SO SÁNH ĐA HÌNH AFLP GIỮA HAI NHÓM CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) CÓ TRỌNG LƯỢNG PHÂN BIỆT. Nguyễn Thu Thuý, Nguyễn Thị Diệu Thuý, Nguyễn Văn Cường Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam MỞ ĐẦU Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là loài cá có giá trị kinh tế cao và được nuôi trồng phổ biến ở khu vực Đông nam á [4]. ở Việt Nam, cá tra được nuôi nhiều ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Thời gian gần đây, cá được di giống thuần hoá nuôi ở một số tỉnh phía Bắc. Cá thương phẩm có giá trị trên thị trường cả trong và ngoài nước. Hiện cả nước có trên 14 doanh nghiệp xuất khẩu cá tra, ba sa với kim ngạch hàng năm trên 60 triệu USD [7]. Nâng cao hiệu suất nuôi trồng để tăng lợi nhuận luôn là mục tiêu của các nhà sản xuất. Bên cạnh những nghiên cứu nhằm tăng hiệu quả sinh sản, dinh dưỡng, việc cải tạo giống để tạo những dòng cá có năng suất cao được chú trọng. Chương trình lai tạo, chọn giống truyền thống luôn đóng vai trò chủ đạo trong cải tạo giống. Tuy nhiên, để nâng cao hiệu quả chọn lọc, trong thời gian gần đây, nghiên cứu lập bản đồ gen và phát triển chỉ thị di truyền phân tử được chú ý phát triển. ở cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) đã xác định được 19 chỉ thị phân tử loại I, 243 các chỉ thị phân tử loại II, 1 chỉ thị EST [8]. Trong số các phương pháp di truyền phân tử, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism ) là phương pháp có nhiều ưu điểm, đặc biệt cho phép tuyển chọn đồng thời trên toàn bộ hệ gen và tạo ra một số lượng lớn chỉ thị có thể chuyển đổi thành chỉ thị đặc hiệu vị trí đơn giản (simple locus-specific markers) mà không cần biết trước thông tin của trình tự đặc hiệu đó. Phát triển chỉ thị AFLP liên quan tính trạng quan tâm có thể dựa trên sự phân bố ngoại hình của hai quần thể đối lập nhau [2] hoặc dựa trên đa hình di truyền ở hai nhóm cá thể đối lập nhau [5]. Phương pháp sau có ưu điểm không cần thiết lập bản đồ di truyền và tạo ra các phả hệ đặc biệt, nên thích hợp cho phát hiện vị trí tính trạng định lượng (QTL) trực tiếp từ các quần đàn thương phẩm có tuổi thành thục dài như cá tra (2-3 năm). Với mục đích phát triển chỉ thị AFLP trực tiếp từ quần đàn thương phẩm, chúng tôi tiến hành phân tích đa hình AFLP giữa hai nhóm cá tra có trọng lượng cực lớn và cực nhỏ. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu: Mẫu cá tra được thu từ trung tâm Cái Bè – Tiền Giang, được bảo quản trong cồn 70 0 , ở 4 0 C cho đến khi sử dụng (Mẫu do Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I cung cấp). Từ 282 mẫu cá, chọn 10 mẫu có trọng lượng lớn nhất (trung bình là 3,9 gam) và 10 mẫu có trọng lượng nhỏ nhất (trung bình là 2,2 gam). Tách chiết ADN: ADN cá tra được tách chiết chủ yếu theo Fetzner [3]. Cụ thể: khoảng 50 mg mẫu được rửa sạch cồn bằng 0,9 ml đệm TLE (10 mM Tris; 0,1 mM EDTA; pH 8.0). Thêm vào 0,9 ml đệm phá tế bào (10 mM Tris; 100 mM EDTA; 2% SDS, pH 8.0). Bổ sung 5µl enzyme protease K (20 mg/ml), ủ 55 0 C trong 14-16 giờ. Để mẫu ở nhiệt độ phòng và bổ sung 4µl RNAase A (10mg/ml), ủ 37 0 C trong 30 phút. Thêm vào 0,3 ml dung dịch kết tủa protein (7,5 mM Ammonium Acetate), trộn đều và ủ trong đá 30 phút. Ly tâm 2 lần để loại tủa protein và thu dịch ADN. Kết tủa ADN bằng 0,9 ml isopropanol, để -20 0 C trong 3 giờ, ly tâm thu tủa ADN. Rửa ADN bằng 0,75 ml cồn 70 0 . Hòa tan ADN trong 100µl đệm TLE. Bảo quản ở 4 0 C để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Kỹ thuật AFLP: AFLP cơ bản được tiến hành theo Liu và cs [6]. Các bước chính của phương pháp được tóm tắt như sau: ADN được cắt bằng 2 enzyme EcoRI và MseI: 300 ng ADN, 3U enzyme EcoRI và MseI ở 37 0 C trong 2 giờ. Sau đó, các đoạn ADN cắt ra được gắn vào các adapter của EcoRI và MseI nhờ enzyme T4 ADN ligase trong 3 giờ ở 20 0 C. Các đoạn ADN tạo ra trước hết được khuếch đại bằng PCR sử dụng mồi tiền chọn lọc (preselective primer) sau đó là mồi chọn lọc (selective primer) Bảng 1: Trình tự các adapter và mồi được sử dụng trong phân tích AFLP Phân tích sản phẩm AFLP: sau PCR, một thể tích formamide dye được thêm vào phản ứng. Mẫu được biến tính bằng nhiệt ở 95 0 C trong 3 phút, và đặt ngay vào đá. Sản phẩm AFLP được điện di trên gel polyacrylamide biến tính (19:1 acrylamide:bisacylamide; 7,5 M urea; 0,5 X TBE buffer ). Bản gel được cố định trong axit axêtic 10%, nhuộm trong bạc nitơrat 1%, hiện trong natricacbônat 2,5% và cố định lại trong axit axêtic 10% [1]. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ADN hệ gen từ hai nhóm cá tra có trọng lượng lớn và nhỏ được tách chiết. Kết quả đánh giá trên điện di agarose cho thấy chất lượng ADN đạt tiêu chuẩn cho các phân tích tiếp theo. Để chuẩn bị khuôn ADN cho AFLP, ADN hệ gen được cắt đồng thời bởi 2 enzyme giới hạn EcoRI có trình tự nhận biết 6 base pair (G(AATTC) và MseI có trình tự nhận biết 4 base pair (T(TAA). Thành công của kỹ thuật AFLP phụ thuộc vào sự cắt hoàn toàn của phản ứng cắt và chất lượng ADN. Các đoạn ADN tạo ra được gắn với các adapter EcoRI và MseI để tạo thành khuôn cho phản ứng khuyếch đại sau này, đồng thời ngăn cản sự tái kết hợp giữa các đoạn ADN vừa được tạo ra. Trước hết, một số đoạn ADN tạo ra được nhân lên nhờ phản ứng PCR sử dụng mồi tiền chọn lọc (PSP - preselective primers). PSP chứa các trình tự: i) bổ trợ với adapter; ii) bổ trợ với trình tự nhận biết của enzyme giới hạn; iii) một nucleotid. Các đoạn ADN mà nucleotid liền kề với trình tự nhận biết của enzyme giới hạn bổ trợ với nucleotid của PSP sẽ được nhân lên (theo xác suất một phần tư số đoạn ADN sẽ được nhân lên). Tương tự, các đoạn ADN mà 3 nucleotid tiếp theo liền kề với trình tự nhận biết của enzyme giới hạn bổ trợ với 3 nucleotid của mồi chọn lọc (SP - selective primers) sẽ được nhân lên. Theo xác suất qua 2 lần PCR, 1/256 số đoạn ADN sẽ được nhân lên. Đối với các cá thể mang đột biến tại các nucleotid bổ trợ với PSP và SP (so với mẫu chuẩn), các đoạn AND sẽ không được nhân lên. Do đó, trên bản điện di tại các vị trí trên không xuất hiện băng. 54 tổ hợp mồi được sử dụng để phân tích đa hình AFLP của hai nhóm cá tra có trọng lượng lớn và nhỏ. Mỗi tổ hợp mồi tạo ra từ 27 đến 94 băng, trung bình là 55 băng trên một tổ hợp mồi. Trong đó, cao nhất là tổ hợp mồi E-ACC/M- CAG: 94 băng/mẫu, và thấp nhất là tổ hợp mồi E-ACG/M- CTG: 27 băng/mẫu. Trong 54 tổ hợp mồi nghiên cứu, 11 tổ hợp mồi không tạo băng AFLP và 43 tổ hợp mồi tạo 204 băng AFLP. Tỷ lệ băng đa hình giữa các mẫu cá tra là 1,35% cho thấy sự đa hình AFLP giữa các mẫu trong cùng loài thấp. Kết quả này cũng phù hợp với phân tích của Liu và cs [6] tiến hành trên cá tra Mỹ (Ictalurus punctatus và Ictalurus. furcatus). Tỷ lệ băng đa hình trong cùng loài I. punctatus là 3,4 %, ở I. furcatus dao động từ 1,7% -3,3% [6]. Đa hình AFLP của tổ hợp mồi E-ACA/M-CAG giữa 2 nhóm cá lớn và nhỏ được thể hiện ở hình 1. Hình 1. Đa hình AFLP giữa nhóm cá lớn và nhóm cá nhỏ của tổ hợp mồi E-ACA/M-CAG 1,2: Băng AFLP xuất hiện ở cả 2 nhóm cá với tần số khác nhau Tổng cộng có 204 băng AFLP được tạo ra từ 43 tổ hợp mồi, trung bình là 4,74 băng AFLP/mồi. Tần suất xuất hiện các băng AFLP ở hai nhóm cá tra là khác nhau nên chúng tôi đã tính tần số khác biệt giữa hai nhóm. Kết quả được thể hiện ở bảng 2. Bảng 2: Tần số khác biệt của các băng AFLP giữa hai nhóm cá tra Những băng AFLP có tần số khác biệt trên 50% được thể hiện ở bảng 3. Bảng 3: Các băng AFLP có tần số khác biệt trên 50 %. Kết quả trên cho thấy, chỉ có 8 băng AFLP có tần số khác biệt trên 50%, chiếm 3,92% tổng số băng AFLP. Để kiểm tra mức độ ổn định và tin cậy của các băng AFLP, chúng tôi đã tiến hành phân tích các băng AFLP này với số lượng mẫu lớn hơn (18 mẫu). Kết quả cho thấy, băng AF 6-1 của tổ hợp mồi E-AGG/M-CTT và băng AF 7-4 của tổ hợp mồi E- ACC/M-CAA đạt độ chênh lệch giữa 2 nhóm cá thí nghiệm là 56% và 50%. Do có tính ổn định tương đối, rõ nét và ưu thế cho nhóm cá có trọng lượng nhỏ, hai băng [...].. .AFLP này được tách dòng và đọc trình tự nhằm mục đích xây dựng 2 chỉ thị AFLP liên quan tới tính trạng tăng trưởng của cá tra KẾT LUẬN Phân tích đa hình AFLP cá tra bằng 54 tổ hợp mồi chọn lọc cho thấy tỷ lệ đa hình trong loài tương đối thấp, trung bình 1,35% Tuy nhiên, tỷ lệ này đủ tin cậy trong việc xác định các chỉ thị liên quan tính trạng có ý nghĩa kinh tế So sánh đa hình AFLP giữa 2 nhóm cá tra. .. liên quan tính trạng có ý nghĩa kinh tế So sánh đa hình AFLP giữa 2 nhóm cá tra có trọng lượng 2 cực cho thấy 8 băng AFLP có tần số khác biệt trên 50% Tuy nhiên chỉ có 2 băng: AF 7-4 của tổ hợp mồi EACC/M- CAA và AF 6-1 của tổ hợp mồi E-AGG/M-CTT có tính ổn định, và vẫn giữ được tỷ lệ này khi kiểm tra trên số lượng mẫu lớn hơn Hai băng này sẽ được sử dụng để tuyển chọn lại trong quần đàn Lời cảm ơn: Tác... Chanel catfish, Ictalurus punctatus Genetics 158, 727-734 SUMMARY COMPARISON OF AFLP POLYMORPHISM BETWEEN TWO WEIGHT EXTREME GROUPS OF CATFISH (Pangasius hypophthalmus) Amplified fragment length polymorphism (AFLP) , is a DNA fingerprinting technique based on restriction of genomic DNA and subsequent selective PCR amplication AFLP has advantages over other marker systems such as: simultaneously screen... species, an analysis on growth performance trait in two high - extreme and low - extreme groups of catfish (Pangasius hypophthalmus) using AFLP technique has been carried out Twenty extreme animals of weight (10 fish having the highest weight - high group and 10 fish having the lowest - low group) were selected for this study from 282 These samples were screened by AFLP using 54 primer combinations The... analysis showed that an average of 55 AFLP bands per primer combination per sample were produced No AFLP fragment was produced from 11 primer combinations, 43 combinations produced 204 fragments, with an averrage of 4.74 bands per combination The level of intraspecific genetic diversity is low, 1.35% Comparison of AFLP polymorphism between two extremes groups of weight, eight AFLP fragments markedly differing... markers without probe or previous sequence information AFLP bands can be genetically linked to a given trait or phenotype and are typically inherited in Mendelian fashion The identification of linked AFLP loci and subsequent conversion to simple codominant locus-specific markers represents a useful tool for marker assisted selection In order to develop AFLP markers to assist fish famers in selective breeding... 121, 185-199 6 Liu, Z.J., A.P Nichols, P Li., R.A Dunham (1998) Inheritance and usefulness of AFLP markers in channel catfish (Ictalurus punctatus), blue catfish (Ictalurus furcatus), and their F1, F2, and backcross hybrids Mol Gen Genet 258, 260-268 7 L Cường (2003) Cá tra, ba sa được xét thưởng xuất khẩu Báo Người Lao Động, 4-11-2003 VL 8 Waldbieser, G.C., B.G Bosworth., D.J Nonneman., W.R Wolters... cấp mẫu cá tra Công trình được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí của chương trình Khoa học Công nghệ KC 04-01 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Bassam, B.J., G Caerano-Anolles., P.M Greshoff (1991) Fast and sensitive silver staining of ADN in polyacrylamide gels Anal Biochem 196, 80 2 Darvasi, A., M Soller (1994) Selective ADN pooling for determination of linkage between a molecular marker and a quantitative trait... 1365-1373 3 Fetzner, J W., Jr (1999) Extracting high quality DNA from shed reptile skins: A simplified method Biotechnique 26(6), 1052-1054 4 Hogan, S.Z., P.B May (2002) Twenty-seven new microsatellites for the migratory Asian catfish family Pangasiidae Molecular Ecology 2, 38-41 5 Lander, E.S., D Botstein (1989) Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps Genetics... 50%) were found Out of which 2 fragments (AF 6-1 and AF 7-4) are more stable and highly reproducible These bands will be identified and use to screen on individuals samples Người thẩm định nội dung khoa học: TS Nguyễn Kim Độ . SO SÁNH ĐA HÌNH AFLP GIỮA HAI NHÓM CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) CÓ TRỌNG LƯỢNG PHÂN BIỆT. Nguyễn Thu Thuý, Nguyễn Thị Diệu Thuý, Nguyễn Văn Cường Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa. E-ACA/M-CAG giữa 2 nhóm cá lớn và nhỏ được thể hiện ở hình 1. Hình 1. Đa hình AFLP giữa nhóm cá lớn và nhóm cá nhỏ của tổ hợp mồi E-ACA/M-CAG 1,2: Băng AFLP xuất hiện ở cả 2 nhóm cá với tần. định các chỉ thị liên quan tính trạng có ý nghĩa kinh tế. So sánh đa hình AFLP giữa 2 nhóm cá tra có trọng lượng 2 cực cho thấy 8 băng AFLP có tần số khác biệt trên 50%. Tuy nhiên chỉ có 2