HÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP LIPASE TỪ NƯỚC THẢI VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH LIPASE CỦA 102 CHỦNG PSEUDOMONAS Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Bẩy, Mai Thị Thanh, Nguyễn Thị Thảo, Lê thị Thu Giang,Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Ngọc Dũng Viện Công nghệ Sinh học MỞ ĐẦU Lipase là enzym xúc tác thủy phân triglycerid thành diglycerid, monoglycerid hoặc glycerol và các axit béo nhờ hoạt động của nó trên bề mặt phân pha dầu nước. Lipase vi khuẩn có ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, hóa học, mỹ phẩm, thuộc da, trong y dược và xử lý môi trường [1]. Hàng năm doanh thu lipase đạt hàng trăm triệu dollar Mỹ trên thị trường enzym công nghiệp [2]. Để sản xuất lipase công nghiệp, người ta áp dụng kỹ thuật tái tổ hợp nhằm tạo chủng vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng nhanh, năng suất tổng hợp lipase cao, hoạt tính đặc hiệu cho từng cơ chất và ổn định trong một thời gian dài dưới các điều kiện kiềm, nhiệt độ cao [3, 4]. Việt Nam đang hiện đại hóa và công nghiệp hóa đất nước, ngành công nghiệp thực phẩm, giặt tẩy, hóa chất cần rất nhiều enzym đặc biệt là lipase, song các chế phẩm lipase đang sử dụng chủ yếu là nhập khẩu. Do đó việc nghiên cứu và triển khai sản xuất lipase trong nước đang được quan tâm [5]. Hơn nữa việc nghiên cứu và sản xuất công nghiệp lipase trong nước phải mang lại hiệu quả kinh tế, an toàn và không gây ô nhiễm môi trường. Do nhu cầu về lipase ở trong nước cao, chúng tôi đã phân lập, nuôi cấy và xác định hoạt tính lipase một số chủng vi sinh vật từ môi trường. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Nguyên liệu Mẫu nước thải. Mẫu nước thải được thu thập từ cống rãnh các nơi khác nhau như Xí nghiệp Da Mai động, Xí nghiệp Thủy sản Thanh xuân, hồ Hoàn Kiếm, lò mổ Khương thượng, và sông Tô lịch. Hóa chất. Các hóa chất dùng để làm môi trường nuôi cấy đều mua từ các hãng hóa chất nổi tiếng: Bacto-peptone, Yeast extract (Difco); Gum arabic (Sigma); agar (Merck). Các loại dầu dùng làm cơ chất thuộc dầu tinh luyện, chất lượng cao. Môi trường. Môi trường nuôi cấy bao gồm NaCl (1,0%), peptone (1,0%), cao nấm men (0,5%), dầu thực vật (1,0%), đối với môi trường rắn bổ sung 2% agar. 2. Phương pháp Phân lập. 1 ml nước thải và cặn bã được khuấy trộn đều và ly tâm 5.000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch nổi được pha loãng 1:102-104 lần với nước cất khử trùng và 100 l dịch pha loãng được trang trên đĩa thạch bán kính 11 cm. Sau đó ủ đĩa thạch trong tủ ủ nhiệt độ 28 o C và sau 24-48 giờ mang đĩa thạch để đánh giá các khuẩn lạc thu được. Trên đĩa thạch xuất hiện khuẩn lạc nào có vòng sáng xung quanh thì khuẩn lạc đó có khả năng sinh tổng hợp lipase. Các khuẩn lạc sinh tổng hợp lipase được nuôi cấy trong 3 ml môi trường, nhiệt độ 28 o C trong 24 giờ. Sau đó pha loãng 1:108-1010, lấy 100 l dịch pha loãng trang trên đĩa thạch để chọn ra các khuẩn lạc thuần khiết không pha tạp. Tiếp tục làm cho tới khi trên đĩa thạch chỉ xuất hiện duy nhất một loại khuẩn lạc. Cuối cùng khuẩn lạc này được nuôi cấy trong 3 ml qua đêm ở nhiệt độ 28 o C, và bảo quản với glycerin 75% ở nhiệt độ -80 o C. Nuôi cấy. Các khuẩn lạc có vòng sáng lớn trên đĩa thạch chứa 0,5% tributyrin được cấy vào 3 ml môi trường LB và nuôi lắc 220 vòng/phút qua đêm ở nhiệt độ 30 o C. Dịch nuôi cấy cấp I được cho vào 50 ml môi trường LB theo tỷ lệ 100 l/100 ml môi trường và được tiếp tục nuôi lắc 220 vòng/phút, nhiệt độ 30 o C. Sau 24, 48, 72, 96, 120 và 144 giờ các mẫu dịch nuôi cấy được lấy ra để đo OD 600 và hoạt tính lipase. Xác định hoạt tính lipase. Hoạt tính lipase được xác định bằng phương pháp chuẩn độ tự động pH-Stat trên máy 718 Stat Titrino [5-6]. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Phân lập Để phân lập các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp lipase, chúng tôi đã lấy mẫu đất và nước thải xung quanh các xí nghiệp thuộc da Mai Động, xí nghiệp chế biến hải sản Nhân Chính, lò mổ Khương Thượng, sông Tô Lịch và hồ Hoàn Kiếm. Từ các mẫu nước thải đó đã phân lập được 41 chủng sinh tổng hợp lipase (hình 1) trong đó có 8 chủng kháng streptomycine. Các chủng phân lập được nuôi cấy trong 3 ml môi trường và bảo quản ở -80 o C (bảng 1). Hình 1. Định tính lipase trên đĩa thạch agar chứa 0,5% tributyrin. A) Các chủng vi sinh vật M1 (1), M2 (2), M3 (3), M4 (4),B1 (5), B2 (6). B) Các chủng Pseudomonas: ĐN1 (1), ĐN2 (2), ĐN3 (3), ĐN4 (4), ĐN6 (5), KT4 (6). Bảng 1. Các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp lipase được phân lập từ nước thải. Nơi lấy mẫu: B: bơ; CR cống rãnh, LM: lò mổ; MD: Mai động; M: mỡ; HK: Hoàn kiếm. HT: Hoạt tính lipase được đánh giá theo vòng sáng thủy phân dầu Marvella. Vàng C: vàng cam; vàng N: vàng nghệ. 2. Nuôi cấy 5 chủng có hoạt tính cao Trong số đó, 5 chủng B1, LM27, M1, M42 và CRS3 (kháng lại streptomycine) đã được nuôi cấy trong 50 ml môi trường trong 7 ngày để đo tốc độ phát triển và xác định hoạt tính lipase. Các chủng đều phát triển tốt và đạt nồng độ OD 600nm tối ưu sau 72 giờ nuôi cấy, trừ chủng LM27 sau đó được xác định là đã bị nhiễm sau 72 giờ nuôi cấy (hình 2). Hoạt tính lipase được xác định bằng phương pháp chuẩn độ thủ công với cơ chất là dầu ăn Marvella. Hoạt tính của các chủng nuôi cấy M1, LM27 và CRS3 không cao, cao nhất chỉ đạt 4,2 đơn vị/ml dịch nuôi cấy. M1 và LM27 có biểu đồ hoạt tính tương tự nhau và đạt tối ưu sau 168 giờ nuôi cấy, trong khi đó CRS3 có biểu đồ hoạt tính trái núi đạt tối ưu sau 96 giờ nuôi cấy 2,4 đơn vị/ml dịch nuôi cấy (hình 2A). Hình 2. Tốc độ sinh trưởng các chủng nuôi cấy M1, LM27, B1, M42, và CRS3 từ 0-168 giờ (A) và hoạt tính lipase các chủng M1, LM27, và CRS3 từ 0-168 giờ (B). 3. Khảo sát hoạt tính lipase của 102 chủng Pseudomonas Trong những năm gần đây có nhiều công bố về nhân dòng, tinh sạch và ứng dụng lipase của các chủng Pseudomonas. Nguyễn Ngọc Dũng và CS đã phân lập nhiều chủng Pseudomonas nhằm mục đích sản xuất phân bón vi sinh. Chúng tôi đã khảo sát hoạt tính lipase của 102 chủng Pseudomonas do TS. Nguyễn Ngọc Dũng cung cấp nhằm tìm ra một số chủng có hoạt tính cao. Kết quả khảo sát hoạt tính lipase trên đĩa thạch có chứa 0,5% tributyrin được thể hiện trong bảng 2. Bảng 2. 102 chủng Pseudomonas đã được khảo sát hoạt tính lipase. HT: Hoạt tính lipase. Sau 24 giờ nuôi cấy trên đĩa thạch, chủng nào không có vòng sáng được coi là không sinh tổng hợp lipase (-), chủng nào có vòng sáng nhỏ là có hoạt tính thấp (+), chủng nào có vòng sáng trung bình được coi là có hoạt tính trung bình (++), chủng nào có vòng sáng lớn được coi là có hoạt [...]... cao nhất đạt 4,2 đơn vị/ml dịch nuôi cấy • Đã khảo sát hoạt tính lipase của 102 chủng Pseudomonas Có 14 chủng hoàn toàn không có hoạt tính lipase chiếm 13,7%; 58 chủng có hoạt tính lipase thấp chiếm 56,9%; 15 chủng có hoạt tính lipase trung bình chiếm 14,7%; và 15 chủng có hoạt tính lipase cao chiếm 14,7% • Đã nuôi cấy 21 chủng Pseudomonas có hoạt tính lipase cao trên đĩa thạch agar chứa 0,5% tributyrin.. .tính cao (+++) Trong số 102 chủng Pseudomonas được khảo sát có 14 chủng hoàn toàn không có hoạt tính lipase chiếm 13,7%; 58 chủng có hoạt tính lipase thấp chiếm 56,9%; 15 chủng có hoạt tính lipase trung bình chiếm 14,7%; và 15 chủng có hoạt tính lipase cao chiếm 14,7% Trên hình 1B, ta thấy các chủng ĐN1 (1) và ĐN4 (4) có vòng sáng lớn nhất (hoạt tính lipase cao nhất), sau đó đến ĐN3 (3) và ĐN2... giờ nuôi cấy (hình 3) Hoạt tính lipase của hai chủng 92 và 93 đối với dầu Oliu lần lượt đạt 13,7 và 8,1 đơn vị/ml dịch nổi Trong khi đó chủng 82 đạt 10,0 đơn vị/ml đối với dầu tổng hợp (bảng 4) Chúng tôi đã chọn ra một chủng trong 6 chủng trên để tách chiết ADN hệ gen phục vụ cho vi c nhân dòng gene lipase KẾT LUẬN • Đã phân lập được 41 chủng vi khuẩn có hoạt tính lipase Hoạt tính cao nhất đạt 4,2... ly tâm và loại bỏ tủa tế bào Hoạt tính lipase được đo bằng phương pháp pH-stat Hoạt tính dao động trong khoảng 2,02 đến 6,70 Chủng có hoạt tính cao nhất là T301 (6,70 đơn vị/ml), chủng có hoạt tính thấp nhất là ĐN4 (2,02 đơn vị/ml) Bảng 4 Hoạt tính các chủng Pseudomonas có vòng sáng lớn trên đĩa thạch agar chứa 0,5% dầu, nuôi cấy 48 giờ Điều kiện phản ứng: 60oC, pH 8,0, cơ chất là dầu tổng hợp 5% Hình... Tốc độ sinh trưởng các chủng Pseudomonas 92, 93, 82 Fe3O4, M4 và F1O4T nuôi cấy 144 giờ Trong 21 chủng Pseudomonas, 6 chủng 92, 93, 82 Fe3O4, M4 và F1O4T được nuôi lắc trong 50 ml môi trường LB, 30oC, 144 giờ Sau 24, 48, 72, 96, 120 và 144 giờ, mẫu được lấy ra và đo OD600 cũng như hoạt tính lipase Tốc độ sinh trưởng của các chủng 92, 93 là tốt nhất, đạt tối ưu tại 96 giờ Trong khi đó các chủng 82 và M4... KT1 (6) và ĐN6 (5) Đĩa thạch này được chụp ảnh sau 48 giờ nuôi cấy 4 Nuôi cấy một số chủng Pseudomonas có hoạt tính cao Bảng 3 Hoạt tính các chủng Pseudomonas có vòng sáng lớn trên đĩa thạch agar chứa 0,5% dầu Điều kiện phản ứng: 40oC, pH 8,0, cơ chất là dầu tổng hợp 5% Trong số những chủng Pseudomonas có vòng sáng lớn trên đĩa thạch agar chứa 0,5% dầu, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy 21 chủng (bảng... showed a halo ring if the strain produces lipase Among them 14 strains did not produce lipase (-), 58 strains had low lipase activity (+), 14 strains showed middle lipase activity (++) and 15 strains produced lipase with a wide halo ring (+++) Among Pseudomonas strains producing lipase we chose 21 strains and cultivated to characterize the cell growth and lipase activity Most strains showed a growth curve... produced lipase with the highest activity of 13.72 units/ml supernatant toward 5% olive oil whereas the lipase activities of the strains 93 and 82 toward 5% olive oil were 8.13 and 4.26 The lipase activity of Pseudomonas sp 82 toward mix oil was the highest (10.0 units/ml) whereas others strains produced lipase with activity of 5.08-6.06 units/ml supernatant Người thẩm định nội dung khoa học: TS Trương... lipase cao trên đĩa thạch agar chứa 0,5% tributyrin trong 50 ml môi trường LB • Tiếp tục nuôi cấy 6 chủng trong 50 ml môi trường LB trong 6 ngày để theo dõi tốc độ sinh trưởng và hoạt tính lipase Đề tài này được thực hiện dưới sự hỗ trợ của Quỹ Nghiên cứu Khoa học Cơ bản, năm 2001-2002 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 K.E Jaeger, et al (1994) Bioeng 2: 39-46 2 R.A Sheldon In enzymatic reactions in organic media,... biosynthetizing lipase from waste water and charactersization of lipase activity of 102 pseudomonas strains In our report we collected 41 microbial strains producing lipase from slaughterhouse waste and lakes around Hanoi Among them 8 strains were streptomycine resistant 10 strains showed high lipase activity (+++) on agar plates containing 0.5% tributyrin, 21 strains had average lipase activity (++) and . HÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP LIPASE TỪ NƯỚC THẢI VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH LIPASE CỦA 102 CHỦNG PSEUDOMONAS Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Bẩy,. Đã khảo sát hoạt tính lipase của 102 chủng Pseudomonas. Có 14 chủng hoàn toàn không có hoạt tính lipase chiếm 13,7%; 58 chủng có hoạt tính lipase thấp chiếm 56,9%; 15 chủng có hoạt tính lipase. độ sinh trưởng các chủng nuôi cấy M1, LM27, B1, M42, và CRS3 từ 0-168 giờ (A) và hoạt tính lipase các chủng M1, LM27, và CRS3 từ 0-168 giờ (B). 3. Khảo sát hoạt tính lipase của 102 chủng