Bộ y tế Viện dinh dỡng ===== ===== Báo cáo nghiệm thu đề tài nghiên cứu cấp Viện Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) tối u hoá các điều kiện phân tích một số acid amin trong cá Cơ sở quản lý: Cấp cơ sở Chủ nhiệm đề tài: Thạc sỹ Lê Thị Hồng Hảo Nơi thực hiện: Khoa Hóa - ATVSTP 5750 05/4/2006 Hà Nội, tháng 12 - 2005 I. Đặt vấn đề Acid amin là một thành phần quan trọng của cơ thể. Acid amin tạo nên tế bào, phục hồi mô, tạo nên các kháng thể chống lại vi khuẩn và virut. Acid amin là một phần của ezim và hệ thống hocmon. Nó tạo nên ARN (acid ribo nucleic), AND (acid deoxi nucleic) vận chuyển oxi đi khắp cơ thể và tham gia vào hoạt động của các cơ. Acid amin đợc cung cấp cho cơ thể từ thực phẩm dầu protein. Protein khi vào cơ thể đợc chuyển hoá thành 22 acid amin, trong đó có 8 acid amin thiết yếu không đợc tạo ra từ cơ thể, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenyllalanine, threonine, tryptophan và valine. Sự thiếu hụt acid amin dẫn đến cơ thể mệt mỏi, hạ đờng huyết, dị ứng [9]. Giá trị của một loại thức ăn không những phụ thuộc vào số lợng chất đạm có trong thức ăn ấy mà còn phụ thuộc vào số lợng và tỷ lệ cân đối các acid amin, nghĩa là chất lợng của protein thức ăn. Ngoài ra đối với các nớc đang trên đà phát triển, thức ăn động vật mà protein có chất lợng tốt còn cha đủ, thì việc phân tích các acid amin cần thiết trong thức ăn thực vật lại càng cần thiết. Nó giúp ta phơng hớng phối hợp các thức ăn với nhau để nâng cao chất lợng của protein trong khẩu phần. Vì vậy xác định các acid amin trong thực phẩm là rất cần thiết. Sự cần thiết của protein với cơ thể ngời đã đợc nghiên cứu hàng thập kỷ qua. Nhu cầu protein và acid amin cần thiết cho cơ thể đợc công bố đầu tiên vào năm 1973 và liên tục đợc bổ sung vào năm 1975 và sau đó là 1977 bởi FAO (Tổ chức lơng thực và thực phẩm thế giới), WHO (Tổ chức Y tế thế giới) và NRC (Hội đồng nghiên cứu quốc tế) [5]. Để liên tục có đợc các công bố về nhu cầu protein và acid amin cho cơ thể từ lâu trên thế giới đã áp dụng nhiều phơng pháp phân tích hàm lợng protein và acid amin trong thực phẩm nh: sắc ký giấy, sắc ký lỏng, sắc ký khí, định lợng vi sinh, quy trình ngày càng hoàn thiện và đợc áp dụng nhiều kỹ thuật mới. 1 II. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Tìm các điều kiện tối u để phân tích acid amin trong cá bằng phơng pháp sắc ký lỏng cao áp. 2.2. áp dụng và ổn định phơng pháp phân tích một số acid amin trên 5 loại cá nớc biển và 5 loại cá nớc ngọt thông dụng trên thị trờng phục vụ cho khảo sát nguồn thực phẩm dầu acid amin, đặc biệt trong cá của Việt Nam. III. Phơng pháp nghiên cứu 3.1. Hoá chất thuốc thử Tất cả các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại hoá chất tinh khiết phân tích. Acetonitril, natri borat, acid clohydric của hãng Merk (Đức), chất dẫn suất 6-aminoquinoline, hỗn hợp chuẩn 17 acid amin của hãng Waters (Mỹ), chất chuẩn đơn từng acid amin của hãng Prolabo (Pháp). 3.2. Hệ thống sắc ký lỏng Hệ thống sắc ký lỏng đợc sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi là hệ thống acid amin với các detector PAD 2996, huỳnh quang 2475 và bộ bơm mẫu tự động của hãng Water (Mỹ). Cột sắc ký sử dụng là Symmetry acid amin RP18 (150mm x 4,6mm x 3,5àm) và cột Symmetry Shield RP18 (150mm x 4,6mm x 5àm) của hãng Water. Thành phần pha động gồm đệm borat, acetonitril, nớc cất tinh khiết chạy theo gradie. Tốc độ dòng là 1ml/phút và nhiệt độ cột là 35 o C. Các acid amin đợc định lợng bằng detector huỳnh quang với bớc sóng kích thích 340nm và bớc sóng phát xạ 450nm. 3.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn Chuẩn hỗn hợp (17 acid amin) đợc pha từ dung dịch có chứa 2,5 mmol/àl cho tất cả các amino acid và 1,25 mmol/àl đối với cystine trong HCl 20 mmol để đợc dung dịch chuẩn làm việc có chứa 100pmol/àl đối với 17 acid amin và 50 pmol/àl đối với cystein. Dung dịch chuẩn làm việc đợc bảo quản trong lọ màu sẫm bảo quản bằng tủ lạnh âm sâu -20 0 C dùng đợc trong vòng 1 tháng. Các chuẩn đơn đợc hoà tan trong nớc và bảo quản trong môi trờng acid với các điều kiện tơng tự nh chuẩn hỗn hợp. 3.4. Chuẩn bị mẫu cá 2 Mẫu nghiên cứu gồm 10 loại cá đại diện cho 50 mẫu cá: 5 loại cá nớc ngọt (trắm, trôi, cá quả, rofi, chép); 5 loại cá nớc mặn (thu, nục, cá chim trắng, cá hồng, cá cam). Mẫu đợc lấy ngẫu nhiên bằng cách mua tại 5 chợ lớn tại Hà Nội, mỗi mẫu mua ít nhất 3 con, đa về phòng thí nghiệm trong thời gian không quá hai giờ. ở phòng thí nghiệm mẫu đợc phân loại, lọc lấy phần ăn đợc (loại bỏ phủ tạng, vẩy, vây, xơng), sau đó mẫu đợc xay nhiễn, làm đồng nhất và tiến hành thuỷ phân ngay trong ngày lấy mẫu, phần mẫu lu cho vào hộp sạch bảo quản trong tủ lạnh âm sâu -20 o C. 3.5. Thuỷ phân mẫu Theo một số tác giả [3, 4, 7] phơng pháp chủ yếu dùng để thuỷ phân tách các acid min ra khỏi thực phẩm là thuỷ phân trong môi trờng acid clohydric có nồng độ cao. Quy trình thuỷ phân và phân tích mẫu nh sau: Loại không khí bằng nitơ, hàn kín ống Tạo dẫn suất Xác định bằng sắc ký lỏng pha ngợc, Detector huỳnh quang và PDA Định mức bằn g HCl 20 mmol Để n g uội, đuổi HCl d tron g môi trờng chân không ủ ở nhiệt độ thích hợp 125 o C Cho vào ống nghiệm thành dày + HCL 15% Cân chính xác 1g mẫu đã xử lý 3 IV. Kết quả và bàn luận 4.1. Khảo sát các điều kiện phân tích 4.1.1. Khảo sát các loại dẫn suất acid amin Để xác định đợc một số acid amin trong thực phẩm dựa trên những điều kiện thí nghiệm sẵn có của phòng thí nghiệm Viện Dinh dỡng, chúng tôi đã tiến hành dẫn suất các acid amin chuẩn bằng OPA (ortho-phtalaldehyt) [hình 1] và dẫn suất bằng AMQ (6-aminoquinolin) [hình 2], qua khảo sát chúng tôi thấy dẫn suất bằng OPA chỉ tách đợc 15 acid amin, còn dẫn suất bằng AMQ tách đợc 17 acid amin và NH 3 với độ ổn định cao, nên trong nghiên cứu chúng tôi chỉ tiến hành dẫn suất bằng AMQ. Hình 1: Tách 15 acid amin bằng dẫn suất OPA Hình 2: Tách 17 acid amin bằng dẫn suất AMQ 4.1.2. Khảo sát các điều kiện trên sắc ký lỏng Để thực hiện một trong những nhiệm vụ quan trọng nhất của đề tài là tách và xác định đợc acid amin, kỹ thuật đợc lựa chọn là HPLC. Kỹ thuật 4 này đang là những kỹ thuật đợc phát triển nhất hiện nay trên thế giới có hiệu quả tách cao, độ chính xác cao cũng nh có thể tự động hoá đợc trong trờng hợp phân tích hàng loạt. Trong kỹ thuật HPLC ba vấn đề lớn cần tối u hoá là: Chọn cột tách: sử dụng cột pha ngợc. Cột sắc ký sử dụng là Symmetry acid amin RP18 (150mm x 4,6mm x 3,5àm) và cột Symmetry Shield RP18 (150mm x 4,6mm x 5àm) của hãng Water. Qua kết quả chạy thử mẫu chuẩn cho thấy pic chạy ra với cột Symmetry Shield RP18 không tách đợc các acid amin nên chúng tôi chọn cột Symmetry acid amin RP18 để tiến hành phân tích mẫu. Nghiên cứu tối u hoá pha động. Sau khi đã tham khảo các tài liệu và chạy thử, pha động chúng tôi lựa chọn là đệm borat, acetonitril, nớc với tỉ lệ chạy theo bảng gradien nh sau: Bảng 1: Tỷ lệ thành phần pha động Thời gian (Phút) Tốc độ dòng (ml/phút) % Borat % Acetonitril % H 2 O Nền 1,0 100 0 0 0,5 1,0 99 1 0 18,0 1,0 95 5 0 19,0 1,0 91 9 0 29,5 1,0 83 17 0 33,0 1,0 0 60 40 36,0 1,0 100 0 0 65,0 1,0 0 60 40 100,0 1,0 0 60 40 Detector: Sử dụng detector PDA và huỳnh quang là hai loại detector phổ biến, có độ nhạy cao. Qua khảo sát độ phát hiện của các acid amin bằng detecto huỳnh quang nhạy hơn nhiều so với detector PAD, nên chúng tôi chọn sử dụng detector PAD để định tính (kiểm tra lại từng dạng phổ của từng pic acid amin đơn lẻ) còn để định lợng chúng tôi sử dụng detector huỳnh quang với bớc sóng kích thích 340nm và bớc sóng phát xạ 450nm. 4.1.3. Các điều kiện thuỷ phân mẫu Để thuỷ phân các sản phẩm chứa acid amin có nhiều phơng pháp, tuỳ theo đặc tính của từng mẫu thử, tuỳ theo mục đích định tính hay định lợng. 5 + Thuỷ phân bằng acid + Thuỷ phân bằng kiềm + Thuỷ phân bằng acid mạnh có mặt chất trao đổi ion + Thuỷ phân bằng men. Trong đề tài nghiên cứu này, của chúng tôi sử dụng phơng pháp thuỷ phân bằng acid. Trong quá trình thuỷ phân, yếu tố ảnh hởng nhiều nhất đến kết quả của mẫu phân tích là nhiệt độ thuỷ phân và thời gian thuỷ phân. * Khảo sát nhiệt độ ảnh hởng đến quá trình thuỷ phân: + Chuẩn bị dung dịch để khảo sát: Chuẩn bị một hỗn hợp chuẩn các acid amin (gồm 17 loại acid amin) bao gồm bảy dung dịch chuẩn có cùng nồng độ; với nền là một loại cá: 7 mẫu cá không thêm chuẩn và 7 mẫu cá thêm chuẩn. + Tiến hành khảo sát: Để khảo sát nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân acid amin chúng tôi khảo sát trên một dãy mẫu với nồng độ hỗn hợp chuẩn acid amin và mẫu cá đợc thêm chuẩn nh nhau, môi trờng HCl 6N, nhng nhiệt độ thuỷ phân khác nhau (110, 115, 120, 125, 130, 135, 140 o C) sau mỗi điều kiện nhiệt độ khác nhau mẫu đợc đem đo. Theo khảo sát của chúng tôi, nhiệt độ có ảnh hởng rõ rệt đến quá trình thuỷ phân mẫu. Không chỉ ảnh hởng đến hiệu suất thu hồi (Kết quả khảo sát yếu tố này đợc trình bầy ở bảng 2). Với điều kiện nhiệt độ cha đủ để phá vỡ các chuỗi peptit thì chúng ta còn không thể tách đợc riêng biệt từng acid amin (ví dụ hình 3). Hình 3: ảnh hởng của nhiệt độ thuỷ phân đến tách các acid amin 6 Bảng 2: ảnh hởng của nhiệt độ đến hiệu suất thuỷ phân của acid amin (Lysine) trong cá Các điều kiện 1 2 3 4 5 6 7 Nhiệt độ ( o C) 110 115 120 125 130 135 140 Hàm lợng biết trớc ( àg/ml) 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 Hàm lợng tính đợc ( àg/ml) 4,0946 4,532 5,3170 5,3008 5,2799 5,2997 5,3093 Hiệu suất 76,58 84,76 99,45 99,14 98,75 99,12 99,32 Kết quả bảng 2 cho thấy nhiệt độ từ 120 O C hiệu suất phản ứng đã đạt đợc là cao nhất. Nên chúng tôi chọn 125 O C để làm nhiệt độ thuỷ phân mẫu. * Khảo sát thời gian ảnh hởng đến quá trình thuỷ phân: Để khảo sát ảnh hởng của thời gian đến khả năng thuỷ phân acid amin, chúng tôi khảo sát trên một dãy chuẩn acid amin và mẫu cá đợc thêm chuẩn nh nhau, môi trờng HCl 6N, nhiệt độ thuỷ phân nh nhau 125 o C, nhng thời gian thuỷ phân khác nhau (16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 giờ). Kết quả khảo sát chỉ ra ở bảng 3. Bảng 3: ảnh hởng của thời gian thuỷ phân đến hiệu suất thuỷ phân của acid amin (Lysine) trong cá. 7 Các điều kiện 1 2 3 4 5 6 7 Thời gian (giờ) 16 18 20 22 24 26 28 Hàm lợng biết trớc ( àg/ml) 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 Hàm lợng tính đợc ( àg/ml) 5,859 4,365 4,685 5,312 5,3083 5,3152 5,2938 Hiệu suất 109,58 81,64 87,63 99,35 99,28 99,41 99,01 Kết quả bảng 3 cho thấy thời gian thuỷ phân 22 giờ trở lên hiệu suất phản ứng thu đợc là tốt nhất. Chúng tôi đã chọn 24 giờ để tiến hành thuỷ phân mẫu. Khi thời gian thuỷ phân cha đủ, các acid amin trong mẫu cũng không tách đợc ra khỏi nhau (ví dụ hình 4). Hình 4: ảnh hởng của nhiệt độ thuỷ phân đến tách các acid amin 4.2. Đánh giá phơng pháp 4.2.1. Xác định khoảng tuyến tính Để tiến hành xác định khoảng tuyến tính của phơng pháp phân tích, chúng tôi pha một dãy chuẩn có nồng độ từ 0,1 đến 100(àg/ml) cho 17 acid amin, từ 0,05 đến 50(àg/ml) đối cystine và tiến hành đo cho tất cả các acid amin. Kết quả cho thấy đồ thị tuyến tính trong khoảng 0,5 đến 100 (àg/ml) cho 17 acid amin, còn 0,1 đến 50(àg/ml) đối cystine với hệ số tơng quan đạt đợc từ 0,997 đến 0,9998 cho tất cả các acid amin. 4.2.2. Độ lặp lại của phơng pháp 8 Để khảo sát độ lặp lại của phơng pháp, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm trên 2 loại cá. Mỗi loại cá tiến hành phân tích trên 6 mẫu. 1 )( 1 2 2 = = n mtbmi S n i Độ lệch chuẩn đợc tính theo công thức sau: Độ lệch chuẩn tơng đối đợc tính theo công thức sau: RSD = s*100/X TB 9 [...]... tại Bảng 9 cho thấy, trong thành phần của cá có đủ các acid amin cần thiết cho cơ thể Trong 5 loại cá nớc ngọt cá Rôfi cho thấy có tổng hàm lợng các acid amin cao nhất 19,52 g%, thấp nhất là cá trắm 6,12 g% Trong cá trôi acid aspartic, Serine, Glycine, hàm lợng quá nhỏ không xác định đợc Hình 6: Sắc đồ các acid amin trong mẫu cá thu 13 Bảng 10: Kết quả phân tích acid amin trong cá nớc mặn (g/100g) TT... tổng các acid amin trong cá 14 nớc mặn nằm trong khoảng 13-21g%, không có loại acid amin nào không xác định thấy Trong 5 loại cá nớc mặn đợc nghiên cứu, cá nục cho hàm lợng amino acid cao nhất 20,74 g%, sau đó là cá thu 18,20 g%, thấp nhất là cá chim trắng 13,94 g% So sánh bảng 2 với bảng 1 cho thấy hàm lợng amino acid trong cá nớc mặn cao hơn trong cá nớc ngọt 15 V Kết luận 5.1 Kết quả nghiên cứu đã... các điều kiện phân tích phù hợp để định lợng các acid amin trong cá nh sau: Quy trình thuỷ phân sử dụng phơng pháp thuỷ phân trong môi trờng acid Chạy gradien với hỗn hợp dung môi là đệm borat:acetonitril:nớc Tốc độ dòng: 1ml/phút; nhiệt độ buồng cột 35OC Detector huỳnh quang với bớc sóng kích thích 340nm và bớc sóng phát xạ 450nm 5.2 Hàm lợng các acid amin trong cá Qua kết quả phân tích acid amin. .. amin trong 10 loại cá (5 loại nớc ngọt, 5 loại nớc mặn) cho thấy: Trong cá nớc ngọt hàm lợng tổng acid amin từ 6,12- 19,52 g/100g, cá Rôfi có tổng hàm lợng các acid amin cao nhất (19,52 g%), thấp nhất là cá trôi 8,2 g% Hàm lợng tổng các acid amin trong cá nớc mặn nằm trong khoảng 1321g%, không có loại acid amin nào không xác định thấy Cá nục cho hàm lợng acid amin cao nhất 20,74 g%, sau đó là cá thu... đợc hiệu suất thu hồi thấp Do đó có thể kết luận, phơng pháp này cho phép xác định hàm lợng Lysinee từ 0,5(àg) trở lên Nên khi tiến hành phân tích nên lấy lợng mẫu sao cho hàm lợng acid amin lớn hơn 0,5(àg) để có sai số thấp 4.3 Kết quả phân tích 18 acid amin trên các loại cá Bảng 9 và bảng 10 thể hiện hàm lợng trung bình các acid amin trong mẫu cá nớc ngọt và cá nớc mặn n=5 Hình 5: Sắc đồ các acid amin. .. g%, thấp nhất là cá chim trắng 13,94 g% Nhìn chung hàm lợng acid amin trong cá nớc mặn cao hơn trong cá nớc ngọt Nh vậy ăn cá là rất tốt cho cơ thể, không chỉ là một nguồn thực phẩm cung cấp hàm lợng protein cao mà chất lợng của protit trong thịt cá là rất tốt Đặc biệt hàm lợng cholesterol trong cá là không đáng kể, mỡ cá giúp ngăn ngừa đợc rất nhiều bệnh tật VI khuyến nghị Nhằm nâng cao chất lợng dinh... đợc rất nhiều bệnh tật VI khuyến nghị Nhằm nâng cao chất lợng dinh dỡng của cuộc sống góp phần đảm bảo sức khoẻ ngời tiêu dùng chúng tôi có một vài kiến nghị sau: Tiếp tục phân tích xác định hàm lợng các acid amin trong các đối tợng thực phẩm khác để cung cấp số liệu hoàn thiện Bảng thành phần Việt Nam Giúp tuyên truyền các loại thực phẩm chất lợng cho ngời tiêu dùng Hà nội, ngày 26 tháng 12 năm 2005... 1,705 1,855 2,982 8,384 2,053 6,375 3,913 2,860 5,216 Bảng 5: Kết quả độ lặp lại thời gian lu trong mẫu cá quả Các thông số Aspartic acid Serine Glutamic acid Glycine Histidine NH3 Arginine Threonine Alanine Proline Cysteine Tyrosine Valine Methionine Lysine Isoleucine Leucine Phenylalanine 1 2 3 4 5 6 % Các acid amin % % % % % 13,661 15,12 15,935 17,194 18,294 19,533 21,085 21,308 21,928 23,250 26,647...Bảng 4: Kết quả về độ lặp lại hàm lợng trong mẫu cá quả Aspartic acid Serine Glutamic acid Glycine Histidine NH3 Arginine Threonine Alanine Proline Cysteine Tyrosine Valine Methionine Lysine Isoleucine Leucine Phenylalanine 1 2 3 % Các acid amin Các thông số 4 5 6 N % % % % % 0,721 0,795 1,234 1,860 0,656 0,865 1,870 0,873 0,628 0,734 0,239 0,939... amin trong mẫu cá quả 12 Bảng 9: Kết quả phân tích acid amin trong cá nớc ngọt (g/100g) TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Tên đầy đủ Viết tắt Aspartic acid Serine Glutamic acid Glycine Histidine NH3 Arginine Threonine Alanine Proline Cysteine Tyrosine Valine Methionine Lysine Isoleucine Leucine Phenylalanine Tổng ASP Ser Glu Gly His NH3 Arg Thr Ala Pro Cys Tyr Val Met Lys lle Leu Phe Cá . Báo cáo nghiệm thu đề tài nghiên cứu cấp Viện Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) tối u hoá các điều kiện phân tích một số acid amin trong cá . nh: sắc ký giấy, sắc ký lỏng, sắc ký khí, định lợng vi sinh, quy trình ngày càng hoàn thiện và đợc áp dụng nhiều kỹ thuật mới. 1 II. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Tìm các điều kiện tối u để phân. để phân tích acid amin trong cá bằng phơng pháp sắc ký lỏng cao áp. 2.2. áp dụng và ổn định phơng pháp phân tích một số acid amin trên 5 loại cá nớc biển và 5 loại cá nớc ngọt thông dụng trên