BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƯNG CÁ THỂ NGƯỜI QUA LOCUT D5S818 BẰNG KỸ THUẬT PCR Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn, Lương Thị Yến, Lê Bích Trâm Cục kỹ thuật Hoá Sinh và Tài liệu TCVI BCA Ngô Thị Kim, Quyền Đình Thi, Đào Thị Tuyết Viện Công nghệ Sinh học MỞ ĐẦU Sự ra đời của sinh học phân tử và công nghệ gen đã giúp cho khoa học hình sự, lập chứng minh thư ADN, truy tìm thủ phạm được xác định nhanh chóng và chính xác. Trong hệ gen của con người tồn tại các locut di truyền có chứa các đoạn ADN lặp lại (4 đôi bazơ) khác nhau và được phát hiện bằng phương pháp PCR / 1,2,3,4 /. Trên thế giới đã có hơn 12 locut được sử dụng rộng rãi trong y học hình sự / 5,6 /. Ở Việt Nam, Viện Khoa học hình sự đã áp dụng kỹ thuật phân tử trong điều tra phá án , song các kỹ thuật trên được sử dụng toàn bộ chương trình và kit của nuớc ngoài. Để đáp ứng yêu cầu áp dụng kỹ thuật phân tích ADN của người Việt Nam đề tài sẽ dần khảo sát các đoạn gen phù hợp. Trong bài này , chúng tôi xin được phép trình bày phương pháp khảo sát và đặc trưng cá thể người qua locut D5S818. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 1. Đối tượng Mẫu máu được lấy từ tĩnh mạch người khoẻ mạnh, tình nguyện và chống đông bằng EDTA. Các hoá chất dùng cho tách chiết và làm sạch ADN là hoá chất tinh khiết dùng cho phân tích được mua của Biorad , Sigma. 2. Phương pháp ADN được tách chiết từ máu toàn phần theo phương pháp chuẩn dùng phenol và cloroform. ADN sau tách chiết được xác định độ sạch và hàm lượng bằng điện di trên gel agaroza 2 %, mật độ quang học ở bước sóng 260 / 280 nm và tỉ lệ giữa hai mật độ quang này là 1,7 – 2,2. Phản ứng PCR được tiến hành với tỉ lệ thích hợp các chất và cặp mồi D5 S818 ( xin phép chưa công bố trình tự mồi ). Trình tự của phản ứng PCR như sau : a.95 o C - 5 phút b.94 o C - 45 giây c.57 o C - 75 giây d.72 o C - 1 phút Quá trình từ b đến d được lặp lại 30 chu kỳ. e.72 o C - 6 phút g.4 o C - 10 phút Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agaroza 2 % và gel polyacrylamid 5 % có biến tính. Kích thước của sản phẩm khuếch đại sẽ gồm 8 alen theo thứ tự tương ứng : - Alen số 7 có kích thước là 141 bp - Alen số 8 - 145 bp - Alen số 9 - 149 bp - Alen số 10 - 153 bp - Alen số 11 - 157 bp - Alen số 12 - 161 bp - Alen số 13 - 165 bp - Alen số 14 - 169 bp Mỗi một mẫu máu chỉ cho kết quả 2 alen ( dị hợp tử ) hoặc 1 alen ( đồng hợp tử ) trong số các alen kể trên. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Xây dựng phương pháp Chúng tôi đã tiến hành phân tích tổng số 56 mẫu máu trên cơ sở mẫu đối chứng mẫu. Có nghĩa là bản gel polyacrylamid đầu tiên gồm 12 mẫu ( như sơ đồ bản điện di N1 ) có chứa 5 kiểu alen khác nhau. Ta tạm gọi các alen có được theo thứ tự kề nhau từ thấp lên cao là: 1, 2, 3, 4, 5 Sơ đồ bản điện di gel polyacrylamid N1 Sau đó ta chọn hỗn hợp mẫu ( Mix1 ) có mặt đủ 5 alen. Trong trường hợp này ta chọn mẫu 1 gồm alen số 1 và 2 ; mẫu 4 gồm alen số 3 và 5 ; mẫu 9 gồm alen số 1 và 4. Bản gel polyacrylamid tiếp theo ( N2 ) ngoài số mẫu cần phân tích, còn có 2 giếng dành cho hỗn hợp mẫu ( Mix 1 ). Sơ đồ bản điện di số 2 có chứa đủ 7 alen, trong đó có 5 alen tương ứng với Mix 1và thêm 2 alen ở vị trí số 6 và vị trí - 2. Sơ đồ bản điện di gel polyacrylamid N2 Từ đây ta có thể thấy được vị trí của 8 alen thuộc locut D5 S818. Đó là : - Alen –2 tương ứng với alen số 7 - Alen –1 tương ứng với alen số 8 ( chưa quan sát được ) - Alen 1 tương ứng với alen số 9 - Alen 2 tương ứng với alen số 10 - Alen 3 tương ứng với alen số 11 - Alen 4 tương ứng với alen số 12 - Alen 5 tương ứng với alen số 13 - Alen 6 tương ứng với alen số 14 Với hỗn hợp mẫu ( Mix 2 ) có chứa 7 alen ta có thể khảo sát được toàn bộ số mẫu cần phân tích. Hỗn hợp mẫu này sẽ được nâng cấp thành thang alen chuẩn cho locut D5 S818. Điều này sẽ được báo cáo trong các nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi. 2. Đặc trưng cá thể. Bước đầu khảo sát 56 mẫu máu người Việt Nam cho thấy lucus D5 S818 có 8 alen khác nhau bao gồm các alen số 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. Riêng alen số 8 chưa phát hiện được, có thể do số lượng mẫu phân tích chưa đủ nhiều, hoặc có thể có sự thiếu hụt alen này ở người Việt Nam. Tần số các alen xuất hiện ở người Việt Nam qua phân tích là: Alen số 7 chiếm 1,78 % Alen số 8 chiếm 0 % Alen số 9 chiếm 1,46 % Alen số 10 chiếm 28,57 % Alen số 11 chiếm 25,00 % Alen số 12 chiếm 20,53 % Alen số 13 chiếm 17,85 % Alen số 14 chiếm 1,78 % 3. Kiểu gen. Qua phân tích locut D5 S818 của 56 mẫu máu người Việt Nam chúng tôi nhận thấy có 47 mẫu ( chiếm 83,92 % ) mang gen dị hợp tử bao gồm 12 kiểu gen và 9 mẫu ( chiếm 16,07 %) mang gen đồng hợp tử bao gồm 4 kiểu gen. Tần số các kiểu gen của locut D5 S818 Số liệu khảo sát của chúng tôi chưa nhiều nhưng có thể khẳng định phương pháp nghiên cứu này hợp lý và khoa học để có thể triển khai khảo sát với số lượng mẫu lớn, đáp ứng cho nghiên cứu tiếp theo của đề tài. KẾT LUẬN 1. Bằng phương pháp phân tích mẫu đối mẫu của 8 alen khác nhau, kế tiếp nhau, sai khác nhau 4 nucleotid ở locut D5 S818, chúng tôi đã tìm được hỗn hợp mẫu có chứa đủ 8 alen dùng cho thang alen chuẩn của locut D5- S818. 2. Tần số phân bố alen 10 lớn nhất (28,57%), sau tới alen 11 (25,00%), alen 12 (20,53%) và 13 (17,85%). Các alen khác (7, 9, 14) có tần số phân bố thấp. Đặc biệt alen số 8 chưa quan sát được. 3. Qua 56 mẫu máu được phân tích, locut D5 S818 cho 8 alen với 12 kiểu gen dị hợp tử (83,92%) và 4 kiểu gen đồng hợp tử (16,07%). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Edwards A. et al , 1991 ADN typing with trimeric and tetrameric tandem repeats : polymorphic loci, detection systems, and population [...]... repeated units of 4bp are widely used for identification purpose including D5S818 The polymorphism of this locut was analyzed by PCR technique However, it’s impossible to detect each allele of this locut with its exact size by commercial DNA marker The number of nucleotide A and T is much higher than G and C in alleles of this locut, this will greatly affect to the movement of DNA bands in polyacrylamide... N0 8 hasn't been observed Analyzing of 56 blood samples showed that the DS5818 locut has 8 alleles 83,92% and 16,07% of samples harboring 12 heterozygotes and 4 homozygotes respectively Người thẩm định nội dung khoa học: TS Nguyễn Đức Thành ... containing 8 alleles of D5S818 which has 4 nucleotides positions in deferent was constructed A highest frequency of allele n0 10 was found at 28,57%, and the values 25%, 20,53%, 17,85% of alleles 11, 12, 13 respectively The lower frequencies were found in alleles n0 7, 9, 10 The frequency of alleles N0 8 hasn't been observed Analyzing of 56 blood samples showed that the DS5818 locut has 8 alleles 83,92%... 6 Santos, S M et al, 1996 Portuguese population data on six short tandem repeat loci – CSF1PO, TPOX, THO1, D3S1358, vWA and FGA Forensic Sci Int 83, 229 SUMMARY Using pcr technique to specify D5 S818 Locut in human genome The fast technical development in DNA technology and the increasing knowledge of the polymorphisms in the human genome has opened a new dimension, particularly in forensic biology... fragment which is rich of GC To solve the problem in alleles detection, we use the method of mixing PCR products This paper showed the results of allelic frequencies and genotypes which regulated by D5 S818 locut among 56 collected samples DNA was isolated from peripheral white blood cells by phenol/chloroform extraction/ ethanol precipitation method The repeated 4 nucleotides ADN sequence was found using . BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƯNG CÁ THỂ NGƯỜI QUA LOCUT D5S818 BẰNG KỸ THUẬT PCR Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn, Lương Thị Yến, Lê Bích Trâm Cục kỹ thuật Hoá Sinh và Tài. tích ADN của người Việt Nam đề tài sẽ dần khảo sát các đoạn gen phù hợp. Trong bài này , chúng tôi xin được phép trình bày phương pháp khảo sát và đặc trưng cá thể người qua locut D5S818. ĐỐI. Viện Khoa học hình sự đã áp dụng kỹ thuật phân tử trong điều tra phá án , song các kỹ thuật trên được sử dụng toàn bộ chương trình và kit của nuớc ngoài. Để đáp ứng yêu cầu áp dụng kỹ thuật