bị phá huỷ nhiệt Cho chất lỏng chảy qua màng lọc có kích thớc lỗ lọc 0,22àm Phần 123 chảy qua phễu đợc đựng dụng cụ vô trùng Thiết bị lọc màng lọc phải đợc tiệt trùng trớc dùng ã Phơng pháp dùng tia xạ: Tia tử ngoại (UV) đợc dùng nhiều để tiệt trùng buồng pha chế, tủ cấy vi sinh vật Đèn tử ngoại phải đợc chiếu trực tiếp, thẳng góc với nơi làm thí nghiệm liều lợng chiếu phải đủ với diện tích buồng Tia UV có tác dụng diệt nấm, khử trùng buồng pha chế cần phối hợp thêm phơng pháp dùng hoá chất để khử nấm 4.3.3 Thử vô trùng 4.3.3.1 Mục đích Thử vô trùng nhằm mục đích phát có mặt vi khuẩn, vi nấm chế phẩm nh dịch tiêm truyền, số loại thuốc tiêm, thuốc tra mắt dụng cụ y tế mà theo tiêu chuẩn riêng cần phải vô trùng 4.3.3.2 Nguyên tắc Vi sinh vật có chế phẩm thử phát triển môi trờng dinh dỡng thích hợp, chúng làm đục môi trờng lỏng tạo váng bề mặt lắng cặn đáy ống nghiệm Trên môi trờng đặc vi khuẩn, vi nấm mọc thành khuẩn lạc đặc trng 4.3.3.3 Môi trờng Trong nhiều dợc điển thờng dùng môi trờng Thioglycolat lỏng để phát vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí môi trờng Casein đậu tơng lỏng để phát vi khuẩn, vi nấm Tuy nhiên, dùng môi trờng khác cho thử nghiệm, với điều kiện môi trờng thích hợp cho phát triển loại vi sinh vật cần phát Ví dụ dùng môi trờng canh thang cao thịt pepton để phát vi khuẩn hiếu khí; môi trờng Wilson - Blair phát vi khuẩn kị khí; môi trờng Sabouraud lỏng cho phát vi nấm ã Kiểm tra chất lợng môi trờng: Độ vô trùng: Lấy 1-2 ống (hoặc bình) môi trờng làm ủ 30 - 35oC ngày môi trờng phát hiƯn vi khn, vµ 25 - 28oC Ýt nhÊt ngày với môi trờng phát vi nấm Sau thời gian nuôi cấy, ống môi trờng không đợc cã vi sinh vËt mäc (cã thĨ đ c¸c èng môi trờng song song với ống đợc cấy chất thử) Khả dinh dỡng: Cấy vào ống môi trờng thích hợp khoảng 100 tế bào vi sinh vËt sau: 124 + Vi khuÈn hiÕu khÝ: Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Pseudomonas aeruginosa + Vi khuẩn kỵ khí: Clostridium sporogenes + Vi nÊm: Candida albicans Aspergillus niger èng thử vi khuẩn đợc nuôi cấy 30 - 35oC/ ngµy, èng thư vi nÊm đ ë 25 - 28oC/ ngày Sau thời gian nuôi cấy vi sinh vật phải phát triển tốt môi trờng 4.3.3.4 Lấy mẫu thử Trong thử vô trùng, coi toàn số ống lọ thuốc đợc khử trùng đợc phân bố vô trùng điều kiện lô thuốc Thông thờng, lô có 100 đơn vị, lấy đơn vị để kiểm nghiệm Nếu nhiều 50 đơn vị lấy thêm đơn vị nhng không 10 Tuy nhiên, lấy mẫu cần phải dựa vào tiêu chuẩn ngành tiêu chuẩn sở sản phẩm để lấy mẫu cho thích hợp 4.3.3.5 Kiểm tra t¸c dơng øc chÕ vi sinh vËt cđa chÕ phÈm thử Một số thuốc trình sản xuất đợc thêm chất bảo quản Những chất ảnh hởng đến phát vi sinh vật có chÕ phÈm Mét chÕ phÈm ch−a biÕt cã t¸c dụng ức chế hay không cần phải kiểm tra tác dụng ức chế vi sinh vật sau: Lấy ống loại môi trờng phát vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí, vi nấm, cấy vào hai ống chế phẩm cần thử Cấy khoảng 100 tế bào (0,1 ml nhũ dịch vi sinh vật đợc pha khoảng nồng độ thích hỵp) Staphylococcus aureus (vi khn hiÕu khÝ), Clostridium sporogenes (vi khuẩn kỵ khí), Candida albicans (vi nấm) vào hai ống môi trờng tơng ứng Nuôi cấy 30 - 35oC/4 ngày vi khuẩn 25 28oC/7 ngày vi nấm Trong thời gian nuôi cấy, nÕu vi sinh vËt ph¸t triĨn gièng (mäc nhanh phong phú) ống chứng ống kiểm tra, chế phẩm thử đợc coi tác dơng øc chÕ 125 NÕu c¸c èng cã chÊt thư, vi sinh vật phát triển yếu không phát triển so víi èng kh«ng cã chÊt thư, chÕ phÈm cã chÊt øc chÕ T¸c dơng øc chÕ cđa chÊt thư phải đợc loại bỏ cách pha loÃng, trung hoà, dùng phơng pháp màng lọc 4.3.3.6 Phơng pháp thử Thử vô trùng đợc thực theo hai phơng pháp tuỳ theo tính chất mẫu thử: Phơng pháp lọc qua màng lọc vi khuẩn Phơng pháp nuôi cấy trực tiếp ã Phơng pháp dùng màng lọc: Thiết bị lọc thờng thuỷ tinh, thép không rỉ nhựa gồm hai phận tháo rời, có lới đỡ màng lọc Màng lọc có thành phần nitrat celleulose thờng dùng lọc nớc, dầu, dung dịch alcol yếu Màng ecetat cellulose để lọc dung dịch alcol mạnh Lỗ màng lọc có nhiều kích thớc khác nhau, thử vô trùng thờng dùng màng có đờng kính khoảng 50mm đờng kính lỗ màng lọc 0,45àm Thiết bị lọc màng lọc phải đợc tiệt trùng trớc thí nghiệm Dung dịch chất thử chảy qua màng lọc, vi sinh vật đợc giữ lại màng, cấy màng lọc vào môi trờng thích hợp để phát vi khuẩn, vi nấm Phơng pháp màng lọc kiểm nghiệm đợc có tác dụng ức chế vi sinh vật, đặc biệt thuốc kháng sinh, nhng đòi hỏi thiết bị tốt điều kiện vô trùng cao ã Phơng pháp nuôi cấy trực tiếp: Phơng pháp nuôi cấy trực tiếp có kỹ thuật đơn giản, nhng khả phát vi sinh vật giảm số lợng vi sinh vật có phân phối thể tích chất thử lớn Phơng pháp không thực đợc với chế phẩm có tác dụng ức chế chất kháng sinh, thí nghiệm chất thử đợc cấy trực tiếp vào môi trờng nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn, vi nấm ã Lợng mẫu thử dùng thí nghiệm: Lợng mẫu thử cần cấy vào môi trờng tuỳ thuộc vào loại mẫu (bảng 4.1.) Chất lỏng dầu hay dung dịch dầu phải thêm vào môi trờng nuôi cấy 1% tween 80 chất nhũ hoá khác với nồng độ thích hợp Mẫu thử dạng mỡ hay kem đợc hoà loÃng vào dung dịch pepton 0,1% v« trïng theo tû lƯ 1/10 tr−íc cấy vào môi trờng, (dung dịch pepton, cần thêm tween 80 víi tû lƯ 1ml/ 1lÝt) 126 • Kü tht thử: Mẫu thử dợc phẩm: Dùng dụng cụ vô trùng cấy trực tiếp chế phẩm thử vào môi trờng phát vi khuẩn, vi nấm theo số lợng quy định Chất rắn dạng bột cho trực tiếp vào môi trờng làm thành dung dịch hay nhũ dịch 1% sau cấy vào môi trờng Bảng 4.1 Lợng mẫu thử dùng cho thí nghiệm nuôi cấy trực tiếp Lợng chế phẩm đơn vị đóng gói Lợng tối thiểu cho môi trờng nuôi cấy Thể tích môi trờng (ml) Toàn èng 10 ml ≤ V< ml 1/2 èng 15 ml ≤ V < 20ml 2ml 20 20ml ≤ V < 50ml 5ml 40 50ml ≤ V< 100ml 10ml 80 Th−êng 10% 100 - ChÊt láng: ThÓ tÝch V < 1ml V ≥ 100ml - ChÊt r¾n: Khèi lợng P< 50mg 50mg < P< 200mg Toàn đơn vị đóng gói 1/2 khối lợng đơn vị đóng gói 20 40 100mg P 200mg 80 Mẫu thử băng gạc, khâu phẫu thuật kích thớc hình dạng cho phép, nhúng toàn mẫu thử vào 100ml môi trờng Mẫu thử dây truyền dịch: Cho dung dịch pepton 0,1% vô trùng chảy qua để thu đợc 15ml cấy vào 100ml môi trờng Môi trờng phát vi khuẩn đợc nuôi cấy 30 - 35oC ngµy, vµ ë 25 - 28oC Ýt nhÊt ngày vi nấm (Mỗi loại môi trờng làm - ống thử song song) ã Nhận định kết quả: Mẫu thử đợc coi vô trïng nÕu sau thêi gian nu«i cÊy kh«ng cã vi khuẩn, vi nấm phát triển Nếu có nhiều ống có vi sinh vật mọc cần làm lại lần thứ hai (Trớc làm lại thử nghiệm lần cần phân lập xác định đặc tính hình thái vi sinh vật ống thử dơng tính): 127 − NÕu kh«ng cã vi sinh vËt → mÉu v« trïng − NÕu cã vi sinh vËt gièng víi lÇn mét → mÉu thư kh«ng v« trïng − NÕu cã vi sinh vật khác với lần thí nghiệm đợc làm lại lần với số lợng mẫu gấp đôi: + Không có vi sinh vật phát triển mÉu v« trïng + Cã vi sinh vËt mäc → mẫu không vô trùng 4.3.4 Thử giới hạn vi sinh vật Các dợc phẩm trình sản xuất thờng bị nhiễm vi khuẩn, vi nấm nguyên nhân nh: Do chất nguyên liệu, nguyên liệu có nguồn gốc từ động vật, thực vật mức độ nhiễm khuẩn cao nhiều so với hoá chất Các tá dợc nh tinh bột, đờng, mật môi trờng chứa nhiều vi sinh vật, dễ gây nhiễm bẩn cho thuốc Cơ sở sản xuất, trang thiết bị, bao bì đóng gói, ngời sản xuất nguyên nhân gây nhiễm khuẩn Dạng bào chế nh viên hoàn mềm có độ ẩm cao thờng tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển viên nén, viên hoàn cứng Vì vậy, thử giới hạn vi sinh vật thử nghiệm bắt buộc cho dợc phẩm từ nguyên liệu đến thành phẩm không đợc tiệt trùng trình sản xuất 4.3.4.1 Mơc ®Ých Thư ®é nhiƠm vi sinh vËt nh»m mơc đích xác định giới hạn tối đa số lợng vi khn hiÕu khÝ, vi nÊm cã 1g (hc 1ml) chế phẩm thử Đồng thời phát vi khuẩn điểm vệ sinh quy định không đợc có thuốc là: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, loài Salmonella, vi khuẩn kỵ khí Clostridia 4.3.4.2 Nguyên tắc Phép thử đợc dựa nguyên tắc: Đếm số vi khn hiÕu khÝ, nÊm mèc, nÊm men cã d−ỵc phẩm đợc thể khuẩn lạc đặc trng đĩa thạch dinh dỡng thích hợp Căn vào đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hoá loại vi khuẩn để xác định vi khuẩn gây bệnh Trên sở kết thí nghiệm đánh giá chất lợng thuốc theo tiêu chuẩn dợc điển tiêu chuẩn sở 128 4.3.4.3 Phơng pháp thử ã Môi trờng: Đa số dợc điển thờng dùng môi trờng thạch casein đậu tơng để đếm vi khuẩn hiếu khí, môi trờng thạch Sabouraud - kháng sinh để đếm vi nấm Cũng dùng môi trờng thạch thờng để thử vi khuẩn hiếu khí môi trờng thích hợp cho phát triển đa số vi khuẩn hiếu khí (theo Dợc điển Trung Quốc 1997) ã Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu thử theo quy định chung đợc lấy 10g (hoặc 10 ml) để thí nghiệm Mẫu thử chất rắn hay chất lỏng làm thành dung dịch hay nhũ dịch nớc, đợc pha loÃng vào dung dịch đệm phosphat pH =7,2 dung dịch NaCl 0,9% để đợc nồng độ 10-1 sau pha nồng độ 10-2, 10-3 tuỳ theo yêu cầu thí nghiệm Mẫu thử chất lỏng không hoà lẫn vào nớc nh dạng dầu, kem, thuốc mỡ Cần chế tạo nhũ dịch cách thêm lợng chất nhũ hoá vô trùng thích hợp nh tween 20, tween 80, làm nóng nhẹ 45oC để tạo nhũ dịch đồng ã Kiểm tra chất ức chế: Kết thí nghiệm giá trị mẫu thử có chất bảo quản thành phần có ảnh hởng đến phát triển vi sinh vật Vì vậy, cần kiểm tra chất ức chế trớc đếm số lợng vi sinh vËt − Vi sinh vËt chØ thÞ: Staphylococcus aureus (đại diện vi khuẩn G +) Escherichia coli (đại diện vi khuẩn G -) Candida albicans (đại diện vi nấm) Các chủng đợc nuôi cấy môi trờng dinh dỡng thích hợp sau 18 - 24 (đối với vi khuẩn) 24 đến 48 vi nấm, đợc làm thành nhũ dịch có khoảng 100 tế bào/ ml Cách tiến hành: Đĩa thử 1: Cho 1ml chất thử nồng độ thích hợp Đĩa thư 2: ml chÊt thư + 1ml nhị dÞch vi sinh vật Đĩa chứng: 1ml nớc cất vô trùng + 1ml nhũ dịch vi sinh vật Cho vào ®Üa 15 - 20 ml m«i tr−êng dinh d−ìng thÝch hợp đà để nguội dới 45oC ủ 30 - 35oC/ 24 - 48 vi khuẩn 25 - 28oC/48 - 72 giê ®èi víi C albicans 129 Nhận xét kết quả: Đếm số khuẩn lạc vi sinh vật đĩa thí nghiệm Gọi A số khuẩn lạc đĩa Gọi B số khuẩn lạc đĩa Gọi C số khuẩn lạc đĩa chứng Nếu B A + C → mÉu thư kh«ng cã chÊt øc chÕ NÕu B ≈ A hc B > tb V Các ®−êng biĨu diƠn logarit nång ®é cđa chÊt thư vµ chất chuẩn với đờng kính vòng vô khuẩn phải song song Tab < tab V Trong khoảng nồng độ ®· chän sù phơ thc gi÷a logarit cđa nång ®é với đờng kính vòng vô khuẩn tơng ứng tuyến tÝnh Tc < tc V Tac < tac V V: tổng hiệu giá trị đờng kính lớn nhỏ nồng độ Ta = (T1 + T2 + T3) – (S1 + S2 + S3) Tb = (T3 + S3) – (T1 + S1) Tab = (S1 + T3 ) – (S3 + T1) Tc = (S1 + S3 + T1 + T3) – (S2 + T2) Tac = (2S2 + T1 + T3) – (2T2 + S1 + S3) ta, tb, tc, tab, tac hệ số tra bảng theo số vòng vô khuẩn (n) đợc nồng độ Giá trị t: Giá trị t (P = 0,95) Số vòng vô khuẩn (n) ta tb tc tab tac 0,80 0,66 1,14 0,66 1,14 0,80 0,66 1,14 0,66 1,14 0,81 0,66 1,14 0,66 1,14 0,82 0,67 1,16 0,67 1,16 0,83 0,68 1,17 0,68 1,17 10 0,84 0,68 1,19 0,68 1,19 136 ã Xác định giới hạn tin cậy: Độ lệch chuẩn: SM = 2,666.Hn.V n(A + 1,5B ) B2 Hn: HÖ sè vòng đo phụ thuộc vào n n: Số vòng vô khuẩn đo đợc nồng độ Giới hạn tin cËy: M 1, = 0,4013 A ± 0,301S M B Phần trăm giới hạn tin cậy trên: R1 = Antilog (2 + M1) Phần trăm giới hạn tin cËy d−íi; R2 = Antilog (2 + M2) − Sai sè thư nghiƯm: e% = R1 − R 2R ì 100 Kết định lợng có giá trị với e 5% Giá trị Hn N 10 Hn 1,27 1,03 0,90 0,81 0,75 0,69 0,65 0,65 Tài liệu tham khảo Bộ y tế (2002) Dợc điển Việt Nam III NXB Y học, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng cộng sù (1997) Vi sinh vËt häc Hµ Néi British Pharmacopoeia 2001 Collins C.H and Patricia M.L (1976) Microbiological methods, London Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (1997) The United States Pharmacopoeia XXIV (2000) 137 C©u hỏi tự lợng giá 4.1 Trình bày đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy vi khuẩn, nấm mốc, nấm men? 4.2 Nêu cách phân loại vi khuẩn theo hình thể đặc tính hô hấp? 4.3 Phân tích yếu tố ngoại cảnh ảnh hởng đến phát triển vi sinh vật? 4.4 Trình bày phơng pháp làm môi trờng nuôi cấy vi sinh vật? 4.5 Mô tả phơng pháp tiệt trùng? 4.6 Trình bày thử nghiệm thử vô trùng phơng pháp nuôi cấy trực tiếp? 4.7 Nêu mục đích, nguyên tắc thử nghiệm thử vô trùng thử giới hạn vi sinh vật? 4.8 Trình bày thử nghiệm đếm sè l−ỵng vi sinh vËt 1g (1ml) d−ỵc phÈm phơng pháp đĩa thạch? 4.9 Viết tên chủng thị đợc sử dụng để thử chất ức chế thử nghiệm thử vô trùng thử giới hạn vi sinh vật Nêu khác chủng thị hai phép thử giải thích? 4.10 Vai trò phơng pháp sinh học kiểm nghiệm chất kháng sinh? 4.11 Trình bày phơng pháp chuẩn bị nhũ dịch vi sinh vật định lợng kháng sinh.Tại chủng thị bào tử trớc sử dụng cần phải cấy truyền vào môi trờng thích hợp? 4.12 Cách pha dung dịch chuẩn dung dịch thử định lợng kháng sinh phơng pháp khuyếch tán Nêu điểm cần ý trình pha dung dịch này? 4.13 Mô tả cách tiến hành định lợng chất kháng sinh phơng pháp khuyếch tán? 4.14 Nêu nguyên nhân giai đoạn làm thử nghiệm ảnh hởng đến xác phơng pháp khuyếch tán? 4.15 Nêu điều kiện thử nghiệm cần đạt đợc định lợng kháng sinh để phép thử có giá trị? 4.16 Viết công thức tính kết định lợng kháng sinh với thử nghiệm ba liều công thức xác định giới hạn tin cậy? 138 4.17 Trình bày phơng pháp xác định số lợng tối đa vi khuẩn hiếu khí, vi nấm gam sáp bôi môi Lip Ice Cho biết mẫu thử có chất bảo quản riêng nhà sản xuất? 4.18 Trình bày phơng pháp định lợng bột Gentamicin sulphat thử nghiệm vi sinh vật( phơng pháp khuyếch tán), với thị Bacillus pumilus NCTC 8241 Cho biÕt: Gentamicin sulphat chuÈn cã 680 U/ ml, dung m«i pha loÃng nớc Ba nồng độ là: S1= U/ ml; S2=8 U/ ml; S3=16 U/ ml 139 ... 1ml nhũ dịch vi sinh vật Cho vào đĩa 15 - 20 ml môi trờng dinh dỡng thích hợp đà để nguội dới 45 oC đ 30 - 35oC/ 24 - 48 giê ®èi víi vi khn vµ 25 - 28oC /48 - 72 giê ®èi víi C albicans 129 − NhËn... đáp ứng động vật thí nghiệm chế phẩm đợc đa vào thể liều lợng theo quy định thí nghiệm để đánh giá chất lợng chế phẩm cần thử 4. 2.2 Động vật thí nghiệm Động vật dùng thí nghiệm phải đồng đều,... ổn định Vì kết thử nghiệm sinh học phải đợc đánh giá toán thống kê Độ xác phép thử đợc thể giới hạn tin cậy 4. 2 Kiểm nghiệm thuốc phơng pháp thử động vật 4. 2.1 Nguyên tắc Kiểm nghiệm thuốc phép