NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN KHÁNG PSEUDOMONAS SOLANACEARUM GÂY HÉO CÂY TRỒNG Đào Thị Lương, Phạm Văn Ty, Trịnh Thành Trung, Nguyễn Thị Anh Đào Trung tâm Công nghệ Sinh học- ĐHQGHN I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh héo cây gây ra bởi vi khuẩn Pseudomonas solanacearum là một bệnh phổ biến và nghiêm trọng ở nhiều loại cây hoa màu như cà chua, khoai tây, lạc, ớt, gừng vv Đây là bệnh chủ yếu gây giảm năng suất và mất mùa lạc ở nhiều nước như Trung Quốc, Thái Lan, Việt nam, Indonesia Hàng năm nạn dịch xảy ra gây thiệt hại từ 50-90% năng suất cây trồng. Mặc dù đã có một số nghiên cứu tập trung nghiên cứu về Pseudomonas solanacearum nhưng việc kiểm soát loại vi khuẩn gây héo này vẫn còn quá xa so với kết quả mong muốn. Với mục tiêu sử dụng đấu tranh sinh học nhằm góp phần giảm thiểu những tổn thất cho mùa màng do vi khuẩn Pseudomonas solanacearum gây ra, vì vậy chúng tôi tiến hành phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh ức chế và tiêu diệt loài vi khuẩn gây héo này. Các vi sinh vật đối kháng có khả năng tiêu diệt Pseudomonas solanacearum sẽ được sử dụng trong sản xuất phân bón chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng giống - Chủng xạ khuẩn, các vi sinh vật kiểm định từ Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật - Các chủng Pseudomonas solanacearum từ Viện khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Môi trường Môi trường Gauze I và II; ISP-4; A-4H; A-4 ; A-9; A-12; ISP-6 (pepton-cao nấm men-sắt); ISP-9; 79; Glyxerin- nitrat thạch; Gluco-asparagin thạch; ISP-3 (Thạch - đại mạch). Phương pháp Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh. - Phương pháp thỏi thạch (Dùng để sơ tuyển xạ khuẩn) - Phương pháp đục lỗ. (Xác định kháng sinh trong môi trường dịch thể ). Phương pháp xác định trọng lượng sinh khối khô Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại [1, 4]. Lựa chọn các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh: Môi trường lên men, nhiệt độ, pH ban đầu, thời gian lên men, nguồn carbon, nguồn nitơ. ảnh hưởng của xạ khuẩn đến cây trồng - ảnh hưởng của dịch nuôi xạ khuẩn đến khả năng nảy mầm của lạc - ảnh hưởng của xạ khuẩn đến sự phát triển của cây lạc non. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chủng xạ khuẩn L30 được phân lập từ đất, được nuôi trên môi trường ISP-4 sau 5 ngày, xác định hoạt tính kháng sinh. Kết quả trên bảng 1 cho thấy chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh phổ rộng, kháng vi khuẩn và nấm, nhưng mạnh nhất là chống các chủng Pseudomonas solanacearum gây bệnh héo lá ở cây trồng (P.solanacearum 12 gây bệnh héo lá trên khoai tây, P.solanacearum 20 gây bệnh trên cà chua và P.solanacearum 222 gây bệnh trên cây lạc) Bảng 1. Hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn L30. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn L30. Chủng xạ khuẩn được nuôi trên 6 môi trường để xác định đặc điểm nuôi cấy (bảng 2) và các đặc điểm sinh lý, sinh hoá (bảng 3) Bảng 2: Đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn L30. Bảng 3: Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng xạ khuẩn L30. Từ kết quả bảng 2 và 3 dựa theo các bản mô tả của Shirling và Gottlieb đồng thời dựa vào khoá phân loại của Gauze và cộng sự [1,4]: chủng L30 có các đặc điểm không giống với các loài đã được mô tả, nên tạm gọi là Streptomyces sp L30. Cần được tiếp tục phân loại bằng phương pháp hoá phân loại và sinh học phân tử. Lựa chọn các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn L30 Môi trường thích hợp Trong lên men công nghiệp, sau khi tìm được chủng có hoạt tính cao cần phải lựa chọn môi trường thích hợp nhất. Một môi trường thích hợp là vừa đảm bảo chủng có khả năng sinh trưởng tốt vừa sinh ra các sản phẩm mong muốn với hiệu suất tối ưu. Chủng L30 được nuôi cấy trên 6 loại môi trường, sau 5 ngày ở 30 o C. Hình 1. Môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng L30 Kết quả hình 1 cho thấy: Chủng xạ khuẩn đều sinh trưởng và cho hoạt tính ở các môi nuôi cấy, nhưng sinh tổng hợp chất kháng sinh tốt nhất trên môi trường ISP-4 và A-9. pH thích hợp Chủng xạ khuẩn L30 được nuôi trên môi trường ISP-4, pH được chỉnh ở 5, 6, 7, 8, 9. Sau 5 ngày nuôi cấy ở 300C cho kết quả ở hình 2. Hình 2. pH thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn L30 Chủng xạ khuẩn có khả năng sinh trưởng trong dải pH từ 5 đến 9 song khả năng tổng hợp chất kháng sinh nhiều nhất là trong khoảng pH7. Nhiệt độ thích hợp Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP-4 ở các nhiệt độ 25, 30, 35, 40, 45 0 C trên máy lắc ổn nhiệt. Hoạt tính kháng sinh được xác định ở hình 3. Hình 3. Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của xạ khuẩn L30 Kết quả cho thấy: Chủng xạ khuẩn sinh trưởng được trong khoảng 25-40 0 C, hoạt tính kháng sinh và sinh khối cao nhất ở 30-35 0 C. ở nhiệt độ nuôi cấy trên 400C thì sinh trưởng và tổng hợp chất kháng sinh giảm đáng kể. Thời gian nuôi cấy Sự sinh trưởng và phát triển trong môi trường lên men mang đặc tính của chủng và liên quan tới khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh. Chủng xạ khuẩn đựơc nuôi trong các điều kiện thích hợp, cứ sau 24 giờ được lấy mẫu xác định hoạt tính kháng sinh và sinh khối (hình 4) Hình 4. Thời gian thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của xạ khuẩn L30 Kết quả cho thấy: Trong 3 ngày lên men đầu tiên sinh khối tăng dần đạt cực đại ở 96 giờ và giảm dần sau đó, còn quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh bắt đầu sau 2 ngày và mạnh nhất ở 120 giờ. Nguồn carbon thích hợp [...]... nhiễm xạ khuẩn thì có 80-100% cây bị bệnh IV KẾT LUẬN 1 Chủng xạ khuẩn L30 có phổ kháng sinh rộng với các nhiều loại vi sinh vật kiểm định đặc biệt là hoạt tính mạnh kháng Pseudomonas solanacearum 2 Dựa vào các đặc điểm nuôi cấy, hình thái và sinh lý sinh hoá, chủng L30 có đặc điểm khác với các loài đã mô tả do đó gọi là Streptomyces sp 3 Điều kiện thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ. .. (hình 6 ) Kết quả cho thấy sinh khối phát triển mạnh nhất trên nguồn cao men và pepton, hoạt tính kháng sinh mạnh nhất trên nguồn amôn, cao men và pep ton Hình 6 Nguồn nitơ thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của xạ khuẩn L30 Ảnh hưởng của xạ khuẩn đến cây trồng ảnh hưởng của dịch nuôi xạ khuẩn đến khả năng nảy mầm của hạt lạc [3] Hạt lạc giống được ngâm trong dung dịch xạ khuẩn đã được pha loãng,... khuẩn nghiên cứu vào đất trồng lạc đã không ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của cây lạc, ngay cả khi trong đất có chủng vi khuẩn gây bệnh Khả năng kháng bệnh gây héo xanh của chủng xạ khuẩn L30 trên đất trồng lạc Tiến hành nhiễm chủng xạ khuẩn nghiên cứu vào đất, cho chúng phát triển 2 tuần sau nhiễm tiếp chủng gây bệnh héo xanh Pseudomonas solanacearum 222 vào trước khi trồng lạc Sau 1 tháng trồng lạc,... khuẩn L30 đến khả năng sinh trưởng của lạc [2] Lạc được trồng trên các chậu đất được bố trí theo các phương án sau: có nhiễm xạ khuẩn L30, hoặc nhiễm xạ khuẩn L30 trộn với P solanacearum 222, hoặc không nhiễm gì làm đối chứng Đo chiều cao cây lạc theo thời gian Bảng 5 ảnh hưởng của chủng xạ khuẩn đến khả năng sinh trưởng của cây lạc Kết quả cho thấy: khi nhiễm chủng xạ khuẩn nghiên cứu vào đất trồng lạc... của chủng xạ khuẩn L30 trên môi trường ISP-4 với pH 7, nhiệt độ 28-350C, thời gian lên men là 120- 144 giờ, nguồn carbon trên tinh bột và nguồn nitơ là (NH4)2SO4 4 Chất kháng sinh do chủng xạ khuẩn L30 sinh ra không ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm của hạt lạc 5 Khi nhiễm xạ khuẩn sinh chất kháng sinh vào đất không gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của cây lạc mà còn có tác dụng ức chế bệnh héo xanh TÀI... mầm của hạt Dịch nuôi được pha loãng 10 lần ức chế khả năng nảy mầm, còn ở tỷ lệ pha loãng 100-10.000 lần thì lại kích thích nảy mầm Bảng 4 ảnh hưởng của chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn đến khả năng nảy mầm của lạc Điều này khẳng định rằng: chất kháng sinh do chủng xạ khuẩn L30 tạo ra không ảnh hưởng xấu đến khả năng nảy mầm của hạt lạc mà còn có tác dụng kích thích nảy mầm ảnh hưởng của chủng xạ khuẩn. .. được 2-3 lá, tiến hành tiêm vi khuẩn gây bệnh héo xanh (ở nồng độ 10-5) vào các lách lá cây lạc Sau một tháng đọc kết qủa Bảng 6 Khả năng kháng bệnh gây héo xanh của chủng xạ khuẩn L30 trên đất trồng lạc Kết quả ghi ở bảng 6 cho thấy khi nhiễm P solanacearum vào đất trồng lạc, hay tiêm trực tiếp vào thân cây, trong điều kiện trước đó đã nhiễm chủng xạ khuẩn thì không có cây nào bị nhiễm bệnh (tỷ lệ...Chủng xạ khuẩn đựơc nuôi trong các điều kiện thích hợp với các nguồn carbon khác nhau (hình 5) Hình 5 Nguồn carbon thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của xạ khuẩn L30 Kết quả trình bày ở hình 5 cho thấy sinh khối phát triển mạnh nhất trên nguồn glucoz, nhưng hoạt tính kháng sinh mạnh nhất trên nguồn tinh bột Nguồn nitơ thích hợp Chủng xạ khuẩn được nuôi trong các điều... 140-141 4 Shirling, E B and D Gottlieb Methods for characterization of Streptomyces species Intern J Syst Bact., 22,1966, p 313-340 SUMMARY BIOLOGYCAL PROPERTIES AND ANTIBIOTIC ACTIVITY AGAINST PSEUDOMONAS SOLANACEARUM OF THE STRAIN STREPTOMYCES L30 Dao Thi Luong, Pham Van Ty, Nguyen Lan Dung, Nguyen Thi Anh Dao The strain L30 was isolated from soil sampl in Hatay province and identified as belong... in liquid culture Antibiotic produced by the strain L30 could stimulate the germination of groundnut seeds When the L30 was spayed to the soil, it could inhibit the bacterial wilt of groundnut (Pseudomonas solanacearum) , but did have negative effect on the growth of the groundnut . và P .solanacearum 222 gây bệnh trên cây lạc) Bảng 1. Hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn L30. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn L30. Chủng xạ khuẩn được. xác định đặc điểm nuôi cấy (bảng 2) và các đặc điểm sinh lý, sinh hoá (bảng 3) Bảng 2: Đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn L30. Bảng 3: Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng xạ khuẩn L30 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN KHÁNG PSEUDOMONAS SOLANACEARUM GÂY HÉO CÂY TRỒNG Đào Thị Lương, Phạm Văn Ty, Trịnh Thành Trung, Nguyễn Thị Anh Đào Trung tâm Công nghệ Sinh học-