1 CÁC KỸ THUẬT TÁCH SẮC KÝ Các kỹ thuật tách sắc ký là những phương pháp tách trong đó các thành phần của mẫu được phân bố vào hai pha: một pha tĩnh và một pha động. Pha tĩnh có thể là một chất rắn, cũng có thể là một chất lỏng được giữ trên một chất rắn hay một gel. Pha tĩnh có thể được nhồi vào một cột, hoặc trải thành một lớp, hay phân tán thành một lớp phim v.v Pha động có thể là chất khí, chất lỏng hay chất lưu siêu tới hạn (còn được gọi là chất lỏng siêu tới hạn). Sự tách sắc ký có thể dựa trên các cơ chế khác nhau như hấp phụ, phân bố khối lượng (hay phân chia), trao đổi ion, hoặc dựa trên sự khác nhau về các tính chất lý hoá của các phân tử như kích thước, khối lượng, thể tích, v.v… Phụ lục này chỉ đề cập tới các định nghĩa và phép tính các thông số thông thường trong các kỹ thuật sắc ký, các yêu cầu thường được áp dụng cho tính phù hợp của hệ thống sắc ký. Nguyên lý, thiết bị và phương pháp tách được trình bày trong các phương pháp thử chung: - Phương pháp sắc ký giấy (Phụ lục 5.1) - Phương pháp sắc ký khí (Phụ lục 5.2) 2 - Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) - Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) - Phương pháp sắc ký rây phân tử (Phụ lục 5.5) Định nghĩa: Các định nghĩa sau đây được dùng trong các chuyên luận để tính toán các thông số. Một số thiết bị có phần mềm của nhà sản xuất dùng để tính toán một vài thông số như tỷ số tín hiệu trên nhiễu. Trong trường hợp này, người sử dụng có trách nhiệm đảm bảo rằng các phương pháp dùng trong phần mềm đó phù hợp với yêu cầu của dược điển này; nếu không, phải điều chỉnh cho phù hợp. Sắc đồ Sắc đồ là một đồ thị hay một cách trình bày khác mô tả sự thay đổi của đáp ứng của detector (hay nồng độ của chất hay một đại lượng khác dùng làm thước đo nồng độ của chất) theo thời gian, thể tích hay khoảng cách. Một sắc đồ lý tưởng có dạng một chuỗi các pic kiểu Gauss trên một đường nền. Các thông số chỉ sự lưu giữ Thời gian lưu và thể tích lưu 3 Trong sắc ký rửa giải, sự lưu giữ của một chất có thể được biết dưới dạng thời gian lưu t R. Thời gian lưu được xác định trực tiếp trên sắc đồ bởi vị trí của đỉnh pic. Từ thời gian lưu có thể tính được thể tích lưu V R dựa trên công thức: RR tV    Trong đó: R t (thời gian lưu) là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của chất ,  (tốc độ dòng) là lưu lượng của dòng pha động. Hệ số phân bố khối lượng Hệ số phân bố D m còn được gọi là thừa số dung lượng k’ hay thừa số lưu giữ k được định nghĩa và tính theo công thức sau: M S C M S m V V K Q Q 'kD  Trong đó: Q S và Q M lần lượt là lượng chất tan trong pha tĩnh và pha động, V S và V M lần lượt là thể tích pha tĩnh và pha động, K C là hệ số phân bố cân bằng, còn gọi là hằng số phân bố. 4 Hệ số phân bố khối lượng của một chất có thể xác định từ sắc đồ theo công thức: M MR m t tt 'kD   Trong đó: t R (thời gian lưu hay thể tích lưu), là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của chất . M t (thời gian chết hay thể tích rỗng), là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của một chất không bị lưu giữ. Hệ số phân bố Trong sắc ký trên gel, đặc tính rửa giải của một chất có thể biểu thị dưới dạng hệ số phân bố K o và được tính theo công thức: ot oR o tt tt K    trong đó: t R (thời gian lưu hay thể tích lưu), là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của chất. o t (thời gian chết hay thể tích rỗng), là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của một chất không bị lưu giữ. 5 t t (thời gian lưu hay thể tích lưu), là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của chất có thể tiếp cận đầy đủ các lỗ xốp của pha tĩnh. Thừa số chậm Thừa số chậm R F (còn được gọi là hệ số di chuyển R f ), được dùng trong sắc ký trên mặt phẳng (sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy) đó là tỷ số giữa khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến tâm của vết sắc ký và khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến tuyến dung môi. a b R F  Trong đó: b là quãng đường di chuyển của chất tan, a là quãng đường di chuyển của tuyến dung môi. Các thông số vế sắc ký Pic sắc ký Pic của một chất có thể được xác định bởi diện tích pic (A), hay chiều cao pic (h), và chiều rộng của pic ở nửa chiều cao (w h ) hoặc chiều cao pic (h) và chiều rộng pic ở điểm uốn (w i ). Với các pic dạng Gauss (hình 5.8.1) ta có hệ thức: w h = 1,18 w i 6 Hình 5.8.1 Hệ số đối xứng Hệ số đối xứng (A s ) (hay hệ số kéo đuôi) của một pic Hình 5.8.2 được tính theo công thức: d 2 w A 05,0 S  Trong đó: w 0,05 là chiều rộng của pic ở 1/20 chiều cao của pic, 7 d là khoảng cách từ đường thẳng đứng đi qua đỉnh pic đến cạnh phía trước của pic ở 1/20 chiều cao của pic. Khi A s = 1,0 thì pic hoàn toàn đối xứng (lý tưởng) Hình 5.8.2 Hiệu năng của cột và số đĩa lý thuyết biểu kiến Tuỳ theo kỹ thuật được sử dụng, dựa trên các dữ liệu thu được trong điều kiện đẳng nhiệt, đẳng dòng hay đẳng mật độ, hiệu năng của cột (hay hiệu lực biểu kiến của cột), biểu thị dưới dạng số đĩa lý thuyết biểu kiến (N), có thể tính được theo công thức dưới đây: 2 h R w t 54,5N          trong đó: 8 R t là thời gian lưu hay thể tích lưu hay khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng góc kẻ qua đỉnh pic tương ứng với chất, h w là chiều rộng của pic ở nửa chiều cao pic tính theo cùng đơn vị đo R t (thời gian, thể tích hay khoảng cách). Số đĩa lý thuyết biểu kiến thay đổi theo chất, theo cột cũng như theo thời gian lưu. Các thông số về sự tách sắc ký Độ phân giải Độ phân giải (R S ) giữa hai pic của hai chất được tính theo công thức:   2h1h 1R2R S ww tt18,1 R    Trong đó: 1R t và 2R t là thời gian lưu, hay khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng góc kẻ qua hai đỉnh pic tương ứng với hai chất cạnh nhau, 1h w và 2h w là chiều rộng của hai pic ở nửa chiều cao của pic tương ứng. Độ phân giải lớn hơn 1,5 thì hai pic được tách đến đường nền. Công thức cho ở trên có thể không đúng khi các pic không được tách trên đường nền. 9 Trong sắc ký trên mặt phẳng, thay cho thời gian lưu, người ta sử dụng quãng đường dịch chuyển và độ phân giải được tính theo công thức   2h1h 1F2F S ww RRa18,1 R    Trong đó: 1F R và 2F R là = các thừa số chậm (hay hệ số lưu giữ) của hai chất, 1h w và 2h w = chiều rộng của hai pic ở nửa chiều cao của pic tương ứng. a = quãng đường dịch chuyển của dung môi Công thức này chỉ áp dụng cho trường hợp sắc đồ các vết sắc ký trên mặt phẳng đã được quét và chuyển sang dạng các pic sắc ký. Tỷ số đỉnh-hõm Tỷ số đỉnh-hõm (p/v) có thể được dùng như một thông số của tính phù hợp của hệ thống trong phép thử các tạp chất liên quan khi hai pic không được tách đến đến đường nền (xem hình 5.8.3). v p H H v/p  trong đó: 10 H p = chiều cao của đỉnh pic nhỏ so với đường nền ngoại suy H v = chiều cao của đáy hõm tách hai pic lớn và nhỏ. Hình 5.8.3 Độ lưu giữ tỷ đối Độ lưu giữ tỷ đối (r), còn gọi là thừa số chọn lọc (α), có thể ước lượng theo công thức sau: M1R M2R tt tt r    [...]... phép cho các lần tiêm lặp là 2,0% Yêu cầu này chỉ áp dụng cho các phép định lượng Điều chỉnh các điều kiện sắc ký Để thoả mãn các tiêu chí trong yêu cầu về tính phù hợp của hệ thống, mà không làm thay đổi cơ bản phương pháp, có thể điều chỉnh các thông số sắc ký trong phạm vi nêu trong bảng cho dưới đây để tham khảo Các điều kiện sắc ký đã được thẩm định trong quá trình xây dựng chuyên luận Các phép... yêu cầu về tách cho phép thử hay phép định lượng đạt chất lượng mong muốn Tuy nhiên, vì pha tĩnh chỉ được mô tả một cách chung chung, và trên thị trường lại có nhiều loại pha tĩnh có những đặc tính sắc ký khác nhau, nên có thể cần điều chỉnh một số điều kiện sắc ký để đạt các yêu cầu của tính phù hợp của hệ thống Đặc biệt trong phương pháp sắc ký pha đảo, việc thay đổi các thông số sắc ký không phải... khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của một chất không bị lưu giữ Độ lưu giữ tỷ đối chưa hiệu chính (rG) được tính theo công thức: rG  t R2 t R1 Trừ khi có hướng dẫn khác, các trị giá độ lưu giữ tỷ đối cho trong các chuyên luận là độ lưu giữ tỷ đối chưa hiệu chính Trong sắc ký trên mặt phẳng, các thừa số chậm (hệ số di chuyển) Rf2 và Rf1 được dùng thay cho các. .. tự do Tính phù hợp của hệ thống Các phép thử tính phù hợp của hệ thống là phần không thể thiếu của một phương pháp và được dùng để đảm bảo hệ thống sắc ký có hiệu năng phù hợp Hiệu lực biểu kiến, tỷ số phân bố khối lượng, độ lưu giữ tỷ đối và hệ số đối xứng là những thông số thường được dùng để đánh giá hiệu năng của cột Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến đặc tính sắc ký bao gồm thành phần pha động, sức... thống phải đạt các yêu cầu sau đây: - Hệ số đối xứng của pic chính phải trong khoảng 0,8 -1,5, trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận Yêu cầu này được áp dụng rộng rãi cho các phép thử và định lượng trong các chuyên luận - Độ lệch chuẩn tối đa được phép cho các lần tiêm lặp lại của dung dịch đối chiếu không được vượt quá các trị giá cho trong bảng 5.8.1 Yêu cầu này chỉ áp dụng cho các phép định lượng... kết quả tách thoả đáng Trong trường hợp này, có thể phải thay cột khác cùng loại, ví dụ một cột silicagel gắn C18 khác mà có thể cho kết quả mong muốn Với các thông số quan trọng, việc điều chỉnh được xác định rõ ràng trong chuyên luận để đảm bảo tính phù hợp của hệ thống Nên tránh điều chỉnh nhiều thứ một lúc vì có thể gây tác động tích luỹ trên hiệu năng của hệ thống Sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy... ứng của các tạp chất liên quan phải xấp xỉ đáp ứng của bản thân chất phân tích (hệ số đáp ứng 0,8-1,2), nếu không thì phải dùng hệ số hiệu chỉnh Khi trong chuyên luận có quy định phép thử các tạp chất liên quan là tổng các tạp chất hay khi phải định lượng một tạp chất thì điều quan trọng là phải chọn một ngưỡng thích hợp và các điều kiện thích hợp cho việc lấy tích phân các diện tích pic Trong các phép... thay đổi  1 đơn vị pH khi nghiên cứu các chất trung tính 17 Nồng độ muối trong thành phần đệm của pha động: được thay đổi  10% Thể tích mẫu chấm sắc ký điều chỉnh trong khoảng 10-20% của thể tích quy định nếu sử dụng bản mỏng cỡ hạt nhỏ (2-10 µm) Khoảng dịch chuyển của tuyến dung môi không được dưới 50mm và với bản mỏng hiệu năng cao thì không được dưới 30 mm Sắc ký lỏng Thành phần pha động lượng thành... dạng độ lệch chuẩn tương đối % (RSD%) của của một dãy liên tiếp các kết quả phép tiêm và đo rồi tính theo công thức:     yi  y 100   RSD %   n 1 y 2 Trong đó: yi là các giá trị cá thể dưới dạng diện tích pic hay chiều cao pic hay tỷ số các diện tích trong phương pháp chuẩn hoá,  y là trung bình của các giá trị cá thể, n là số các giá trị cá thể Với một dãy lần tiêm dung dịch đối chiếu, cho... thử như vậy thì ngưỡng bỏ qua (nghĩa là các diện tích pic dưới ngưỡng này không được tính đến) thường là 0,05% Như thế, ngưỡng đặt cho hệ thống thu thập dữ liệu ít nhất phải là nửa ngưỡng bỏ qua Việc lấy tích phân các diện tích pic của các tạp không được tách hoàn toàn khỏi pic chính nên được thực hiện theo phương pháp ngoại suy từ hõm tới hõm (vạch tiếp tuyến) Các pic của dung môi hoà tan mẫu cũng được . 1 CÁC KỸ THUẬT TÁCH SẮC KÝ Các kỹ thuật tách sắc ký là những phương pháp tách trong đó các thành phần của mẫu được phân bố vào hai pha: một. tới các định nghĩa và phép tính các thông số thông thường trong các kỹ thuật sắc ký, các yêu cầu thường được áp dụng cho tính phù hợp của hệ thống sắc ký. Nguyên lý, thiết bị và phương pháp tách. chuyển R f ), được dùng trong sắc ký trên mặt phẳng (sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy) đó là tỷ số giữa khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến tâm của vết sắc ký và khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến tuyến