ỨNG DỤNG PCR/RFLP ĐỂ ĐIỀU TRA PHÂN TÍCH KIỂU GEN GEN PROTEIN SỮA ( KAPPA - CASEIN b-LACTOGLOBULIN ) Ở BÒ SỮA VIỆT NAM Trịnh Thị Kim Thoa, Lê Thị Hằng, Phùng Thị Bích Thuỷ, Nguyễn Anh, Viện Cơng nghệ Sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu giấy, Hà nội MỞ ĐẦU Nhằm thúc đẩy ngành chăn ni bị sữa nước ta, nhà chăn nuôi di truyền quần thể tiến hành lai tạo đàn bò sữa chủng, bò lai 1/2, 3/4 5/8 máu Hà lan thích nghi điều kiện chăn ni trang trại bán trang trại Việt nam Ngày bên cạnh phương pháp chọn giống phenotype, việc nghiên cứu, ứng dụng thị gen vào chương trình giống động thực vật ngày phát triển [1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10] Sử dụng thị phân tử để kiểm tra, đánh giá chọn lọc di truyền lai tạo bò sữa triển khai số nước Mỹ, Canada, Đan mạch, Nauy Ở nước ta hướng nghiên cứu đề cập vài năm gần [12, 13] Người ta sử dụng biến thể BB gen Kappa - casein ( K-Cn ), -lactoglobulin (-Lg) hai số gen sử dụng thị di truyền chọn giống bò sữa Thật vậy, nhà nghiên cứu trước chứng minh vai trò chúng liên quan tới chất lượng sữa, chất lượng suất mát [1, 2] K-Cn coi tiêu chuẩn chọn lọc kinh tế quan trọng để nâng cao chất lượng sữa công nghiệp [ ] Chính lẽ đó, chúng tơi tiến hành điều tra phân tích kiểu gen gen kappa-casein, -lactoglobulin nhằm góp phần nhà di truyền phenotype đánh giá chất lượng giống trình tạo giống Trong báo chúng tơi trình bày số kết điều tra ban đầu kiểu gen gen K-Cn -Lg đàn bò đực, Hà lan hạt nhân Trung tâm Giống hệ lai Hy vọng kết nhận đóng góp phần vào chương trình cải tạo đàn bò sữa nước ta ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chúng tiến hành điều tra phân tích gen K-Cn -Lg tinh trùng, máu 45 bò sữa giống hạt nhân (Hà Lan, Sind) 84 bò lai (1/2, 3/4 5/8 máu Hà Lan ) nuôi dưỡng Trung tâm Tinh Moncada, Trung tâm Giống Sữa Phù Đổng Hà Nội Trung tâm nghiên cứu bị đồng cỏ Ba - Hà Tây - Tách chiết ADN từ máu bò theo phương pháp proteinase K/phenol/chloroform [5] - Mồi tổng hợp máy pharmacia LKB, Gene assmbler special Viện Công nghệ sinh học - TTKHTN & CNQG - Cặp mồi gồm 23 24 oligonucleotide dùng để nhân đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen K - Cn - Cặp mồi gồm 25 oligonucletide dùng để nhân -lg Theo phương pháp Sulimova có cải tiến [ 11 ], tiến hành PCR để nhân đoạn gen K-Cn - 228 bp Chu trình Thermal cycle : biến tính sơ bộ: phút 940C, mẫu nhân lên 35 chu trình: biến tính phút 940C, đính mồi phút 30 giây 570C, kéo dài phút 720C Hỗn hợp PCR : 50 l, ( nồng độ MgCl2 : mM, Taqpolymerase: 2,5 đơn vị, d NTP: 0,5 mM, nồng độ ADN từ 0,5 - 1,0 g/ l ) - 15 l sản phẩm PCR cắt 10 đơn vị enzym cắt Hind III pst I Chúng tiến hành PCR để nhân đoạn gen -Lg - 262 bp theo phương pháp Medrano [ ]: Mẫu nhân lên 35 chu trình [ biến tính 45 giây 940C, đính mồi phút 600C, kéo dài phút 720C ) Hỗn hợp PCR : 25 l ( MgCl2 50 mM, d NTP : 10 mM, mồi 10 pmol/ml, Taq- polymerase 1,25 đơn vị, ADN : 50 - 100 ng/ l) - 15 l sản phẩm PCR cắt 3,6 đơn vị enzym cắt Hae III Các sản phẩm PCR, sản phẩm sau xử lý với enzym giơí hạn kiểm tra điện di agarose với nồng độ tương ứng 2%, 3% nhuộm ethidium bromide Điện di đồ quan sát chụp ảnh máy Gen-Doc ( phrmacia ) III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết nhân lên sau PCR phân loại kiểu gen gen KCn thí nghiệm trình bày hình Hình Điện di đồ mẫu sản phẩm ADN 228 bp nhân lên sau PCR mẫu sản phẩm PCR sau xử lý với enzym giới hạn Hind III Pst I gel agarose 2%, 3% ( nhuộm ethidium bromide ) a) Điện di đồ mẫu sản phẩm ADN 228 bp: Giếng - maker 50 base - pair ladđer; Giếng 2,3,4,5,6 - sản phẩm ADN 228 bp nhân lên từ máu bò giống HàLan b) Điện di đồ mẫu sản phẩm PCR sau xử lý với enzym Hind III Pst 1: Giếng maker kb; Giếng 2,3,4 sản phẩm ADN 228 bp nhân lên từ ADN máu bò Hà lan sau xử lý với Hind III; Giếng 5,6 - sản phẩm ADN 228 bp nhân lên từ máu bò lai Hà lan sau xử lý với Pst I Kết nhân đoạn gen -Lg biến thể gen -Lg trình bày hình Hình 2: Điện di đồ mẫu sản phẩm ADN 262 bp nhân lên sau PCR mẫu sản phẩm PCR sau xử lý với enzym cắt giới hạn Hind III Pst I gel agarose 2%, 3% ( nhuộm ethidium bromide ) a) Điện di đồ mẫu sản phẩm ADN 262 bp nhân lên sau PCR: Giếng Maker 50 base - pair ladđer; Giếng 2,3,4 đoạn ADN 262 bp nhân lên từ ADN máu bò Hàlan; Giếng 5,6,7,8 - đoạn ADN 262 bp nhân lên từ ADN máu bò lai 3/4 5/8 máu Hà lan b) Điện di đồ mẫu sản phẩm PCR xử lý với enzym Hae III: Giếng Maker 50 base - pair ladđer; Giếng 1,2,3 - đoạn ADN 262 bp nhân lên từ ADN máu bò Hà lan sử ly với Hae III; Giếng 4,5,6 - đoạn ADN 262 bp nhân lên từ ADN máu bò lai 3/4 5/8 máu Hà lan xử lý với Hae III Kết điều tra, phân tích kiểu gen gen ( K - Cn ), -Lg bò giống hạt nhân ( bố, mẹ ) Hà lan, sind trình bày bảng Bảng 1: Kết điều tra kiểu gen -Lg bò sữabgen K-Cn Kết phân tích cho thấy, tất 45 bị giống bố mẹ nước ta mang biến thể di truyền AA K-Cn Cịn biến thể BB gen K-Cn khơng thấy xuất Trong bị Hà lan nước Mỹ, Canada Nezaland chiếm từ - 4% biến thể BB gen K-Cn [ 1, 5] Biến thể AA -Lg bò đực lớn lần biến thể AA -Lg bò ( -Lg bò đực lạibbảng1) chiếm tỷ lệ 57,14 % Ngược lại Biến thể AB gen thấp biến thể AA -Lg bò gần lần Biến thể B B gen -Lg bò bò đực chiếm tỷ lệ gần đạt : 28 % 21,43% Như qua điều tra, phân tích kiểu gen gen K-Cn -Lg bò đực , giống Hà lan số trung tâm giống nước ta cho thấy, chất lượng bò giống nước ta chất lượng bò giống nước Mỹ, Canada Newzeland dựa vào hai tiêu nêu Bò lai hướng sữa ( 1/2, 3/4 5/8 máu Hà lan) nước ta tạo từ bò lai sind ( bò vàng Việt nam x bò sind) với bị Hà lan chủng Vì thế, chúng tơi tiến hành điều tra kiểu gen gen K-Cn -Lg bò đực Sind Kết nghiên cứu cho thấy: tất bò Sind kiểm tra mang biến thể A A gen K-Cn Có đực mang biến thể BB gen -Lg ( đạt 66,67 %) ( bảng 1) Như biến thể BB gen -Lg chiếm tỷ lệ cao bò đực Sind so với bò bò đực giống Hà lan Đồng thời với việc điều tra , phân tích kiểu gen gen K-Cn -Lg bò sữa bố mẹ, chúng tơi tiến hành điều tra, phân tích kiểu gen gen K-Cn -Lg bò lai Kết điều tra phân tích kiểu gen gen K-Cn -Lg bị lai trình bày bảng Qua kiểm tra, phân tích gen protein sữa bị lai cho thấy, 91,67 % bò lai mang biến thể AA gen K-Cn, có 8,33 % bị lai mang biến thể BB gen K-Cn Như biến thể BB gen K-Cn bò lai nước ta cao biến thể BB gen K-Cn bò Hà lan nước ngồi ( 3-4%) Tuy kết phân tích kiểu gen gen K-Cn số bò bố mẹ khơng có mang biến thể BB gen K-Cn, lai lại có ( chiếm 8,33%) mang thể biến thể BB gen K-Cn Đây có lẽ lai tạo tinh trùng nhập ngoại chăng? Tỷ lệ biến thể AB gen -Lg cao so sánh với biến thể AA BB gen -Lg Ở bò lai biến thể AB gen -Lg chiếm 48,8% Bảng cho thấy biến thể BB gen -Lg đạt 40,5 % Tỷ lệ cao so với tỷ lệ biến thể BB (25,64%) gen -Lg bò Hà lan (bố, mẹ), lại thấp so với tỷ lệ biến thể BB gen -Lg bò sind (66,67 %) Kết nhận cho thấy lai phần biểu tính trội di truyển bị Sind nên tỷ lệ biến thể BB gen -Lg đạt tỷ lệ cao Bảng 2: Kết điều tra kiểu gen gen K-Cn -Lg bò lai Từ kết phân tích trên, cho thấy cơng nghệ gen xác định đặc điểm di truyền sớm thông qua gen xác định công tác chọn giống Thật vậy, xác định kiểu gen gen K-Cn gen -Lg mẫu tinh trùng mẫu máu bị trung tâm giống cách có hệ thống q trình chọn lọc lai tạo để góp phần thúc đẩy cải tạo đàn bò sữa cách nhanh chóng, đồng mặt sản lượng lẫn chất lượng sữa Kết nghiên cứu dấu hiệu di truyền sớm có ý nghĩa vơ quan trọng cơng tác giống Kết nghiên cứu số liệu điều tra kiểu gen số gen K- Cn - Lg bò giống Hà lan bò lai khai thác Trung tâm Tinh đông viên Moncada, Trung tâm giống sữa Phù Hà nội Trung tâm nghiên cứu bị đồng cỏ Ba - Hà Tây Vấn đề khơng có ý nghĩa khoa học mà cịn có ý nghĩa thực tiễn, lẽ lần điều tra, thống kê kiểu gen gen có liên quan tới chất lượng sữa bò giống (bố mẹ) hạt nhân kiểm tra hệ lai Vì từ trước tới nay, kiểm tra chất lượng giống thông qua phương pháp di truyền quần thể với thờì gian - năm để theo dõi suất chất lượng sữa hệ lai, gặp nhiều khó khăn trở ngại, phạm vi triển khai quy mô lớn cần phải có thời gian kinh phí nhiều Thực tế phát triển ngành chăn ni bị sữa nước ta đòi hỏi nhà khoa học phải tạo đàn bị sữa vừa có suất cao lại có chất lượng sữa tốt điều kiện cần thiết quan trọng nhà nông Chất lượng sữa đàn bò hướng sữa nước ta (hàm lượng lipit, protein ) thấp so với tiêu chuẩn sữa công nghiệp tiêu chuẩn sữa quốc tế Vì để nâng cao chất lượng sữa bò, song song với biện pháp chọn giống theo di truyền quần thể, cần ý kiểm tra, đánh gía chất lượng giống theo phương pháp kiểu gen để bổ sung khả cho tính trạng quan tâm, thực cách nhanh chóng quy mơ lớn Sử dụng cơng nghệ gen chương trình giống cho phép chọn lọc cá thể giống tốt mà kiểm định phenotype ta bỏ sót Song để thực vấn đề đòi hỏi cần phân tích mẫu với số lượng lớn, đồng thời kiểm tra hệ cháu thực mục tiêu VI KẾT LUẬN Từ kết nhận trên, rút số kết luận sau: Đã điều tra, phân tích kiểu gen gen K-Cn gen - Lg 129 bò sữa ( gồm 45 bò giống chủng Hà lan, Sind 84 bò sữa lai (1/2, 3/4 5/8 ): • Tất 45 bò giống chủng Hà lan, Sind mang tần số A A gen K-Cn đạt 100% Không có mang tần số BB gen K-Cn Tần số A A gen -Lg đạt 31,11%, tần số AB đạt 37,78% tần số BB đạt 31,11 % 45 bò giống bố mẹ chủng Hà lan Sind • Trong số 84 bị sữa lai (1/2, 3/4 5/8) tần số BB gen K-Cn đạt 8,3 3%, tần số A A gen K-Cn đạt 91,57% Tần số A A gen -Lg đạt 10,7%, tần số AB đạt 48,8% tần số BB đạt 40,5 % 84 cá thể bò lai Tần số A A gen -Lg bò lai giảm 2,5 lần tần số BB gen -Lg bò lai gần tương đương so với bò Hà lan chủng, đạt 40,5% Các kết nhận sở khoa học để bổ sung giúp nhà chăn nuôi lai tạo giống, song song với phương pháp chọn giống kinh điển theo phenotype, cần tuyển chọn đàn bò bố mẹ kiểm tra di truyền hệ lai theo kiểu gen để tạo đàn bò sưã có suất cao chất lượng tốt TÀI LIỆU THAM KHẢO Anne-Marie Bech et all, 1990 Milk protein polymorphism in Danish dairy cattle and the influence of genetic variants on milk yeld J of dairy research, 57, p.5362 Bovenhuis H and Weller J I; 1994 Mapping and analysis of dairy cattle quantitave trait loci by maixmum likelihood methodology using milk protein genes as genetic markers Genetics ( in America), 137, p.267-280 Chung -lactoglobuin locibE.R, Kim W.T et all, 1998 DNA genotyping of K-casein and in Korean Holstein AI bulls J Diry sci ( in Korean) 20(2),p 75-84 Henderson D.A and Marshall, 1996 Kappa-casein kiểu gen effects in a multiple breed beef cattle population J of animal science, V 74, supplement Hemy A E, 1989 PCR technology principles and application for DNA amplification Chapter 17, p.221 Lien S, etal 1990 Milk protein mapping Biotechnology J p 414-419 Medrano J F, 1990 Application of the PCR procedure for genetic evalution in cattle Procceding of the 4th the world congress on genetics applied to livestock production 23-27 July, p 71-74 Moody D E, et all, 1996 Characterization of DNA polymorphisms in three populations of hereford Cattle and their associations with growth and maternal EPD in line Heefords J Anim Sci, 74, 1784-1793 Zadworny D and Kuhnlein, 1990 The identification of the kappa-casein kiểu gen in Holstein dairy cattle using PCR Theo Appl.genet 1990, 80: 631-634 10 Pedersen J, 1991 Selection to increase frequency of K-casein variant B in dairy cattle J Anim, Breed Gee 108, 434-445 11 Sulimova G.E et all, 1991 PCR application of the PCR procedure for identification of K-casein alleles in cattle Genetic (in Russian) T.17, N 12, p 2053-2062 12 Trinh Thi Kim Thoa, Dau Hung Anh, Le dinh luong, 1998 Identification of the Kappa-casein kiểu gen in dairy bulls by PCR Genetics and applications N p 5-11 13 Trinh Thi Kim Thoa, HoangTuan Anh, 1999 Application of the PCR and RFLP technology for evalution in dairy bulls in Vietnam J Genetics and applications N 4, p 30-34 SUMMARY Using PCR/RLFP techniques for DNA genotyping of Kappa-casein and  -lactoglobulin loci in Vietnamese dairy cattle Trinh Thi Kim Thoa, Le Thi Hang, Phung Thi Bich Thuy, Nguyen Anh Institute of Biotechnology-18 Hoang Quoc Viet, Cau giay, Hanoi, Vietnam The polymorphism of kappa-casein (K-Cn) and  lactoglobulin ( -Lg) loci in sperm and blood samples from 127 cattle ( 20 bulls and 109 cows) of the Holland, Sind and Holland cross-breed cows were analyed by PCR/RLFP techniques The results were shown that, the dairy Holland and Sind cattle ( 47 cattle) in two breeding centre only carry the AA allele K-Cn ( 100%) Frequency BB gene KCn of those cattle did not founded While frequency BB gene K-Cn of cattle from American, Canadian and Newzeland was 3-4% Frequency AA, AB and BB of gene b -Lg were 25,64%, 35,9% and 38,46% for Holland, Sind cattle, respectively Like that, frequency AA gene  -Lg of bulls was higher than this frequency of cows It was 57,14% Contrary to the frequency AB gene  -Lg from bulls was lower than frequency AB gene  -Lg from cows- two times The frequency BB of  -Lg from Holland bulls and cows was equivalent It was 28% and 21,43 % respectively From those results were shown that, quality of Vietnamese cattle is bad more than quality of cattle from American, Canadian and Newzeland The Vietnamese cross-breed cattle have created from Sind cross-breed cows So we were determined genotype of gene K-Cn and  -Lg from Sind bulls Results were observed that, all six Sind bulls have carrying variant AA gene K-Cn Only four Sind were carrying variant BB gene  -Lg (66,67 %) Thus, so variant BB of gene  -Lg from Sind bulls were higher than that from Holland bulls and cows The polymorphism of K-Cn and  -Lg loci also was determined from 84 cross-breed cows ( 1/2, 3/4 and 5/8 ) The homozygous AA and homozygous BB of K-Cn were observed at the frequency of 91,57% and 8,33% respectively for cross-breed cows In the  -Lg system three genotypes were observed The AA, AB and BB variants were 10,7 %, 48,8% and 40,5 %, respectively Like that, the homozygous AA  -Lg of cross-breed cows decreased two times and the homozygous BB equivalent with homozygous BB  -Lg of Holland cattle This study was performed to provide the basic data for preservation and improvement of genetic resources and was given us such as complementary criteria in breeding selection for improvement Vietnamese population cattle  ... gen gen K-Cn -Lg bị lai Kết điều tra phân tích kiểu gen gen K-Cn -Lg bị lai trình bày bảng Qua kiểm tra, phân tích gen protein sữa bò lai cho thấy, 91,67 % bò lai mang biến thể AA gen K-Cn,... BB gen -Lg chiếm tỷ lệ cao bò đực Sind so với bò bò đực giống Hà lan Đồng thời với việc điều tra , phân tích kiểu gen gen K-Cn -Lg bị sữa bố mẹ, chúng tơi tiến hành điều tra, phân tích kiểu gen. .. tiến hành điều tra kiểu gen gen K-Cn -Lg bò đực Sind Kết nghiên cứu cho thấy: tất bò Sind kiểm tra mang biến thể A A gen K-Cn Có đực mang biến thể BB gen -Lg ( đạt 66,67 %) ( bảng 1) Như biến