1 SPIRAMYCIN Spiramicinum Thành phần R Công thức phân tử Phân tử lượng Spiramycin I H C 43 H 74 N 2 O 14 843,1 Spiramycin II COCH 3 C 45 H 76 N 2 O 15 885,1 2 Spiramycin III CO-CH 2 - CH 3 C 46 H 78 N 2 O 15 899,1 Spiramycin là một kháng sinh nhóm macrolid được tạo ra khi nuôi cấy các chủng vi khuẩn Streptomyces ambofaciens hoặc thu được bằng các phương pháp khác. Thành phần chính là (4R,5S,6S,7R,9R,10R,11E,13E,16R)-6-[[3,6-dideoxy-4-O- (2,6-dideoxy-3-C-methyl--L-ribo-hexopyranosyl)-3-(dimethylamino)--D- glucopyranosyl]oxy]-4-hydroxy-5-methoxy-9,16-dimethyl-7-(2-oxoethyl)-10- [[2,3,4,6-tetradeoxy-4-(dimethylamino)-D-erythro- hexopyranosyl]oxy]oxacyclohexadeca-11,13-dien-2-on (spiramycin I, p.t.l: 843). Ngoài ra còn có spiramycin II (4-O-acetylspiramycin I) và spiramycin III (4-O- propanoylspiramycin I). Hoạt lực không ít hơn 4100 IU trong 1 mg, tính theo chế phẩm đã làm khô. Tính chất Bột màu trắng hoặc hơi ngà vàng, hút ẩm nhẹ. Khó tan trong nước, dễ tan trong aceton, trong ethanol 96% và trong methanol. Định tính 3 A. Hòa tan 0,10 g chế phẩm trong methanol (TT) và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi. Pha loãng tiếp 1,0 ml dung dịch này thành 100,0 ml bằng methanol (TT). Phổ hấp thụ tử ngoại (Phụ lục 4.1) của dung dịch thu được trong khoảng từ 220 - 350 nm có một cực đại ở 232 nm. Độ hấp thụ riêng ở cực đại này là khoảng 340. B. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4). Bản mỏng: Silica gel G (TT). Dung môi khai triển: Isopropanol - dung dịch amoni acetat 15% đã điều chỉnh đến pH 9,6 bằng dung dịch natri hydroxyd 40% - ethyl acetat (4 : 8 : 9). Trộn đều, để yên cho tách lớp và sử dụng lớp trên. Dung dịch thử: Hòa tan 40 mg chế phẩm trong methanol (TT) và pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 40 mg spiramycin chuẩn (ĐC) trong methanol (TT) và pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan 40 mg erythromycin A chuẩn (ĐC) trong methanol (TT) và pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 l mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 15 cm. Lấy bản mỏng ra để bay hơi hết dung môi 4 ngoài không khí. Phun dung dịch anisaldehyd trong ethanol (TT) và sấy bản mỏng ở 110 ºC trong 5 phút. Vết chính trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch thử phải tương ứng về vị trí, màu sắc và kích thước với vết chính trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch đối chiếu (1). Nếu trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch thử xuất hiện một hoặc hai vết khác có giá trị R f hơi cao hơn giá trị R f của vết chính, những vết này phải tương ứng về vị trí và màu sắc với các vết phụ trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch đối chiếu (1) và khác biệt với các vết trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch đối chiếu (2). C. Hòa tan 0,5 g chế phẩm trong 10 ml dung dịch acid sulfuric 0,05 M (TT) và thêm 25 ml nước. Điều chỉnh dung dịch đến pH 8 bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT) và pha loãng thành 50 ml bằng nước. Thêm vào 5 ml dung dịch thu được 2 ml hỗn hợp gồm 1 thể tích nước và 2 thể tích acid sulfuric (TT), màu nâu xuất hiện. pH Hoà tan 0,5 g chế phẩm trong 5 ml methanol (TT) và pha loãng thành 100 ml với nước không có carbon dioxyd (TT). pH của dung dịch thu được (Phụ lục 6.2) từ 8,5 - 10,5. Góc quay cực riêng Từ -80 o đến -85 o , tính theo chế phẩm đã làm khô (Phụ lục 6.4). 5 Hòa tan 1,00 g chế phẩm trong dung dịch acid acetic 0,2 M (TT) và pha loãng với cùng dung môi thành 50,0 ml để thử. Thành phần Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Không ít hơn 80,0% spiramycin I, không quá 5,0% spiramycin II và không quá 10,0% spiramycin III; tổng hàm lượng spiramycin I, spiramycin II và spiramycin III không ít hơn 90,0%, các hàm lượng này đều tính theo chế phẩm đã làm khô. Pha động, các dung dịch sắc ký và điều kiện sắc ký theo quy định trong phần tạp chất liên quan. Tiêm dung dịch thử và dung dịch đối chiếu (1). Tính toán hàm lượng phần trăm các thành phần dựa trên hàm lượng các thành phần spiramycin I, spiramycin II và spiramycin III của chuẩn. Tạp chất liên quan Xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Chuẩn bị các dung dịch sắc ký ngay trước khi sử dụng. Pha động: Acetonitril - dung dịch đệm pH 2,2 có chứa natri perclorat 0,93% (30 : 70). Dung môi hòa mẫu: Hỗn hợp acetonitril - nước (3 : 7). 6 Dung dịch thử: Hòa tan 25,0 mg chế phẩm trong dung môi hòa mẫu và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 25,0 mg spiramycin chuẩn (ĐC) trong dung môi hòa mẫu và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 2,0 ml dung dịch đối chiếu (1) thành 100,0 ml bằng dung môi hoà mẫu. Dung dịch đối chiếu (3): Pha loãng 5,0 ml dung dịch đối chiếu (1) thành 100,0 ml bằng dung môi hoà mẫu. Dung dịch đối chiếu (4): Hòa tan 5 mg spiramycin chuẩn (ĐC) trong 25 ml pha động, sau đó đốt nóng trong cách thuỷ ở 60 o C trong 30 phút. Điều kiện sắc ký: Cột thép không gỉ (25 cm  4,6 mm) được nhồi pha tĩnh B (5 m), diện tích bề mặt riêng 350 m 2 /g và khoảng cách giữa các hạt là 0,01 m. Detector quang phổ tử ngoại ở bước sóng 232 nm. Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. Thể tích tiêm: 20 l. Cách tiến hành: 7 Tiêm dung dịch đối chiếu (2). Điều chỉnh độ nhạy của hệ thống sao cho chiều cao của pic chính trong sắc ký đồ ít nhất bằng 50% thang đo. Tiêm dung dịch đối chiếu (3) và dung dịch đối chiếu (4). Phép thử chỉ có giá trị khi trên sắc ký đồ thu được của dung dịch đối chiếu (3) không có pic nào có thời gian lưu tương đối so với pic spiramycin I là khoảng 1,1 và trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (4), độ phân giải giữa pic tạp chất A (neospiramycin I) (được rửa giải lần đầu) và spiramycin I (rửa giải trong khoảng 13 đến 17 phút) ít nhất là 6,3. Nếu cần thiết, điều chỉnh nồng độ acetonitril trong pha động (tăng nồng độ này để giảm thời gian lưu hoặc giảm nồng độ này để tăng thời gian lưu). Tiêm dung dịch thử và dung dịch đối chiếu (2). Ghi lại sắc ký đồ của dung dịch thử trong một khoảng thời gian gấp 3 lần thời gian lưu của spiramycin I. Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử: Diện tích của bất kỳ pic nào ngoài các pic của spiramycin I, II, III, không được lớn hơn diện tích của pic chính trên sắc ký đồ thu được của dung dịch đối chiếu (2) (2%). Bỏ qua các pic có diện tích nhỏ hơn 0,05 lần diện tích pic chính trong sắc ký đồ thu được của dung dịch đối chiếu (2). 8 H×nh 1: S¾c ký ®å cña spiramycin Kim loại nặng Không được quá 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Lấy 1,0 g chế phẩm thử theo phương pháp 6. Dùng 2 ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Mất khối lượng do làm khô Không được quá 3,5% (Phụ lục 9.6). (0,500 g; 80 o C; áp suất không quá 670 Pa; phosphor pentoxyd; 6 giờ). Tro sulfat Không được quá 0,1% (Phụ lục 9.8, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Tiến hành theo “Xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp thử vi sinh vật” (Phụ lục 13.9). Dùng phương pháp khuyếch tán; chủng chỉ thị: Bacillus subtilis ATCC 6633; dung môi: methanol (TT); chất hoà loãng: dung dịch đệm số 2; môi 9 trường: môi trường số 1 được điều chỉnh đến pH 8,0  0,1; khoảng nồng độ của dung dịch đem thử: 40 -160 IU/ml; nhiệt độ ủ: 32 - 35 o C. Bảo quản Trong đồ đựng kín. Loại thuốc Thuốc kháng khuẩn. Chế phẩm Viên nén. . (Phụ lục 5.3). Không ít hơn 80,0% spiramycin I, không quá 5,0% spiramycin II và không quá 10,0% spiramycin III; tổng hàm lượng spiramycin I, spiramycin II và spiramycin III không ít hơn 90,0%,. (4R,5S,6S,7R,9R,10R,11E,13E,16R)-6-[[3,6-dideoxy-4-O- (2,6-dideoxy-3-C-methyl--L-ribo-hexopyranosyl)-3-(dimethylamino)--D- glucopyranosyl]oxy]-4-hydroxy-5-methoxy-9,16-dimethyl-7-(2-oxoethyl)-10- [[2,3,4,6-tetradeoxy-4-(dimethylamino)-D-erythro- hexopyranosyl]oxy]oxacyclohexadeca-11,13-dien-2-on (spiramycin I, p.t.l: 843). Ngoài ra còn có spiramycin II (4-O-acetylspiramycin I) và spiramycin III (4-O- propanoylspiramycin I). Hoạt lực không ít hơn 4100. 1 SPIRAMYCIN Spiramicinum Thành phần R Công thức phân tử Phân tử lượng Spiramycin I H C 43 H 74 N 2 O 14 843,1 Spiramycin II COCH 3 C 45 H 76 N 2 O 15 885,1 2 Spiramycin