THỬ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN THỬ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm, mốc có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm y tế có trong thuốc. Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn. Trong khi làm thí nghiệm, chú ý không đưa chất khử khuẩn vào mẫu thử. Thử nghiệm được áp dụng cho tất cả các dược phẩm gồm cả nguyên liệu và thành phẩm của các thuốc không tiệt khuẩn trong quá trình sản xuất. Thử nghiệm sơ bộ Tìm chất ức chế có trong thuốc: Thử nghiệm giới hạn nhiễm khuẩn sẽ không có giá trị nếu chất ức chế có trong thuốc cản trở đến khả năng phát hiện các vi khuẩn. Vì vậy cần làm thí nghiệm kiểm tra trước bằng cách lấy dung dịch chế phẩm đã được pha ở nồng độ thích hợp vào môi trường chọn lọc cho Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa, rồi cấy vào đó 1ml canh khuẩn 24 h tuổi đã pha loãng với dung dịch đệm phosphat pH 7,2 ít nhất tới 10 -3 các vi khuẩn tương ứng. Nếu vi khuẩn không mọc, thí nghiệm cần thay đổi bằng cách: 1. Giữ nguyên lượng chất mang thử nhưng tăng thể tích môi trường. 2. Cho vào môi trường một lượng vừa đủ chất khử hoạt tính thích hợp. 3. Phối hợp cách làm (1) và (2) để vi khuẩn mang cấy có thể mọc được. Tuỳ theo thành phần và nồng độ của mẫu thử, có thể thêm vào môi trường để trung hoà chất ức chế các loại sau: lecithin đậu tương 0,5 %, polysorbat 20: 4 %. Làm lại thí nghiệm với điều kiện chất ức chế trong lượng mẫu mang kiểm tra đã được trung hoà. Môi trường Môi trường nuôi cấy có thể pha theo cách dưới đây hoặc có thể dùng môi trường khô do các hãng sản xuất môi trường vi sinh vật cung cấp. Các môi trường tự pha chế phải hấp tiệt khuẩn bằng nồi hấp ở nhiệt độ 115 o C trong 30 phút trừ khi có những chỉ dẫn riêng đối với loại môi trường đặc biệt. Thạch dùng cho pha chế môi trường có độ ẩm dưới 15%. Nước và các chất dùng trong các công thức phải tinh khiết. Môi trường lỏng casein lecithin đậu tương polysorbat Casein pancreatic Lecithin đậu tương Polysorbat 20 Nước 20,0 g 5,0 g 40,0 ml 960 ml Hoà tan casein pancreatic và lecithin đậu tương vào 960 ml nước, đun cách thuỷ ở 48 - 50 o C khoảng 30 phút cho tan hoàn toàn. Thêm 40 ml polysorbat 20, trộn đều, phân chia vào các dụng cụ thích hợp. Môi trường thạch casein đậu tương Casein pancreatic Natri clorid 15,0 g 5,0 g Thạch Bột đậu tương thủy phân bởi papain Nước pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 + 0,2 15,0 g 5,0 g 1000 ml Môi trường lỏng casein đậu tương Casein pancreatic Dikali hydrophosphat Bột đậu tương thuỷ phân bởi papain Glucose Natri clorid 17,0 g 2,5 g 3,0 g 2,5 g 5,0 g Nước 1000 ml Hoà tan các chất rắn vào nước đun nóng nhẹ để tan hoàn toàn. Để nguội dung dịch ở nhiệt độ phòng, phân chia vào các bình thích hợp đã tiệt khuẩn. pH sau khi tiệt khuẩn:7,3 + 0,2. Môi trường thạch muối - manitol Casein pancreatic Thạch Pepton Cao thịt Natri clorid D - Manitol Đỏ phenol Nước 5,0 g 15,0 g 5,0 g 1,0 g 75,0 g 10,0 g 0,025 g 1000 ml Trộn, đun nóng, khuấy đều, đun sôi khoảng 1 phút để tan hoàn toàn, pH sau khi tiệt khuẩn : 7,4 + 0,2. Môi trường thạch Baird - Parker Casein pancreatic Cao thịt Cao men bia Lithi clorid Thạch Glycin Natri pyruvat Nước 10,0 g 5,0 g 1,0 g 5,0 g 20,0 g 12,0 g 10,0 g 950 ml Đun nóng, khuấy đều sau đun sôi khoảng 1 phút, tiệt khuẩn, để nguội tới 45 - 50 o C, thêm 10 ml dung dịch kali telurit 1% vô khuẩn và 50 ml nhũ dịch lòng đỏ trứng. Trộn kỹ, nhẹ nhàng rót vào các hộp. Chế tạo nhũ dịch lòng đỏ trứng bằng cách: Sát khuẩn toàn bộ bề mặt quả trứng, đập vỡ vô khuẩn quả trứng, lấy lòng đỏ trứng vào ống trụ chia vạch vô khuẩn. Thêm nước muối vô khuẩn để có tỷ lệ lòng đỏ trứng so với nước muối là 3/7. Bỏ vào một cốc khuấy vô khuẩn, trộn với tốc độ lớn trong 5 phút. pH sau khi tiệt khuẩn 6,8 + 0,2. Môi trường thạch Vogel – Johnson Casein pancreatic Cao men bia Manitol Natri pyruvat Thạch Glycin Lithi clorid Dikali hydrophosphat Đỏ phenol 10,0 g 5,0 g 10,0 g 10,0 g 16,0 g 10,0 g 5,0 g 5,0 g 25,0 mg Nước 1000 ml Đun sôi để hoà tan các chất rắn trong khoảng 1 phút. Tiệt khuẩn, để nguội đến 45 - 50 0 C. Thêm 20 ml dung dịch kali telurit 1% vô khuẩn. pH sau khi tiệt khuẩn 7,2 + 0,2. Môi trường thạch cetrimid Gelatin pancreatic Cetrimid (Cetyl trimethylamoni bromid) Magnesi clorid Thạch Glycerin Nước 20,0 g 0,3 g 1,4 g 13,6 g 10,0 ml 1000 ml Hoà tan tất cả các chất rắn vào trong nước, thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun sôi 1 phút cho tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt khuẩn : 7,2 + 0,2 Môi trường thạch Pseudomonas để phát hiện Fluorescin Casein pancreatic Peton Dikali hydrophosphat khan Magnesi sulfat (MgSO 4 .7H 2 O) Thạch Glycerin Nước 10,0 g 10,0 g 1,5 g 1,5 g 15,0 g 10,0 ml 1000 ml Hoà tan tất cả các chất rắn vào nước trước khi thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun sôi 1 phút cho tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,2 + 0,2. Môi trường thạch Pseudomonas để phát hiện Pyocyanin Gelatin pancreatic Kali sunfat khan 20,0 g 10,0 g [...]... tiệt trùng Chuẩn bị thí nghiệm Lấy mẫu: Đối với các thử nghiệm dưới đây, mỗi thử nghiệm lấy 10ml hoặc 10g chế phẩm Cách thử nghiệm: Một mẫu chế phẩm cần xác định giới hạn vi khuẩn phải thực hiện đầy đủ các thử nghiệm sau: Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được, tính ra số lượng vi khuẩn, nấm mốc có trong 1g hoặc 1ml chế phẩm Thử nghiệm tìm những vi khuẩn gây bệnh sau: Staphylococcus aureus Pseudomonas... có số khuẩn lạc cao nhất ít hơn 100 khuẩn lạc trên màng Tính số khuẩn lạc có trong 1 gam hoặc 1ml mẫu thử Mẫu thử là thuốc dạng miếng đắp thấm qua da: Chuyển vô trùng 10 miếng dán vào bỡnh đó cú sẵn 500 ml dung dịch đệm natri clorid – pepton pH 7,0, Lắc đều trong 30 phút Lọc qua 2 màng lọc để tỡm vi khuẩn và nấm mỗi màng 50ml dung dịch Tiếp tục ủ, theo dừi, đếm vi khuẩn và nấm mốc như ở trên Thử nghiệm... hộp, mang ủ ở 35oC từ 24 - 48 h Sau thời gian ủ, kiểm tra vi khuẩn mọc ở đĩa, đếm số lượng khuẩn lạc Lấy giá trị của đĩa có số lượng khuẩn lạc lớn nhất mà số khuẩn lạc trong đĩa không lớn hơn 300 và tính ra số lượng khuẩn lạc trong 1g hoặc 1ml chế phẩm Nếu thấy không có khuẩn lạc mọc ở đĩa có độ pha loãng 1/10 thì kết luận chế phẩm có ít hơn 10 khuẩn lạc trong 1 g hoặc 1 ml b) Phương pháp pha loãng trong... 1ml mẫu cần thử; nếu lượng vi khuẩn có nhiều trong mẫu thử, có thể lấy lượng dung dịch mẫu ít hơn) Mỗi mẫu thử cần 2 màng lọc, dung dịch mẫu thử đó chuẩn bị phải lọc ngay qua màng Rửa màng lọc 3 lần, mỗi lần khoảng 100ml dung dịch thớch hợp như dung dịch đệm natri clorid – pepton pH 7,0 Khi cần cú thể thờm chất hoạt động bề mặt như polysorbat 80 hoặc cỏc chất khử hoạt tớnh của cỏc chất khỏng khuẩn vào... 10; và 1 mg hoặc l trong mỗi ống Đậy kín các ống mang ủ ở 32 - 35oC trong 24 giờ, quan sát vi khuẩn mọc ở các ống chứa chế phẩm, mang đối chiếu với bảng 1 để biết số lượng vi khuẩn có trong 1 g hoặc 1ml chế phẩm Bảng 1: Tổng số vi khuẩn trong chế phẩm Số mg (hoặc l) chế phẩm cho mỗi ống 100 10 1 Số lượng vi khuẩn lớn nhất có thể có trong 1 g hoặc 1 ml 3 3 3 >1100 3 3 2 1100 3 3 1 500 3 3 0 200 3 2 3... giữ lại các vi khuẩn cần kiểm tra Chọn loại màng lọc làm bằng nguyên liệu giữ lại vi khuẩn nhưng không ảnh hưởng đến mẫu thử Thí dụ có thể dùng màng Cellulose nitrat để lọc các dung dịch nước, dầu và cồn thấp độ Dùng màng cellulose acetat để lọc dung dịch cồn cao độ Dùng hệ thống lọc có thiết kế cho phép chuyển được màng lọc vào môi trường nuôi cấy Chuyển một lượng thích hợp dung dịch mẫu thử đó pha theo... dịch natri hydroxyd 2% Thêm nước cất tới vạch Trộn đều, phân chia vào các bình, tiệt khuẩn, bảo quản ở lạnh Khi dùng, hoà loãng với nước cất theo tỷ lệ 1: 800 và tiệt khuẩn a) Phương pháp đĩa thạch Hoà loãng chế phẩm sao cho khi cấy 1 ml dịch chế phẩm vào môi trường trong một hộp Petri, số khuẩn lạc mọc khoảng 30 đến 300 khuẩn lạc Lấy dung dịch có độ pha loãng cuối cùng cho vào 2 hộp Petri, mỗi hộp 1ml... khuẩn 121oC trong 15 phút Nếu cần điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn khoảng 6,8 Môi trường thạch Columbia Casein pancreatic 10,0 g Thịt 5,0 g Dịch tim pancreatic 3,0 g Cao men bia 5,0 g Tinh bột ngô 1,0 g Natri clorid 5,0 g Thạch bột 15,0 g Nước cất 1000 ml Hoà tan thạch bằng cách đun nóng tới sôi, khuấy đều liên tục Nếu cần điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn khoảng 7,3 + 0,2 Hấp tiệt khuẩn. .. Thạch manitol - muối Baird - Parker trường Vogel Johnson - Đặc Màu đen được Khuẩn điểm bao bọc bằng vàng cùng với một bóng, viền quanh bằng hình thái một vùng vàng vùng khuẩn lạc quanh vàng màu Khuẩn lạc màu đen xung một vùng sáng rõ 2 - 5 mm lạc *Phản ứng oxydase và sinh sắc tố ( đối với Pseudomonas aeruginosa): Lấy những khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng từ mặt môi trường thạch cetrimid cấy ria trên mặt... hiện Pyocyanin trong hộp Petri Nếu nhiều khuẩn lạc cần được cấy truyền, có thể chia bề mặt hộp thành bốn phần, mỗi phần cấy một loại khuẩn lạc lựa chọn Đậy và lật ngược hộp môi trường đã cấy truyền và ủ ở 35 + 2oC ít nhất 3 ngày kiểm tra đường cấy dưới ánh sáng đèn tử ngoại Kiểm tra các đĩa để xác định có khuẩn lạc đặc trưng theo bảng 3 hay không Xác nhận bất kỳ khuẩn lạc nghi ngờ nào mọc trên một hoặc . THỬ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN THỬ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm, mốc có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn. sản xuất. Thử nghiệm sơ bộ Tìm chất ức chế có trong thuốc: Thử nghiệm giới hạn nhiễm khuẩn sẽ không có giá trị nếu chất ức chế có trong thuốc cản trở đến khả năng phát hiện các vi khuẩn. Vì. vô khuẩn. Trong khi làm thí nghiệm, chú ý không đưa chất khử khuẩn vào mẫu thử. Thử nghiệm được áp dụng cho tất cả các dược phẩm gồm cả nguyên liệu và thành phẩm của các thuốc không tiệt khuẩn