CÔNG NGHỆ LÊN MEN KHÁNG SINH PENICILLIN – PHẦN 2.1 ĐIỂM LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ SẢN XUẤT PENICILLIN - Phát tình cờ vào năm 1928 Alexander Fleming, nhận thấy hộp petri nuôi Staphylococcus bị nhiễm nấm mốc Penicillium notatum có xuất hiện tượng vòng vi khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm Ông sử dụng tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất kháng sinh (1929) Mỹ triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men bề mặt (1931) Tuy nhiên, khoảng thời gian nỗ lực nhằm tách tinh chế penicillin từ dịch lên men thất bại khơng bảo vệ hoạt tính kháng sinh chế phẩm tinh chế vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên Năm 1938 Oxford, tìm lại tài liệu khoa học công bố, Ernst Boris Chain quan tâm đến phát minh Fleming ông đề nghị Howara Walter Florey cho tiếp tục triển khai nghiên cứu Ngày 25/05/1940 penicillin thử nghiệm thành công chuột 1942: tuyển chọn chủng công nghiệp Penicillium chrysogenum NRRL 1951 (1943) sau biến chủng P chrysogenum Wis Q - 176 (chủng xem chủng gốc hầu hết chủng công nghiệp sử dụng tồn giới ); thành cơng việc điều chỉnh đường hướng trình lên men để lên men sản xuất penicillin G (bằng sử dụng tiền chất Phenylacetic, 1944) Hình 2.1 Các tác giả giải thưởng Nobel y học năm 1945 cơng trình penicillin Penicillin xem loại kháng sinh phổ rộng, ứng dụng rộng rãi điều trị sản xuất với lượng lớn số chất kháng sinh biết Chúng tác dụng lên hầu hết vi khuẩn Gram dương thường định điều trị trường hợp viêm nhiễm liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, thí dụ viêm màng não, viêm tai - mũi - họng, viêm phế quản, viêm phổi, lậu cầu, nhiễm trùng máu Thời gian đầu penicillin ứng dụng điều trị hiệu Tuy nhiên, vài năm sau xuất trường hợp kháng thuốc tượng ngày phổ biến Vì 1959, Batchelor đồng nghiệp tách axit 6aminopenicillanic Đây nguyên liệu để sản xuất hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Ngày giới sản xuất 500 chế phẩm penicillin ( lên men trực tiếp hai sản phẩm penicillin V penicillin G) tiếp tục triển khai để sản xuất chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Hình 2.2: Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum 2.2 CƠ SỞ CÔNG NGHỆ SINH TỔNG HỢP PENICILLIN NHỜ NẤM MỐC: 2.2.1 Lịch sử tuyển chọn chủng công nghiệp P chrysogenum : Vào năm đầu, việc nghiên cứu sản xuất penicillin thường sử dụng chủng có hoạt lực cao thuộc lồi P notatum P baculatum Nhưng từ trường đại học Wisconsin (Mỹ) phân lập chủng P.chrysogenum có hoạt tính cao chủng thay từ khoảng sau năm 50 kỷ XX đến tất công ty sản xuất penicillin giới sử dụng biến chủng P.chrysogenum công nghiệp - Việc tuyển chọn chủng công nghiệp để lên men sản xuất penicillin nguyên tắc trải qua sáu giai đoạn mô tả mục 1.3.1, giải pháp kỹ thuật áp dụng hiệu để thu nhận biến chủng "siêu tổng hợp" penicillin lại kỹ thuật gây đột biến thường như: xử lý tia Rơn ghen, xử lý tia cực tím tạo đột biến hố chất, thí dụ Metylbis - amin (metyl -2--clo- etylamin), N-mustar (tris - -clo- etylamin), Sarcrolyzin, HNO2, Dimetylsulfat, 1,2,3,4 -diepoxybutan 2.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp penicillin nấm mốc P chrysogenum : Theo quan điểm phổ biến nay, trình sinh tổng hợp penicillin nấm mốc P chrysogenum tóm tắt sau: từ ba tiền chất ban đầu - aminoadipic, cystein valin ngưng tụ lại thành tripeptit  -(- aminoadipyl) cysteinyl - valin ; trình khép mạch tạo vòng -lactam vòng thiazolidin để tạo thành izopenicillin-N; trao đổi nhóm -aminoadipyl với phenylacetic (hay phenooxyacetic) tạo thành sản phẩm penicillin G (hay penicillin V, xem sơ đồ tổng hợp penicillin G hình 2.3 Hình 2.3 Sơ đồ chế sinh tổng hợp penicillin từ axit L-aminoadipic, L-cystein L-valin Trong axit amin tiền chất cystein tổng hợp ba đường tổng hợp từ xerin (hình 2.4), từ homoxerin với việc tuần hồn chuyển hóa -cetobutyrat qua oxaloacetat (hình 2.5), hay từ homoxerin với chuyển hóa - cetobutyrat qua izolecin Đồng thời - aminoadipic giải phóng sơ đồ hình 2.6 tuần hồn để tham gia q trình ngưng tụ ban đầu Hình 2.4 Sơ đồ chế sinh tổng hợp cystein từ xerin Hình 2.5 Sơ đồ chế sinh tổng hợp cistein từ homoxerin với biến đổi -cetobutyrat thành oxaloacetat Tuy nhiên, giải phóng tích tụ mơi trường (vì trình lên men sản xuất penicillin V phát thấy dịch lên men lượng lớn - aminoadipic dạng vòng) Như vậy, trình sinh tổng hợp penicillin, phụ thuộc vào điều kiện lên men cụ thể định, xảy theo sáu đường hướng khác Do đó, hiệu suất chuyển hoá chất - sản phẩm biến đổi phụ thuộc vào đường hướng sinh tổng hợp tương ứng Theo lý thuyết hiệu suất lên men khoảng 683 - 1544 UI penicillin/g glucoza; song, thực tế, với chủng có hoạt tính sinh tổng hợp cao đạt khoảng 200 UI/g glucoza Hình 2.6 Sơ đồ chế sinh tổng hợp - aminoadipic Hình 2.7 Sơ đồ chế sinh tổng hợp valin 2.2.3 Tác động thông số công nghệ đến trình sinh tổng hợp penicillin 2.2.3.1 Sự phát triển hệ sợi đặc điểm hình thái hệ sợi nấm: Sự phát triển hệ sợi nấm trình lên men bao gồm: - Sự tăng trưởng kích thước hệ sợi (tăng độ dài sợi, lớn lên kích thước, mức độ phân nhánh hệ sợi ) - Sự biến thiên số lượng khóm sợi nấm mơi trường: Thơng thường, phát triển đánh giá qua hai tiêu là: hàm lượng sinh khối tốc độ biến thiên hàm lượng sinh khối môi trường Hai tiêu xác định nhiều phương pháp khác như: hàm lượng sinh khối (Sinh khối tươi sinh khối khô), mật độ quang dịch lên men, trở lực lọc dịch lên men, hàm lượng nitơ, hàm lượng hydratcacbon, hàm lượng axit nucleic Trong phương pháp trên, áp dụng phổ biến sản xuất công nghiệp phương pháp xác định qua hàm lượng sinh khối Tốc độ phát triển hệ sợi nấm phụ thuộc hàng loạt yếu tố khác q trình lên men tích tụ penicillin thường xảy mạnh mẽ hệ sợi phát triển đạt trạng thái cân Trạng thái xác lập cung cấp vừa đủ liên tục lượng thức ăn tối thiểu cho nấm mốc Thiếu thức ăn, hệ sợi nấm tự phân, cung cấp nhu cầu trên, hệ sợi phát triển, khơng tích tụ mạnh penicillin mà tích tụ nhiều axit gluconic axit malic Đặc điểm hình thái cấu trúc hệ sợi nấm: Trong trình lên men, nhiều nguyên nhân khác nhau, số lượng khóm sợi nấm có xu hướng tăng lên, trình lên men tĩnh Trong điều kiện lên men có sục khí khuấy trộn, tác dụng va đập học với cánh khuấy chuyển động dịng xốy mơi trường, mặt đứt gãy hệ sợi nấm xảy nhiều hệ sợi nấm có xu hướng vón cuộn lại thành cấu trúc búi sợi cuộn xoắn, gọi pellet  Pellet xốp (fluffy loose pellets) dạng pellet có phần bên hệ sợi cuộn thành khối mịn, lớp sợi phía bên ngồi cuộn lỏng lẻo tạo thành cấu trúc xốp  Pellet mịn (compact smooth pellets) có đặc điểm phần sợi phía bên pellet cuộn tương đối chặt chẽ đến gần sát lớp sợi phía ngồi, lớp sợi phía ngồi cuộn đủ thành lớp sợi mịn  Pellet rỗng (hollow pellets) dạng pellet có phần sợi bên bị tự phân tạo thành khoảng rỗng, hệ sợi phía bên ngồi cuộn chặt thành lớp sợi mịn chắn - Hiệu chung q trình lên men có quan hệ hữu với số lượng, kích thước cấu trúc pellet nấm Trong thực tiễn sản xuất công nghiệp, người ta thường điều chỉnh thông số công nghệ theo hướng ưu tiên tạo dạng pellet đủ nhỏ mịn, hạn chế tạo pellet xốp ngăn ngừa hình thành pellet rỗng Điều kiện công nghệ tương ứng với mục tiêu thường áp dụng : tỉ lệ giống 10%, với mật độ dịch giống (2-10).1011 bào tử /m3; phối hợp điều chỉnh sục khí khuấy trộn để đảm bảo cung cấp oxy hòa tan dư so với nhu cầu tương ứng với thời điểm lên men, để tạo pellet mịn nhỏ (kích thước pellet thích hợp khoảng 0,2 - 0,5mm), điều kiện cân nhu cầu tiết kiệm mức tiêu tốn lượng khuấy trộn 2.2.3.2 Đặc tính nhiệt động dịch lên men: Trong thiết bị lên men dung tích lớn có sục khí khuất trộn, thực tế khơng thể xác lập đồng khắp vùng thể tích làm việc thiết bị Tại vùng chảy rối (vùng gần cánh khuấy), tốc độ trao đổi nhiệt, tốc độ chuyển khối xảy mạnh mẽ Còn vùng chảy màng (vùng sát thành thiết bị, vùng gần ống xoắn trao đổi nhiệt, vùng hiệu hay vùng chết thiết bị…) tốc độ chuyển khối hay tốc độ truyền nhiệt giảm Ngoài ra, khu vực định thiết bị xuất vùng xốy cục hay dòng chảy thứ cấp làm thiếu hụt hàm lượng oxy hòa tan Các yếu tố nêu tác động trực tiếp đến lực sinh tổng hợp chủng, hiệu chuyển hóa tạo sản phẩm hiệu kinh tế chung tồn q trình lên men Thực tế thường chọn chế độ khuấy trộn dư mức yêu cầu 2.2.3.3 Thành phần môi trường lên men: Môi trường sở để lên men penicillin, vào thời kỳ đầu năm 40 - 50, môi trường lactoza - nước chiết ngô, với thành phần nêu bảng 2.1 Nguồn chất chính: lactoza thay phần tồn chất khác như: loại đường hexoza, đường pentoza, disaccarit, dextrin hay thay dầu thực vật Trong chất nêu trên, hiệu cao glucoza Ngoài ra, sử dụng dầu thực vật làm chất phá bọt phải xét đến hiệu ứng nấm mốc sử dụng phần dầu thực vật làm nguồn cung cấp thức ăn cacbon, để tính tốn điều chỉnh nồng độ glucoza mơi trường lên men (và cản trở trình chuyển khối ảnh hưởng dầu phá bọt) Nguồn cung cấp thức ăn nitơ: sử dụng bột đậu tương, bột hạt bông, loại dầu cám Nhu cầu thức ăn nitơ đáp ứng cách cung cấp liên tục (NH4)2SO4, trì nồng độ thấp, khoảng 250 - 340g/l (nếu dư thừa hiệu sinh tổng hợp penicillin giảm, thiếu xảy tượng tự phân hệ sợi) Hàm lượng chất khoáng bổ sung: tính tốn, phụ thuộc vào lượng dịch chiết ngơ sử dụng; pH môi trường điều chỉnh trước trùng, sau suốt q trình lên men giám sát chặt chẽ điều chỉnh theo yêu cầu cơng nghệ Nồng độ tiền chất tạo nhánh:Trong q trình sinh tổng hợp penicillin, việc kết gắn mạch nhánh phân tử penicillin khơng mang tính đặc hiệu chặt chẽ Nhờ vậy, trì nồng độ tiền chất tạo nhánh cần thiết phenylacetat (hoặc phenooxyacetat) cho phép thu nhận chủ yếu loại penicillin G dịch lên men (hoặc penicillin V) Theo lý thuyết, nhu cầu phenylaceta 0,47g/gam penicillin G (hoặc phenooxyacetat 0,50g/gam penicillin V ) Cần ý hai cấu tử thực chất gây độc cho nấm nên người ta thường lựa chọn giải pháp bổ sung liên tục cấu tử khống chế chặt chẽ nồng độ theo yêu cầu, để không làm suy giảm lực lên men chủng sản xuất 2.2.3.4 Điều kiện tiến hành lên men: Nhiệt độ thơng số có ảnh hưởng lớn đến phát triển nấm mốc, khả sinh tổng hợp lực tích tụ penicillin chúng Nhìn chung nấm mốc phát triển thuận lợi dải nhiệt độ khoảng 300C Tuy nhiên, ở dải nhiệt độ tốc độ phân huỷ penicillin xảy mạnh mẽ Trong thực tế, giai đoạn nhân giống sản xuất người ta thường nhân dải nhiệt độ 30 0C; sang giai đoạn lên men thường áp dụng hai chế độ nhiệt :  Lên men dải nhiệt độ: Thường trì nhiệt độ suốt trình lên men dải nhiệt độ 25 - 270C  Lên men hai chế độ nhiệt độ: Giai đoạn lên men bắt đầu tiến hành 300C hệ sợi phát triển đạt yêu cầu hàm lượng sinh khối điều chỉnh nhiệt độ sang chế độ lên men penicillin dải nhiệt độ 22 - 250C (có cơng nghệ điều chỉnh xuống 22 - 230C, giữ nhiệt độ tiếp hai ngày chuyển sang lên men tiếp 250C kết thúc trình lên men) pH môi trường thuận lợi cho phát triển hệ sợi cho trình sinh tổng hợp penicillin thường dao động khoảng pH = 6,8 - 7,4 Tuy nhiên điều kiện pH cao xu hướng phân huỷ penicillin tăng lên Vì vậy, sản xuất pH môi trường thường khống chế chặt chẽ giá trị lựa chọn khoảng pH = 6,2 - 6,8 Nồng độ oxy hoà tan cường độ khuấy trộn dịch lên men: Với nhiều chủng nấm mốc, nồng độ oxy hịa tan thuận lợi cho q trình sinh tổng hợp penicillin dao động quanh mức 30% nồng độ oxy bão hòa Nồng độ CO2 dịch lên men mức định cần thiết cho trình nảy mầm bào tử nấm mốc; nhiên nồng độ CO2 cao làm cản trở q trình hấp thu chuyển hố chất chủng, nghĩa làm làm cản trở trình sinh tổng hợp penicillin 2.2.3.5 Sự tích tụ phân huỷ penicillin: Trong trình lên men, nhiều nguyên nhân khác nhau, có ảnh hưởng nồng độ penicillin tích tụ mơi trường ngày tăng, làm cho lực sinh tổng hợp penicillin chủng có xu hướng giảm dần theo thời gian lên men Đồng thời, phụ thuộc vào nhiệt pH môi trường, phần lượng penicillin tích tụ bị phân huỷ theo thời gian Nhằm giảm tổn thất trên, sau kết thúc trình lên men cần xử lý thu sản phẩm sớm có giải pháp hạ thấp nhanh nhiệt độ dịch lên men  ... thành công việc điều chỉnh đường hướng trình lên men để lên men sản xuất penicillin G (bằng sử dụng tiền chất Phenylacetic, 19 44) Hình 2 .1 Các tác giả giải thưởng Nobel y học năm 19 45 cơng trình penicillin. .. nghiên cứu Ngày 25/05 /19 40 penicillin thử nghiệm thành công chuột 19 42: tuyển chọn chủng công nghiệp Penicillium chrysogenum NRRL 19 51 (19 43) sau biến chủng P chrysogenum Wis Q - 17 6 (chủng xem chủng... hợp khác Hình 2.2: Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum 2.2 CƠ SỞ CÔNG NGHỆ SINH TỔNG HỢP PENICILLIN NHỜ NẤM MỐC: 2.2 .1 Lịch sử tuyển chọn chủng công nghiệp P chrysogenum :